竇海艷 秦立鑫 張智明 楊朋欣 李鑫 丁國杰/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司

黑龍江省部分地區(qū)PEDV和TGEV流行病學(xué)調(diào)查

竇海艷 秦立鑫 張智明 楊朋欣 李鑫 丁國杰/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司

自2010年冬季開始，我國大部分省份的豬群出現(xiàn)了嚴(yán)重的仔豬腹瀉疫情，臨床癥狀主要表現(xiàn)為豬水樣腹瀉、嘔吐和脫水等癥狀，其發(fā)病率與死亡率均很高，1周內(nèi)的仔豬一旦發(fā)病，死亡率往往可達(dá)80%～100%，即使康復(fù)也生長緩慢，致使飼料報(bào)酬降低。截止到目前，仍有一部分規(guī)?；B(yǎng)殖戶未能得到有效控制，給我國養(yǎng)豬業(yè)，尤其是規(guī)?；B(yǎng)豬場造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。許多的學(xué)者研究表明，此次疫情主要是由以豬流行性腹瀉病毒為主要病原引起的豬病毒性腹瀉病。為進(jìn)一步研究黑龍江省豬病毒性腹瀉病原的流行現(xiàn)狀，本研究對2015年1月至2015年12月采集于黑龍江省部分縣市具有明顯腹瀉癥狀的發(fā)病豬的67份糞便樣品進(jìn)行了PEDV和TGEV的生物學(xué)檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行了單獨(dú)感染情況和混合感染情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析，旨在為黑龍江省豬病毒性腹瀉的診斷和防控提供參考資料。

一、材料和方法

（一）材料

1. 樣品。2015年1月至2015年12月，采集黑龍江省哈爾濱周邊養(yǎng)豬場、肇東縣、綏化地區(qū)、牡丹江市具有明顯腹瀉癥狀發(fā)病豬的糞便樣品，共計(jì)67份，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 參考病毒。豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒均由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室保存。

3. 主要試劑。病毒基因組DNA/RNA核酸提取試劑盒，北京博邁德生物科技有限公司產(chǎn)品；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、rTaq酶、dNTP、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000，寶生物（大連）有限公司產(chǎn)品。

（二）方法

1. 引物的設(shè)計(jì)與合成。按參考文獻(xiàn)的引物序列進(jìn)行合成，由生工（上海）生物科技有限公司完成，見表1。

表1 引物序列

2. 樣品的處理及核酸提取。將采集的糞便樣品與滅菌PBS以1∶5的比例（質(zhì)量體積比）混合，反復(fù)凍融3次后，以10 000 r/m離心10 min后，取上清200 ul，按照病毒基因組DNA/RNA核酸提取試劑盒說明書提取RNA。

3. 反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增。按參考文獻(xiàn)建立的方法進(jìn)行。

4. 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。取RT-PCR產(chǎn)物6 uL與1 uL上樣緩沖液混勻，于1% 瓊脂糖凝膠中電泳后，凝膠成像系統(tǒng)掃描鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。

5. 結(jié)果判定與分析。根據(jù)檢測結(jié)果，分別統(tǒng)計(jì)所采集樣品中PEDV和TGEV的陽性數(shù)，并分別對PEDV和TGEV感染的陽性率、單獨(dú)感染陽性率和混合感染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

二、結(jié)果

1. 樣品PEDV和TGEV的RT-PCR檢測結(jié)果。應(yīng)用RT-PCR方法對采集于黑龍江省部分縣市具有明顯腹瀉癥狀的發(fā)病豬的67份糞便樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示，PEDV陽性樣品49份，陽性率為73.2%，TGEV陽性樣品19份，陽性率為 28.4%，以上2種病原均為陰性的樣品10份，占樣品總數(shù)的14.9%。以上結(jié)果表明，黑龍江省部分地區(qū)存在導(dǎo)致豬病毒性腹瀉的PEDV和TGEV這兩種抗原的流行，且以PEDV的感染更為突出。

表2 樣品PEDV和TGEV的RT-PCR檢測結(jié)果

2. 樣品的單獨(dú)感染及混合感染統(tǒng)計(jì)結(jié)果。按照檢驗(yàn)結(jié)果對所采集的所有67份樣品中PEDV和TGEV的單獨(dú)感染和混合感染進(jìn)行分別統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示，PEDV單獨(dú)感染38份，單獨(dú)感染率為56.7%；TGEV單獨(dú)感染8份，單獨(dú)感染率為11.9%；PEDV/TGEV混合感染11份，混合感染率為16.5%。

表3 PEDV和TGEV單獨(dú)和混合感染率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

三、討論

由傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的豬傳染性胃腸炎(TGE)和由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的豬流行性腹瀉(PED)，其臨床表現(xiàn)、病理變化、流行病學(xué)等方面都極為相似，在臨床和組織病理學(xué)上均難以區(qū)分，因此為確定是由哪種病原引發(fā)的豬腹瀉，我國學(xué)者建立了國內(nèi)檢測區(qū)分TGEV和PEDV的多重RT-PCR的方法，可同時(shí)確診是TGEV或PEDV或兩者同時(shí)感染，從而達(dá)到診斷和鑒別的雙重目的。本研究利用該方法對黑龍江省部分縣市具有明顯腹瀉癥狀的發(fā)病豬的67份糞便樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明所采集樣品主要以PEDV感染為主，TGEV感染較低，與我國目前兩種病原的流行情況一致。同時(shí)從表2可以看出，兩種病原的檢出率在城市交通發(fā)達(dá)、人口密集的地區(qū)要高于交通欠發(fā)達(dá)、人口稀少的地區(qū)，由此推斷現(xiàn)代交通和人口流動對這兩種病原的擴(kuò)散有著一定的推動作用。

本研究對樣品PEDV和TGEV的單獨(dú)感染情況及混合感染情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。由表3的結(jié)果可以看出，在黑龍江省部分地區(qū)病毒性腹瀉發(fā)生流行時(shí)，在以PEDV流行為主的同時(shí)，往往會存在PEDV和TGEV的混合感染，這就要求基層獸醫(yī)工作者在疫病的防控工作中還應(yīng)考慮是否存在混合感染情況，做到準(zhǔn)確判定豬病毒性腹瀉的致病原，加強(qiáng)混合感染的綜合防控。同時(shí)，本研究的結(jié)果還為黑龍江省豬病毒性腹瀉的診斷和防控提供參考資料。

（略）