張德強(qiáng)，關(guān)曉燕

( 1.大連海洋學(xué)校，遼寧 大連 116023； 2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023 )

枯草芽孢桿菌B2的生長(zhǎng)及其對(duì)仿刺參的益生特性

張德強(qiáng)1，關(guān)曉燕2

( 1.大連海洋學(xué)校，遼寧 大連 116023； 2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023 )

從大連灣地區(qū)健康的仿刺參養(yǎng)殖池塘沉積物中分離得到一株芽孢桿菌菌株B2，經(jīng)16S rDNA鑒定以及形態(tài)學(xué)分析確定其為枯草芽孢桿菌。該菌株生長(zhǎng)適宜溫度為15～35 ℃，適宜pH為6～8，適宜鹽度為30～50。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌B2周圍有明顯可見(jiàn)的芽孢?？莶菅挎邨U菌B2可產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶，但不具有產(chǎn)脂肪酶的能力。將枯草芽孢桿菌B2按照仿刺參體質(zhì)量的0.1%、0.2%和0.3%配成不同密度的菌液，添加至飼料中，投喂7 d后發(fā)現(xiàn)，該菌株可有效提高仿刺參腸道內(nèi)的消化酶以及體腔液中多種非特異性免疫酶的活性。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌B2可作為益生菌劑的基礎(chǔ)菌株添加至仿刺參飼料中。

枯草芽孢桿菌；仿刺參；消化酶；非特異性免疫酶

益生菌又稱益生元或益菌素，是一種活的微生物添加劑，通過(guò)維持腸道內(nèi)微生態(tài)平衡而有效影響宿主動(dòng)物[1]。益生菌無(wú)毒副作用，無(wú)殘留，安全性好，現(xiàn)今常作為一種較好的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，添加至動(dòng)物飼料中，為養(yǎng)殖動(dòng)物帶來(lái)有益的影響，如促進(jìn)生長(zhǎng)、防治疾病等[2-3]。目前應(yīng)用于水產(chǎn)業(yè)中的益生菌主要有酵母菌、芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸桿菌(Lactobacillus)及光合細(xì)菌等，其中芽孢桿菌屬中的一些菌種抗逆性強(qiáng)、易儲(chǔ)存等，日漸引起廣泛的關(guān)注。

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)是芽孢桿菌屬中重要的一類，是我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的可直接使用的益生菌劑之一，具有廣譜的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆性。沈文英等[4]將枯草芽孢桿菌表達(dá)的病毒囊膜蛋白VP28添加至飼料中投喂凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)，顯著提高了對(duì)蝦肝胰臟中的免疫因子和非特異性免疫力，增強(qiáng)其對(duì)白斑綜合癥病毒的抗性。Aly等[5]將1×107cfu/g的枯草芽孢桿菌添加至尼羅羅非魚(Oreochriomisniloticus)飼料中投喂1～2個(gè)月后，魚體質(zhì)量增加均高于對(duì)照組?？梢?jiàn)，枯草芽孢桿菌可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治疾病，增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力。然而，目前關(guān)于該菌在仿刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用報(bào)道較少，亟待深入研究。筆者從大連灣地區(qū)健康仿刺參(Apostichopusjaponicus)養(yǎng)殖池塘底泥中分離并鑒定了一株枯草芽孢桿菌B2，研究了其生長(zhǎng)特性及對(duì)仿刺參消化酶和非特異性免疫酶活性的影響，探討了枯草芽孢桿菌B2在仿刺參養(yǎng)殖過(guò)程中的益生作用，為枯草芽孢桿菌的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：分離自大連灣地區(qū)健康仿刺參養(yǎng)殖池塘沉積物。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)2216E固體及液體培養(yǎng)基：購(gòu)自于青島海博生物科技有限公司。

(2)淀粉瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 mg/L，NaCl 10 mg/L，酵母粉5 mg/L，淀粉5 mg/L，瓊脂15 mg/L，1000 mL蒸餾水，于121 ℃滅菌20 min后，均勻倒入平板中備用。

(3)脫脂牛奶培養(yǎng)基：蛋白胨10 mg/L，NaCl 10 mg/L，酵母粉5 mg/L，脫脂奶粉 5 mg/L，瓊脂15 mg/L，1000 mL蒸餾水，于121 ℃滅菌20 min后，均勻倒入平板中備用。

(4)羅丹明B橄欖油瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 mg/L，NaCl 10 mg/L, 酵母粉5 mg/L，瓊脂15 mg/L，1000 mL蒸餾水，121 ℃滅菌20 min后，向培養(yǎng)基中加入10 mL羅丹明B溶液(1 mg/mL) 和31.25 mL橄欖油，經(jīng)磁力攪拌器劇烈攪拌后，靜置幾分鐘倒板。

1.1.3 儀器

高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)搖床，分光光度計(jì)，酶標(biāo)儀，熒光顯微鏡，PCR儀，電泳儀，生物電泳圖像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生長(zhǎng)特性分析

挑取分離得到的B2菌株于平板上劃線，27 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，置于掃描電鏡下觀察菌落形態(tài)特征。

1.2.2 菌株的16S rDNA鑒定

以菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以通用引物27F和1492R為反應(yīng)引物。采用25 μL反應(yīng)體系：2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL dNTPs，2 μL MgCl2(25 mmol/L)，上、下游引物 (10 mmol/L)各1 μL，1.25 U Taq 酶，2 μL DNA 模板，14.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，預(yù)變性4 min；94 ℃，變性30 s，56 ℃，退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，送至上海生工生物科技有限公司測(cè)序。利用Blastn程序與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的DNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.3 溫度、pH、鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將菌株B2進(jìn)一步活化后，按照5%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL的2216E液體培養(yǎng)基中，于不同的溫度、鹽度和pH條件下震蕩培養(yǎng)，測(cè)定菌液在660 nm處的吸光值，分析菌株B2的生長(zhǎng)特性。其中溫度設(shè)定為15、20、25、30 ℃和35 ℃；鹽度設(shè)定為30、50、75、100和125；pH設(shè)定為6、6.5、7、8、9。用NaOH溶液(1 mol/L)和HCl溶液(1 mol/L)調(diào)節(jié)2216E液體培養(yǎng)基的pH。

1.2.4 菌株的產(chǎn)酶特性分析

挑取菌株B2接種于淀粉瓊脂培養(yǎng)基上，27 ℃恒溫環(huán)境培養(yǎng)48 h后，向培養(yǎng)基中加入盧革氏碘液，根據(jù)菌株周圍是否變色，判斷菌株能否產(chǎn)淀粉酶，試驗(yàn)重復(fù)3次。

挑取菌株B2接種于脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基上，27 ℃恒溫環(huán)境培養(yǎng)48 h后，根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明水圈，判斷菌株能否產(chǎn)蛋白酶，試驗(yàn)重復(fù)3次。

挑取菌株B2接種于羅丹明B橄欖油瓊脂培養(yǎng)基上，27 ℃恒溫環(huán)境培養(yǎng)48 h后，在紫外線照射下觀察菌落周圍是否出現(xiàn)橙色熒光圈，判斷菌株能否產(chǎn)脂肪酶，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 菌株對(duì)仿刺參體腔非特異性免疫酶和腸道消化酶的影響

試驗(yàn)用仿刺參源自大連灣健康的仿刺參養(yǎng)殖池塘。選取規(guī)格[體質(zhì)量(12±0.19) g]相近、生長(zhǎng)狀況相似的健康仿刺參40頭，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d后，飼養(yǎng)于裝有5 L水的水箱中，每箱5頭。試驗(yàn)組：將菌株B2配成干質(zhì)量為0.06 g、0.12 g和0.18 g的3種含量的菌液，即分別為仿刺參體質(zhì)量的0.1%、0.2%和0.3%，添加至仿刺參飼料中并投喂，對(duì)照組投喂不添加菌株B2的飼料。投喂7 d后，自試驗(yàn)組和對(duì)照組中隨機(jī)取出5頭刺參，充分消毒后，解剖并取其體腔液上清液和腸道，立即置于冰箱中-80 ℃冷凍保藏待測(cè)。試驗(yàn)采用仿刺參配合餌料，主要成分為海泥、海藻粉及魚粉等。

采用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測(cè)仿刺參體腔液中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、總超氧化物歧化酶，以及淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活性。酚氧化酶采用多巴絡(luò)合物生成法檢測(cè)[6]。

2 結(jié) 果

2.1 菌株B2的鑒定及生長(zhǎng)特性

菌株B2的菌落白色，為圓形且隆起，菌落表面光滑；掃描電鏡下，菌株B2呈短桿狀，且周圍有明顯可見(jiàn)芽孢(圖1)。將菌株B2的16S rDNA序列通過(guò) Blastn軟件與 GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，菌株B2與枯草芽孢桿菌菌株C6-1的同源性高達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)特征分析，初步鑒定菌株B2為枯草芽孢桿菌。

圖1 菌落B2的形態(tài)特征a. 平板上菌落形態(tài)；b. 掃描電鏡下菌落形態(tài).

枯草芽孢桿菌B2的生長(zhǎng)隨溫度、鹽度、pH變化見(jiàn)圖2。由圖2a可見(jiàn)，枯草芽孢桿菌B2生長(zhǎng)的溫度范圍較寬，15～35 ℃均可生長(zhǎng)，在15 ℃下，穩(wěn)定期的生長(zhǎng)量明顯低于20～35 ℃，其最適生長(zhǎng)溫度為20～35 ℃；圖2b表明，枯草芽孢桿菌B2在pH為6.0～8.0時(shí)生長(zhǎng)較快，在pH為9時(shí)生長(zhǎng)緩慢且延滯期延長(zhǎng)，24 h才進(jìn)入生長(zhǎng)指數(shù)期，其最適生長(zhǎng)pH為6.0～8.0。由圖2c可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽度為30～50時(shí)，枯草芽孢桿菌B2生長(zhǎng)較好，12 h內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期，其最適生長(zhǎng)鹽度為30～50。

圖2 枯草芽孢桿菌B2在不同溫度、pH和鹽度下的生長(zhǎng)

2.2 枯草芽孢桿菌B2的產(chǎn)酶特性

枯草芽孢桿菌B2在脫脂奶粉培養(yǎng)基中可產(chǎn)生透明水圈，說(shuō)明枯草芽孢桿菌B2可產(chǎn)生蛋白酶(圖3a)；在培養(yǎng)枯草芽孢桿菌B2的淀粉培養(yǎng)基上滴加碘液后，菌株周圍區(qū)域變?yōu)樗{(lán)色(圖3b)，說(shuō)明枯草芽孢桿菌B2可產(chǎn)生淀粉酶。枯草芽孢桿菌B2在羅丹明B橄欖油瓊脂培養(yǎng)基中未產(chǎn)生橙色水圈，初步判斷枯草芽孢桿菌B2不產(chǎn)脂肪酶。

圖3 枯草芽孢桿菌B2的產(chǎn)酶特性a.枯草芽孢桿菌B2產(chǎn)蛋白酶結(jié)果；b. 枯草芽孢桿菌B2產(chǎn)淀粉酶結(jié)果.

2.3 枯草芽孢桿菌B2對(duì)仿刺參腸道消化酶活性的影響

枯草芽孢桿菌B2對(duì)仿刺參腸道中的淀粉酶和脂肪酶活性具有一定的刺激作用(圖4)。當(dāng)枯草芽孢桿菌B2的添加量為仿刺參體質(zhì)量的0.2%時(shí)，試驗(yàn)組仿刺參腸道淀粉酶和蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而當(dāng)添加量為0.3%時(shí)，枯草芽孢桿菌B2對(duì)仿刺參體內(nèi)兩種酶的刺激效果下降，但仍然高于對(duì)照組。在3種添加劑量下，枯草芽孢桿菌B2對(duì)仿刺參體內(nèi)脂肪酶無(wú)明顯的刺激作用(圖4c)，處理樣品中該酶的活性略高于對(duì)照組。由此可見(jiàn)，枯草芽孢桿菌B2對(duì)仿刺參腸道消化酶的影響與其自身產(chǎn)酶特性基本一致，適量投喂可有效提高仿刺參體內(nèi)消化酶的活性。

圖4 枯草芽孢桿菌B2對(duì)仿刺參體內(nèi)消化酶活性的影響

2.4 枯草芽孢桿菌B2對(duì)仿刺參非特異性免疫酶活性的影響

枯草芽孢桿菌B2明顯刺激仿刺參體腔液中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、總超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活性(圖5)。與對(duì)照組相比，添加0.1%和0.2%的枯草芽孢桿菌B2后，試驗(yàn)組仿刺參體腔液酸性磷酸酶活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，而堿性磷酸酶、總超氧化物歧化酶和酚氧化酶活性卻顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。添加0.3%的枯草芽孢桿菌B2后，可有效提高仿刺參體內(nèi)酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和酚氧化酶的活性，然而對(duì)于總超氧化物歧化酶活性的影響卻隨著添加量的增加而下降，但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。由此可見(jiàn)，適量投喂枯草芽孢桿菌B2可提高仿刺參體內(nèi)非特異性免疫酶的活性。

圖5 枯草芽孢桿菌B2對(duì)仿刺參體內(nèi)免疫酶活性的影響

3 討 論

枯草芽孢桿菌是一種在養(yǎng)殖水體中普遍存在的益生菌，適應(yīng)性強(qiáng)，能在動(dòng)物腸道中穩(wěn)定定殖，還具有凈化水質(zhì)，分泌消化酶促進(jìn)消化，提高動(dòng)物機(jī)體免疫力等益生作用[7-8]。從大連灣地區(qū)的健康養(yǎng)殖池塘中分離得到的枯草芽孢桿菌B2可在15～35 ℃生長(zhǎng)，適宜pH為6.0～8.0，適宜鹽度為30～50，具有芽孢桿菌的一般特征，電鏡觀察菌株周圍見(jiàn)明顯芽孢，具有一定的抗逆性，可以作為仿刺參養(yǎng)殖中的益生菌。

枯草芽孢桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生許多活性物質(zhì)和大量的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等[9]。這些活性酶能有效將飼料殘餌中的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)分解，提高飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的消化利用率，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[10-11]。本研究中的枯草芽孢桿菌B2可分泌淀粉酶和蛋白酶，未檢測(cè)到脂肪酶。

枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的胞外酶可有效刺激動(dòng)物體內(nèi)多種消化酶的活性，補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足。本研究給仿刺參投喂適量的枯草芽孢桿菌B2后，可有效提高其腸道內(nèi)的蛋白酶和淀粉酶活性，但對(duì)腸道脂肪酶的活性影響不顯著，這與董春光等[12]的結(jié)果相似。結(jié)合枯草芽孢桿菌B2的產(chǎn)酶情況初步推測(cè)，其分泌的消化酶種類對(duì)仿刺參腸道消化酶活性的影響具有一定的選擇性。沈斌乾等[13]研究表明，當(dāng)青魚(Mylopharyngodonpiceus)攝食添加枯草芽孢桿菌的飼料后，腸淀粉酶活性顯著高于對(duì)照組，且隨著添加量的增大而不斷上升。劉曉勇等[14]在雜交鱘(Acipenserbaeri♂×A.schrenkii♀)幼魚的日糧中添加了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的枯草芽孢桿菌，當(dāng)添加量為0.25%時(shí)，投喂15 d后，除可有效提高魚體腸道內(nèi)蛋白酶、淀粉酶和消化酶的活性外，還可正向刺激一些免疫酶如堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶，以上均與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

仿刺參體腔細(xì)胞分泌的非特異性免疫酶活性的高低直接影響仿刺參對(duì)病原菌及有害物質(zhì)的抵抗力[15]。研究表明，在養(yǎng)殖水體或飼料中添加枯草芽孢桿菌可以刺激水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫酶活性[14]。本研究用適量的枯草芽孢桿菌B2投喂仿刺參后，有效提高了仿刺參體腔液中的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活性，尤其是酸性磷酸酶。綜上所述，枯草芽孢桿菌B2作為一種常用的益生菌劑，可以產(chǎn)生正向的免疫功能刺激作用，可作為仿刺參的飼料添加劑。

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GrowthandProbioticCharacteristicsofBacillussubtilisB2inSeaCucumberApostichopusjaponicus

ZHANG Deqiang1, GUAN Xiaoyan2

( 1.Dalian Ocean School, Dalian 116023, China；2.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China )

A bacterial strain B2 isolated from sediment in healthy sea cucumberApostichopusjaponicusfarm in Dalian was identified asBacillussubtilisby morphological and 16S rDNA sequence analysis. It was found that the optimal growth of strain B2 was observed at temperature of 15—35 ℃, pH of 6—8 and a salinity of 30—50. The electron microscopy revealed that there was visible gemma around strain B2 obviously. The strain B2 produced both amylase and protease, but did not secreate lipase. The different doses of the strain B2 was added into the diets according to the weight of sea cucumber by 0.1%, 0.2% and 0.3%, and it was found that the strain B2 effectively improved the activities of digestive enzymes in the intestine and nonspecific immune enzymes in the coelomic fluids. The findings indicate thatB.subtilisB2 can be used as basis strain of probiotics and added into the sea cucumber feed, which can provide more resources for the further sea cucumber probiotics.

Bacillussubtilis; sea cucumber; digestive enzyme; nonspecific immune enzyme

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.007

S917

A

1003-1111(2016)03-0234-05

2015-11-08；

2016-01-26.

國(guó)家海洋局海洋公益項(xiàng)目(201305001)；遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015103044)；遼寧省漁業(yè)科技項(xiàng)目(201301).

張德強(qiáng)(1957-)，男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師；研究方向：海洋漁業(yè)職業(yè)教育.E-mail：ZDQ761@126.com. 通訊作者：關(guān)曉燕(1983-)，女，助理研究員；研究方向：海洋微生物.E-mail:guanxiaoyan201@163.com.