劉 青，趙銘武，曹鑫磊，劉新政

( 1.山西農(nóng)業(yè)大學，山西 太谷 030801； 2.太原市魚種場，山西 太原 030025 )

血鸚鵡魚木糖葡萄球菌的分離鑒定和耐藥性研究

劉 青1，趙銘武2，曹鑫磊2，劉新政2

( 1.山西農(nóng)業(yè)大學，山西 太谷 030801； 2.太原市魚種場，山西 太原 030025 )

自患病血鸚鵡魚腎臟分離獲得優(yōu)勢菌CVSX1,做分離純化培養(yǎng)、生化與分子鑒定、人工感染試驗和藥敏試驗，以期對該病有效預防和治療。分離菌株血液培養(yǎng)菌落呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，顏色灰白色至略黃，周圍有弱溶血環(huán)。經(jīng)過涂片染色鏡檢，該菌株革蘭氏染色為陽性圓形球菌，直徑約為0.8～1.0 μm，多數(shù)成堆，少數(shù)散在、成對或四聯(lián)狀排列。該菌株無莢膜或鞭毛，亦無芽孢，根據(jù)形態(tài)和生理、生化性狀可初步鑒定為木糖葡萄球菌。菌株的16S rDNA序列比對表明,菌株CVSX1與已登錄GenBank數(shù)據(jù)庫的木糖葡萄球菌16S rDNA序列的相似性>99%，聚類分析結果表明菌株CVSX1與葡萄球菌屬的木糖葡萄球菌遺傳距離最小。通過人工感染試驗證明木糖葡萄球菌CVSX1對血鸚鵡幼魚有較強的致病性。應用臨床常用的抗生素對木糖葡萄球菌CVSX1進行藥敏檢測，菌體CVSX1對磺胺嘧啶、青霉素G、諾氟沙星、四環(huán)素高度耐藥，對紅霉素、丁胺卡那敏感，對環(huán)丙沙星、氧氟沙星表現(xiàn)為中介。

血鸚鵡魚；木糖葡萄球菌；16S rDNA；分離鑒定；耐藥性

血鸚鵡魚(Cichlasomavar.)又名紅財神、發(fā)財魚等，是由紅魔鬼(C.citrinellum♂) 和紫紅火口(C.synspilum♀) 雜交所得的熱帶觀賞魚[1-3]。該魚形態(tài)可愛，通體紅色、寓意吉祥，在市場上深受歡迎，然而在養(yǎng)殖過程中易發(fā)病，輕則易失去觀賞價值，重則死亡，給養(yǎng)殖戶造成經(jīng)濟損失。在集約化養(yǎng)殖過程中能對血鸚鵡魚造成較大危害的病原有：車輪蟲(Trichodinasp.)、指環(huán)蟲(Dactylogyrussp.)等寄生蟲病[4]，嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、銅綠假單胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)等細菌病[5]，還有病毒感染的報道[6]。目前，尚未見葡萄球菌(Staphylococcus)病原相關的報道，因首次從觀賞魚車間工廠化養(yǎng)殖的患病血鸚鵡魚腎臟分離得到1株葡萄球菌，本文對該病原的形態(tài)和生化反應特征、分子生物學鑒定、藥敏情況進行研究和探討，旨在對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中葡萄菌的感染進行報道，并為該病原的診斷和治療提供實踐依據(jù)，為進一步深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

患病魚取自于太原市魚種場觀賞魚養(yǎng)殖車間，發(fā)病魚為新購進的血鸚鵡魚種?；疾⊙W鵡魚主要表現(xiàn)為萎靡不振，離群躲在角落或扎堆，體表顏色暗淡，尾鰭、背鰭蜷縮。隨著病情的發(fā)展，患病血鸚鵡魚常沉于水底，不游動。解剖可見病魚腹腔有少量積液，肝臟發(fā)白，鰓部發(fā)白，腸道無食物，膽囊腫大，最終導致死亡，病程短，死亡率高。

試劑藥品：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂、溶菌肉湯培養(yǎng)基購自杭州百思生物技術公司，血液瓊脂購自南京便診生物科技有限公司，微量鑒定管等生化鑒定試劑和藥敏紙片購自杭州天和生物微生物試劑公司，其他藥品均為分析純。分子生物學鑒定試劑有EX Taq酶(TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)，引物(Invitrogen合成)，ddH2O，Marker(DL2000)。主要試驗儀器：恒溫培養(yǎng)箱(哈東聯(lián))，低溫離心機、 PCR儀(Eppendorf)，凝膠成像儀、電泳儀(Bio-Rad)，測序儀(ABI 3730XL)等。

1.2 病原菌分離純化

取癥狀典型的垂死患病血鸚鵡魚種，采用無菌解剖操作，取肝、腎等器官組織分別加入適量滅菌生理鹽水進行研磨，分別倒入7.5%氯化鈉肉湯和普通肉湯增菌液中，置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后劃線于血液瓊脂平板，在37 ℃ 培養(yǎng)24 h，然后挑取優(yōu)勢菌落進行染色鏡檢。以金黃色葡萄球菌(S.aureus)做陽性對照菌(菌株ATCC25923，為山西省生態(tài)畜牧與環(huán)境獸醫(yī)學重點實驗室保存)，觀察細菌的形態(tài)及染色特性。將菌株純培養(yǎng)物劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂，37 ℃ 培養(yǎng)24 h，觀察菌落的特征。

1.3 鑒定方法

通過病魚的病理特征觀察，病原提取分離、純化并進行菌落觀察和革蘭氏染色顯微觀察。進一步做菌株的生化鑒定，分子生物學分類鑒定，最后進行回歸感染試驗及藥敏試驗。

1.3.1 菌株的生化鑒定

取37 ℃培養(yǎng)過夜的菌株用灼燒冷卻的接種針接種至微涼生化鑒定管中，于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察記錄反應結果。根據(jù)參考文獻[7]方法，選擇血漿凝固酶、過氧化氫酶等項目檢測。通過《伯杰氏細菌鑒定手冊》[8]所列葡萄球菌屬各菌株的生理生化特性進行比較，確立該菌株的分類地位。

1.3.2 分子生物學分類鑒定

通過菌株總DNA的提取、采用細菌16S rDNA 通用引物進行PCR擴增。PCR反應體系(20 μL)：10×Ex Taq buffer(2.0 μL)、2.5 mmol/L dNTP Mix(1.6 μL)、5p Primer(各0.8 μL)、Template (0.5 μL)、5u Ex Taq(0.2 μL)、ddH2O(14.1 μL)。PCR程序設置為：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1.5 min，共24個循環(huán)；循環(huán)結束后，72 ℃再延伸10 min，4 ℃終止反應，PCR產(chǎn)物取出于-20 ℃保存待用。電泳檢測PCR產(chǎn)物并切膠純化后，送至美吉生物公司測序。對菌株的16S rDNA序列分析，并與美國國立生物技術信息中心網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中木糖葡萄球菌(S.xylxosus)16S rDNA序列進行相似度比較，以輔助界定該菌株種屬。

1.3.3 回歸感染

將培養(yǎng)純化后的菌懸液對試驗魚腹腔注射，菌懸液密度2.6×108cfu/mL，注射劑量50 μL/尾。設3個平行試驗組，每組10尾，第4組為對照組，注射等量的pH為7.0的滅菌生理鹽水。人工感染試驗魚均養(yǎng)殖于隔離的恒溫試驗水族箱中，觀察感染后的發(fā)病與死亡情況。死亡試驗魚及時撈出解剖觀察，分離病菌。分離菌經(jīng)純化后用血液瓊脂平板培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)，生理生化特征與注射菌進行對比是否與注射菌株一致。

1.3.4 藥敏試驗

藥敏試驗采用K-B紙片擴散法。將分離菌株接種于溶菌肉湯在37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)16～18 h。將培養(yǎng)物均勻地涂布到MH 瓊脂平板表面，用無菌鑷子將藥敏紙片貼于平板上，28 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察測量抑菌圈直徑大小，并根據(jù)《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》[8]判斷細菌對藥物的敏感性。

2 結果與分析

2.1 染色鏡檢結果

分離獲得的菌株命名為CVSX1，該菌為革蘭氏陽性圓形球菌(圖1)，直徑約0.8～1.0 μm，呈單個、二聯(lián)、四聯(lián)或葡萄串狀，無莢膜或鞭毛，不產(chǎn)生芽孢。

圖1 菌株形態(tài)特征

2.2 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)結果

分離菌株CVSX1血液瓊脂上進行初代培養(yǎng)約18 h，菌落灰白色呈稍凸圓形，直徑約為1 mm，邊緣整齊表面光滑，不溶血；24 h后，菌落顏色略黃，直徑約2.0～2.5 mm，周圍有弱溶血環(huán)。

2.3 菌株的生化鑒定結果

菌株CVSX1的生理生化指標結果為：發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、蔗糖及甘露醇產(chǎn)酸；半乳糖苷酶、過氧化氫酶及脲酶陽性，氧化酶、血漿凝固酶均為陰性，對新生霉素具有抗性。將菌株CVSX1的生化指標與《伯杰氏細菌鑒定手冊》[8]的木糖葡萄球菌的生理生化特性進行比較，反應結果均基本相符(表1)。因此可初步分析判定菌株CVSX1為葡萄球菌屬的木糖葡萄球菌。

表1 分離菌株的生化特性

注：+表示陽性； -表示陰性； w表示微弱陽性.

2.4 分子生物學分類鑒定結果

采用葡萄球菌16S rDNA引物對菌株CVSX1進行PCR并對擴增產(chǎn)物進行序列測定，得到樣本CVSX1的16S rDNA拼接序列結果。測得樣本CVSX1的16S rDNA序列大小為1442 bp，并與美國國立生物科技信息中心網(wǎng)站中登錄的的木糖葡萄球菌16S rDNA序列比較，Blast檢測結果顯示，兩者16S rDNA序列的相似度大于99%，只存在3個核苷酸差異(圖2)。根據(jù)查詢網(wǎng)站數(shù)據(jù)篩選出的與該菌株相似度99%的菌株，采用最小歐氏距離法(圖3)進行聚類分析，查詢菌株CVSX1最終與木糖葡萄球菌聚類在一起，表明分離菌株CVSX1與葡萄球菌屬的木糖葡萄球菌遺傳距離最近。

圖2 菌株CVSX1 16S rDNA差異序列“*”表示相同核苷酸，“-”表示堿基不同.

圖3 菌株16S rDNA序列聚類分析(最小歐氏距離法)

2.5 回歸感染結果

用分離得到的木糖葡萄球菌CVSX1對試驗魚進行注射感染，試驗魚表現(xiàn)出活動減弱，食欲減退，對刺激無反應、注射處傷口感染等癥狀。試驗魚腹部發(fā)紅，有腹水，注射處有出血點。腹腔注射攻毒試驗魚后，魚的腹部出現(xiàn)發(fā)紅癥狀，在注射處有出血點，96 h內(nèi)均全部死亡，死亡特征與發(fā)病魚基本一致。對照組未見異常癥狀，無死亡。攻毒后死亡魚體分離的病菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板上長出的菌落特征、菌株生化特征等均與感染所用的試驗菌株一致。

2.6 藥敏試驗結果

木糖葡萄球菌CVXS1的藥敏試驗結果見表2。參照評價標準[9]，木糖葡萄球菌 CVSX1對磺胺嘧啶(250 μg/片)、青霉素G(10 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)高度耐藥；對環(huán)丙沙星(5 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)中介；對紅霉素(5 μg/片)，丁胺卡那(30 μg/片)敏感。

表2木糖葡萄球菌CVSX1對臨床常用抗生素的敏感性mm

抗生素種類磺胺嘧啶青霉素G諾氟沙星四環(huán)素環(huán)丙沙星氧氟沙星紅霉素丁胺卡那抑菌圈直徑5.213.812.07.618.214.140.119.0敏感性RRRRIISS

注：“R”表示耐藥，“S”表示敏感，“I”表示中介.

3 討 論

3.1 凝固酶陰性葡萄球菌及其危害

葡萄球菌屬是從臨床標本檢出的革蘭氏陽性球菌中最為常見的細菌，分為凝固酶陰性和凝固酶陽性兩類[10]。凝固酶陽性葡萄球菌包括金黃色葡萄球菌(S.aureus)、中間型葡萄球菌(S.intermedius)和家畜葡萄球菌(S.hyicus)等。金黃色葡萄球菌多為致病菌，能夠引起諸多人和畜禽感染等，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)可引起尿路感染、敗血癥和心內(nèi)膜炎等各種感染，屬于條件致病菌[11]。近年來由凝固酶陰性葡萄球菌引起的感染正逐漸上升，并且耐藥菌株不斷增加[12]。

木糖葡萄球菌屬于血漿凝固酶陰性葡萄球菌，該菌自然界分布廣泛，致病性較弱[13]，以往被認為是非致病菌[14]。但是近年來，抗生素被廣泛應用于疾病治療，血漿凝固酶陰性葡萄球菌也開始成為重要的條件致病菌，并已出現(xiàn)多重耐藥菌株[15]。導致人類患病的葡萄球菌中致病力較弱的血漿凝固酶陰性葡萄球菌逐漸占據(jù)重要位置[16]。木糖葡萄球菌可引起術后患者并發(fā)醫(yī)院感染[17]、肺炎敗血癥[18]等。在畜牧生產(chǎn)過程中也可引發(fā)病害，例如在引起奶牛乳房炎的細菌中，血漿凝固酶陰性葡萄球菌的總體比例呈逐漸上升趨勢[19]。從目前報道可知，葡萄球菌感染養(yǎng)殖鮮活魚類的報道較少，僅有中間葡萄球菌感染紅龍魚(Scleropagesformosus)[20]、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)感染黃鱔(Monopterusalbus)[21]的兩例。也有一些木糖葡萄球菌致病的報道，如在水產(chǎn)養(yǎng)殖上，該菌與羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)肌肉白濁病密切相關，引起蝦苗大批死亡，該病發(fā)病率高達80%以上，受感染的蝦苗死亡率可達90%，因此造成了巨大的經(jīng)濟損失[22-23]。因此對木糖葡萄球菌等凝固酶陰性葡萄球菌生物學特性及耐藥性監(jiān)測就顯得很有必要。

3.2 觀賞魚感染葡萄球菌防治

木糖葡萄球菌感染魚類尚未見報道，需多加注意該病原的流行傳播。在未查明木糖葡萄球菌對于水產(chǎn)養(yǎng)殖重要熱帶魚類如羅非魚等大宗生產(chǎn)的血鸚鵡近緣品種魚類的致病性的情況下，應密切監(jiān)控和預防此病原的傳播。本次發(fā)病的原因可能與長途運輸回來的魚苗體質(zhì)較弱，對環(huán)境的適應能力差有關，病原菌在封閉循環(huán)水體中大量繁殖感染其他健康魚苗從而造成大批量的死亡。因養(yǎng)殖車間苗種外購于南方，中間環(huán)節(jié)較多，血鸚鵡魚如何感染木糖葡萄球菌，尚需進一步調(diào)查。通過對該菌在其他魚類及陸生動物的攻擊試驗研究表明，該菌在較低溫度時對斑馬魚(Brachydaniorerio)和金魚 (Carasiusauratus)致病性不強[24]，但腹腔注射對小鼠有一定致病力。從本研究和紅龍魚感染人畜共患中間葡萄球菌的報道來看，觀賞魚感染此類病原菌的潛在危害較大，如果攜帶病菌或發(fā)病的魚進入普通家庭，在日常養(yǎng)殖過程中可能成為潛在傳染源，造成寵物或接觸者感染[25]。

在病害防治過程中也應注意鏈球菌病害與該病原造成病癥的區(qū)分。目前對于控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病的發(fā)生和流行大多仍采用抗菌藥物，然而依靠化學藥物防治容易導致病原菌產(chǎn)生耐藥性，需要有效合理地應用抗生素是防治魚類細菌性疾病的重要措施之一[26]。在水產(chǎn)動物中此類疾病傳播的防控中需要注意科學用藥降低多重耐藥菌的產(chǎn)生幾率。

4 結 論

根據(jù)從患病的血鸚鵡魚肝臟組織分離菌株的形態(tài)學特征、生理生化特征、藥敏試驗、分子生物學鑒定、攻毒試驗的結果可以初步判定分離于患病血鸚鵡魚的病原菌為木糖葡萄球菌。木糖葡萄球菌為人—獸—魚、蝦共患病原，在觀賞魚養(yǎng)殖過程中應注意該病原的潛在公共安全隱患。試驗應用臨床常用抗生素對該菌進行藥敏檢測，結果表明本次分離的木糖葡萄球菌對磺胺嘧啶、青霉素G、諾氟沙星、四環(huán)素高度耐藥，對環(huán)丙沙星、氧氟沙星中度敏感，對紅霉素，丁胺卡那敏感。

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IdentificationandDrugResistanceofStaphylococcusxylosusIsolatedfromCichlidCichlasomavar.

LIU Qing1, ZHAO Mingwu2, CAO Xinlei2, LIU Xinzheng2

( 1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China；2. Fish Hatchery of Taiyuan, Taiyuan 030025, China )

The pathogenic bacteria were isolated from the kidney of diseased CichlidCichlasomavar. and made physiological，biochemical and molecular biological identification. Furthermore，drug sensitive tests and artificial infection experiments were performed in order to develop effective control and prevention measures. After 24 hours, the bacteria cultured on blood agar and clones were circular with smooth and neat edges and a weak zone of hemolysis around. The bacteria were Gram positive coccobacteria and had the diameter about 0.8 — 1.0 μm, most of which were acervate, a few scattered pairs or quadruple-like arrangement, without capsule or flagella and no spores either. Based on physiological and biochemical characteristics, the strain was identified asStaphylococcusxylosus. Analysis of the 16S rDNA sequence of the strain showed that it belonged toStaphylococcus, and had farther distance withStreptococcus, and that the similarity to uploaded 16S rDNA sequence ofS.xylosusin GenBank database was 99%. Cluster analysis revealed that the bacteria had the smallest genetic distance withS.xylosus. Pathogenicity of the isolated strain was determined by artificial infection experiment and it was found that it had strong pathogenicity toCichlasomavar. juveniles. The bacteria susceptibility test indicated that the bacterial strain was resistant to sulfadiazine, penicillin, norfloxacin, tetracycline, but sensitive to erythromycin, and amikacin, and moderately sensitivity intermediate with ciprofloxacin and ofloxacin.

Cichlasomavar.;Staphylococcusxylxosus; 16S rDNA; identification; drug resistance

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.02.014

S917.1

A

1003-1111(2016)02-0174-05

2015-09-21；

2015-11-12.

山西省科學技術發(fā)展計劃項目 (20130311028-5)；山西農(nóng)業(yè)大學育種基金資助項目(20132-22).

劉青(1980-)，男，講師；研究方向：水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖與病害防治. E-mail:liuqing_sxau@126.com.