寧軍號,常亞青,劉 偉,宋 堅,石明明

( 大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室，遼寧 大連116023 )

溫度驟降對光滑河蘭蛤的脅迫效應(yīng)

寧軍號,常亞青,劉 偉,宋 堅,石明明

( 大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室，遼寧 大連116023 )

設(shè)置3種溫度驟降模式，研究光滑河蘭蛤肌肉中可溶性蛋白、可溶性糖含量及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、總抗氧能力、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶活力。試驗結(jié)果表明，3種降溫模式對試驗蛤肌肉中各生化指標(biāo)均有顯著影響(P< 0.05)。試驗過程中，可溶性蛋白和可溶性糖含量均能維持初始水平。大幅降溫和中幅降溫組中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力在1 h內(nèi)顯著降低，過氧化氫酶活力在3 h后開始趨于穩(wěn)定；小幅降溫組超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力隨脅迫時間延長均呈升高-降低-再升高的波動變化；總抗氧能力在3種降溫模式中均呈波動變化。堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活力在大幅降溫組和中幅降溫組均呈波動變化；在小幅降溫組，二者均在1 h內(nèi)顯著降低，6 h后趨于穩(wěn)定；溶菌酶活力在3種降溫模式中均呈波動變化，6 h后均出現(xiàn)大幅波動。研究結(jié)果顯示，溫度驟降會影響機(jī)體生理功能和免疫力，可能是誘發(fā)水產(chǎn)動物疾病的原因之一。

光滑河蘭蛤; 溫度驟降; 可溶性蛋白; 可溶性糖; 免疫因子

光滑河蘭蛤(Potamocorbulalaevis)，俗稱海砂子、粳米蜆子[1]，是一種小型經(jīng)濟(jì)貝類，喜群居埋棲生活，生活在泥沙灘潮間帶，20 ℃生長較快，10 ℃幾乎停止生長，溫度驟變可致其成體大量死亡[1]。廣泛分布于我國南北沿海，可作為養(yǎng)殖家禽、對蝦的優(yōu)質(zhì)鮮活餌料，是一種具有開發(fā)前景的雙殼貝類。近年來，酷漁濫捕、海洋污染日趨嚴(yán)重，加之繁殖保護(hù)不力，光滑河蘭蛤自然資源日漸枯竭[2-3]。研究表明，環(huán)境因子變化是引起養(yǎng)殖動物應(yīng)激反應(yīng)使其免疫抗病能力下降的主要誘因[4]。目前，溫度驟降對光滑河蘭蛤生化指標(biāo)影響尚未見報道，為此筆者對光滑河蘭蛤進(jìn)行了急性溫度脅迫試驗，研究了溫度驟降后不同應(yīng)激時間肌肉中可溶性蛋白、可溶性糖含量及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、總抗氧能力、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶活力，以探討溫度驟降對光滑河蘭蛤生理功能及抗氧化能力的影響，為保護(hù)及合理開發(fā)利用光滑河蘭蛤自然資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用光滑河蘭蛤采自大連莊河海域，殼形完整，活力良好，平均體質(zhì)量為(2.0±0.3) g。試驗蛤運(yùn)回實驗室暫養(yǎng)，海水鹽度31±1，溫度(12±0.05) ℃，pH為8±0.05。暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣，投喂螺旋藻粉和酵母粉，日換水1次，7 d后運(yùn)往低溫實驗室，饑餓24 h后開始試驗。

1.2 方法

1.2.1 溫度控制

試驗蛤放入70 L 白色聚乙烯水槽中，每槽100粒。試驗前將水溫以1 ℃/d[5]由12 ℃分別降至設(shè)定溫度8、4、2 ℃，每個溫度點(diǎn)維持48 h取樣作為對照。試驗設(shè)置3種驟降模式：8 ℃→ -2 ℃(大幅降溫組)、4 ℃→ -2 ℃(中幅降溫組)及2 ℃→ -2 ℃(小幅降溫組)。海水溫度由設(shè)定溫度8、4、2 ℃在2 h內(nèi)驟降至-2 ℃，分別在降至-2 ℃(冰點(diǎn))0、1、3、6、9、24 h時解剖取樣。每次隨機(jī)取蛤5粒，測量其殼長和殼高，取肌肉，稱量質(zhì)量后置于4 ℃保存待用，每組設(shè)3個平行。

1.2.2 樣品制備及測定

剪碎試驗蛤肌肉組織，稱量質(zhì)量后放入研磨器中，加入生理鹽水在冰上制成10%的組織勻漿，4 ℃、2000 r/min離心10 min，收集上清液，4 ℃保存，待測。所測指標(biāo)均采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)及Epoch 酶標(biāo)儀(美國BioTek公司) 進(jìn)行測定[6-7]，可溶性糖含量采用苯酚濃硫酸法進(jìn)行測定[8]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理并做圖，SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中可溶性蛋白含量的影響

大幅驟降模式對光滑河蘭蛤肌肉中可溶性蛋白含量有顯著影響(P<0.05)，中幅和小幅2種驟降模式對其可溶性蛋白含量無顯著影響(P>0.05)。大幅驟降模式中，0 h時可溶性蛋白含量最低，脅迫1 h時可溶性蛋白含量顯著增加(P<0.05)，隨著脅迫時間的延長，可溶性蛋白含量變化不明顯，但維持在較高水平(圖1)。

圖1 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中可溶性蛋白含量的影響

注：相同處理組標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P< 0.05)，含有相同字母表示差異不顯著.下同.

2.2 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中可溶性糖含量的影響

大幅、中幅2種驟降模式中，可溶性糖含量隨脅迫時間變化顯著(P<0.05)，且均呈升高-降低-再升高趨勢，其最低值分別出現(xiàn)在脅迫3 h和6 h，最高值分別在脅迫1 h和24 h；小幅驟降模式中，可溶性糖含量除在脅迫6 h時顯著升高(P<0.05)，其余均維持較低且不顯著水平(P>0.05)(圖2)。

圖2 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中可溶性糖含量的影響

2.3 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中超氧化物歧化酶含量的影響

3種驟降模式對光滑河蘭蛤肌肉中超氧化物歧化酶含量均有顯著影響(P<0.05)。大幅和中幅2種驟降模式中超氧化物歧化酶含量均呈降低-升高-再降低趨勢，其最低值分別出現(xiàn)在脅迫9 h和24 h，最高值分別出現(xiàn)在脅迫6 h和3 h；在小幅驟降模式中，超氧化物歧化酶含量呈升高-降低-再升高趨勢，其最低值和最高值分別出現(xiàn)在脅迫6 h和3 h。在中幅驟降模式中，各取樣點(diǎn)超氧化物歧化酶含量均明顯高于另外2組(圖3)。

圖3 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中超氧化物歧化酶活力的影響

2.4 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中過氧化氫酶含量的影響

3種驟降模式對光滑河蘭蛤肌肉中過氧化氫酶含量均有顯著影響(P<0.05)。大幅和中幅2個驟降模式中過氧化氫酶含量均呈先降后升趨勢，其最低值分別出現(xiàn)在脅迫0 h和9 h，最高值分別出現(xiàn)在脅迫24 h和0 h；在小幅驟降模式中，過氧化氫酶含量呈升高-降低-再升高趨勢，其最低值和最高值分別出現(xiàn)在脅迫6 h和24 h，且在該驟降模式中，過氧化氫酶含量在脅迫9 h和24 h明顯高于另外2組(圖4)。

圖4 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中過氧化氫酶活力的影響

2.5 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中總抗氧能力含量的影響

3種驟降模式對光滑河蘭蛤肌肉中總抗氧能力含量均有顯著影響(P<0.05)。大幅和中幅2種驟降模式中總抗氧能力含量均呈升高-降低-再升高-再降低的波動趨勢，其最低值分別出現(xiàn)在脅迫0 h和24 h，最高值分別出現(xiàn)在脅迫1 h和6 h；在小幅驟降模式中，總抗氧能力含量呈升高-降低-再升高趨勢，其最低值和最高值分別出現(xiàn)在脅迫9 h和3 h(圖5)。

圖5 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中總抗氧能力活力的影響

2.6 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中堿性磷酸酶含量的影響

3種驟降模式對光滑河蘭蛤肌肉中堿性磷酸酶含量均有顯著影響(P<0.05)。中幅和小幅2種驟降模式中堿性磷酸酶含量均呈降低-升高-再降低趨勢，其最低值分別出現(xiàn)在脅迫6 h和3 h，最高值均現(xiàn)在脅迫9 h；在大幅驟降模式中，堿性磷酸酶含量呈升高-降低-再升高-再降低的波動趨勢，其最低值和最高值分別出現(xiàn)在脅迫6 h和9 h(圖6)。

圖6 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中堿性磷酸酶活力的影響

2.7 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中酸性磷酸酶含量的影響

3種驟降模式對光滑河蘭蛤肌肉中酸性磷酸酶含量均有顯著影響(P<0.05)。中幅和小幅2種驟降模式中酸性磷酸酶含量均呈降低-升高-再降低趨勢，其最低值分別出現(xiàn)在脅迫6 h和3 h，最高值均現(xiàn)在脅迫9 h；在大幅驟降模式中，酸性磷酸酶含量呈升高-降低-再升高-再降低的波動趨勢，其最低值和最高值分別出現(xiàn)在脅迫0 h和9 h(圖7)。

圖7 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中酸性磷酸酶活力的影響

2.8 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中溶菌酶含量的影響

3種驟降模式對光滑河蘭蛤肌肉中溶菌酶含量均有顯著影響(P<0.05)。大幅和小幅2種驟降模式中溶菌酶含量均呈波動變化，且均維持在較低水平；在中幅驟降模式中，溶菌酶含量呈降低-升高-再降低的波動趨勢，其最低值和最高值分別出現(xiàn)在脅迫1 h和9 h，且在該模式中，溶菌酶含量在脅迫6、9、24 h顯著高于另外2組(P<0.05)(圖8)。

圖8 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中溶菌酶活力的影響

2.9 不同降溫幅度對光滑河蘭蛤各生化指標(biāo)的影響

不同降溫幅度對光滑河蘭蛤肌肉中可溶性蛋白和總抗氧能力含量無顯著影響(P>0.05)。在大幅降溫組，酸性磷酸酶含量顯著高于另外兩組(P<0.05)；在中幅降溫組，超氧化物歧化酶和溶菌酶含量均顯著高于另外兩組(P<0.05)；在小幅降溫組，可溶性糖和堿性磷酸酶含量均顯著低于其他兩組，而過氧化氫酶含量顯著高于其他兩組(P<0.05)(表1)。

表1 不同降溫幅度對光滑河蘭蛤各生化指標(biāo)均值的影響 U/mg

3 討 論

3.1 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響

蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)可作為結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白，既是細(xì)胞的重要組分又在生理代謝中發(fā)揮重要作用[9]?？扇苄缘鞍字写嬖诤艽蟊壤c代謝、免疫相關(guān)的酶類，可提高水產(chǎn)動物自我保護(hù)、調(diào)控和抵抗外界脅迫能力[10]。相關(guān)研究表明，低溫馴化或溫度驟降對水產(chǎn)動物體內(nèi)可溶性蛋白含量有顯著影響[7-8, 10-11]。本研究中，大幅降溫對光滑河蘭蛤肌肉中可溶性蛋白含量有顯著影響，而中幅降溫和小幅降溫試驗蛤肌肉中可溶性蛋白含量維持初始水平，表明大幅變溫對水產(chǎn)動物造成更大傷害，這在仿刺參(Apostichopusjaponicus)溫度脅迫中已得到了充分驗證[8,12]。在溫度大幅驟降試驗中光滑河蘭蛤可溶性蛋白在溫度降至冰點(diǎn)很短時間內(nèi)(1 h)顯著升高，隨后逐漸降低并維持初始水平，表明光滑河蘭蛤遭遇外界溫度大幅驟降時能夠通過自身調(diào)節(jié)，維持體內(nèi)可溶性蛋白含量的穩(wěn)定?？扇苄缘鞍缀吭诙虝r間內(nèi)增加，可能是試驗蛤快速代謝產(chǎn)生了較多調(diào)控蛋白(如酶類)以適應(yīng)外界溫度變化，增強(qiáng)自身抗寒能力[7,13]。

糖類是生物有機(jī)體最主要的能源物質(zhì)，同時作為一類重要的信號分子[7,10]。水產(chǎn)動物體內(nèi)可溶性糖含量在不同低溫脅迫模式下均有明顯變化[7-8,10-11]，本研究結(jié)果表明，可溶性糖可作為衡量水產(chǎn)動物受溫度脅迫程度的重要指標(biāo)。本研究中，3種驟降模式可溶性糖含量均在較短時間內(nèi)顯著升高，表明試驗蛤通過調(diào)節(jié)可溶性糖含量以適應(yīng)外界驟變環(huán)境，Ning等[7,10]在研究溫度驟降對刺參、鋸緣青蟹(Scyllaserrata)的脅迫中有類似結(jié)論。試驗結(jié)束時，大幅驟降和小幅驟降組可溶性糖含量均能維持初始水平，推測大幅驟降模式下受試動物處于極度應(yīng)激狀態(tài)；而中幅驟降組可溶性糖含量顯著升高，表明水產(chǎn)動物在低溫環(huán)境中再次遭遇快速大幅降溫機(jī)體可能受到更大傷害仿刺參在溫度驟降過程中也發(fā)現(xiàn)了相同現(xiàn)象[7-8]。

3.2 溫度驟降對光滑河蘭蛤肌肉中非特異性免疫因子的影響

在降溫脅迫下，生物體內(nèi)超氧陰離子自由基增多，嚴(yán)重破壞機(jī)體細(xì)胞膜系統(tǒng)[14]；而在進(jìn)化過程中，生物體內(nèi)形成一套有效清除活性氧自由基的抗氧化體系，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是這套抗氧化體系中相互關(guān)聯(lián)的抗氧化酶，超氧化物歧化酶可將生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，再經(jīng)過氧化氫酶催化H2O2產(chǎn)生H2O和O2[6,15]。生物受到脅迫時，體內(nèi)抗氧化酶活力因清除活性氧自由基而下降，這標(biāo)志著機(jī)體清除活性氧自由基的能力降低[16]。因此，生物體內(nèi)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化酶的動態(tài)變化可反映機(jī)體組織氧化損傷情況[17-19]。

本研究中，溫度驟降初期光滑河蘭蛤肌肉中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶含量呈相似變化趨勢，大幅驟降和中幅驟降組在1 h內(nèi)顯著降低，表明試驗蛤體內(nèi)產(chǎn)生了較多活性氧自由基；而超氧化物歧化酶和過氧化氫酶含量在小幅驟降組1 h內(nèi)顯著升高，從而有效清除機(jī)體內(nèi)自由基，表現(xiàn)為主動適應(yīng)環(huán)境變化[6]。但這種上升維持時間較短，隨應(yīng)激時間延長而逐漸降低，洪美玲等[16]在對中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的研究中也有相似報道。隨著脅迫時間延長，中幅驟降組中，試驗蛤超氧化物歧化酶含量顯著升高，明顯高于另外兩組，表明中幅驟降模式可能對水產(chǎn)動物造成的傷害更大。試驗蛤超氧化物歧化酶含量在大幅驟降和小幅驟降組中呈波動變化趨勢，凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、中華絨螯蟹在溫度脅迫過程中，超氧化物歧化酶含量也會發(fā)生明顯波動[20-21]?？寡趸负棵黠@波動是對外界環(huán)境劇烈變化的應(yīng)激反應(yīng)，表明水產(chǎn)動物可能正在承受較大傷害，Ning等[7]研究溫度驟降對仿刺參脅迫效應(yīng)也得出了相似論斷。過氧化氫酶含量在大幅驟降和中幅驟降組隨脅迫時間延長有所升高，但維持在較低水平，表明大幅度溫度驟降對機(jī)體抗氧化酶有強(qiáng)烈抑制作用。3種降溫模式下，總氧化能力隨脅迫時間延長呈波動變化，短時間達(dá)到最高值，并能在6 h內(nèi)維持在較高水平，表明溫度驟降對光滑河蘭蛤造成較大傷害，但短時間內(nèi)試驗蛤可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化能力來適應(yīng)外界環(huán)境變化。

磷酸酶既是生物體內(nèi)重要代謝調(diào)控酶，也是溶酶體的標(biāo)志酶，存在于吞噬細(xì)胞內(nèi)，能夠水解并清除侵入體內(nèi)的外源物，增強(qiáng)機(jī)體防御功能[22-23]。本研究3種降溫模式中，酸性磷酸酶受溫度脅迫均呈波動變化，且均在9 h達(dá)到最高值，表明水產(chǎn)動物體內(nèi)酸性磷酸酶對外界溫度變化敏感，但不總是隨應(yīng)激時間延長而降低。孫金輝等[24]研究溫度驟降對凡納濱對蝦仔蝦脅迫過程中，酸性磷酸酶活力隨脅迫時間延長而不斷降低，這與本試驗結(jié)果略有不同。堿性磷酸酶在降溫初期(1 h內(nèi))均顯著降低，且同樣在9 h達(dá)到最高值，這與酸性磷酸酶的變化趨勢相同，表明水產(chǎn)動物在受到外界環(huán)境脅迫時，體內(nèi)酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力受到抑制，仍表現(xiàn)出積極響應(yīng)外界環(huán)境變化的傾向。磷酸酶在室溫條件下極不穩(wěn)定，這也是磷酸酶容易偏低的原因。

溶菌酶代表了一系列酶，是廣泛存在于脊椎動物、無脊椎動物、植物和細(xì)菌中重要的非特異性免疫因子[25]。溶菌酶作為水產(chǎn)動物血淋巴細(xì)胞酶系統(tǒng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，可反映機(jī)體非特異性免疫水平的變化[26-27]。本研究中，試驗蛤肌肉中溶菌酶活力在短時間內(nèi)顯著升高，增強(qiáng)自身免疫力抵抗外界不良環(huán)境；隨著應(yīng)激時間的延長，試驗蛤肌肉中溶菌酶活力開始下降或大幅波動，表明機(jī)體免疫力下降，進(jìn)而可能引起超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等相關(guān)免疫指標(biāo)發(fā)生變化，強(qiáng)俊等[27]研究急性溫度應(yīng)激對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)幼魚生化指標(biāo)影響時，亦得出了相似結(jié)論。

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StressResponsesofClamPotamocorbulalaevistoSharpDecreaseinTemperature

NING Junhao, CHANG Yaqing, LIU Wei, SONG Jian, SHI Mingming

( Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China )

In this study, the changes in concentration of soluble proteins and soluble sugars, total antioxidant capacity (T-AOC), and activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), alkaline phosphatase (AKP), acid phosphatase (ACP) and lysozyme (LSZ) were investigated in mature clamPotamocorbulalaevisexposed to sharp change in water temperature from 8, 4 and 2 °C to -2 °C for 0, 1, 3, 6, 9 and 24 h. There was significant effect of 3 acute temperature decrease models on all biochemical indices (P< 0.05). During the experiment, the concentrations of soluble proteins and soluble sugars were maintained at the initial level. The activities of SOD and CAT were found to be declined significantly within 1 h, and CAT activity became stable within 3 h in large and medium fluctuation of temperature decrease treatments (Tdec1and Tdec2treatments). However, the activities of SOD and CAT showed an increase-decrease-increase change trend in small fluctuation of temperature decrease treatment (in Tdec3treatment). The fluctuation of T-AOC activity was observed under the 3 kinds of stress models, especially the activities of ACP and AKP in Tdec1and Tdec2treatments. In Tdec3treatment, however, the activities of ACP and AKP were declined significantly within 1 h, and then stable within 6 h. The LSZ activity showed fluctuating changes in the clam exposed to the 3 kinds of temperature decrease models, the large fluctuations 6 h after administration. The findings indicated that the rapid decrease in temperature as an important ecological factor has profound effects on physiological and immune functions inducing diseases of organisms in aquaculture.

Potamocorbulalaevis;sharp temperature decrease;soluble protein;soluble sugar;immune factor

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.02.004

S968.3

A

1003-1111(2016)02-0117-06

2015-09-16；

2015-10-30.

國家海洋局海洋公益項目(201105016)；遼寧省科技攻關(guān)重大項目(2011203003).

寧軍號(1988-)，男，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)動物繁育.E-mail：ningjunhaook@126.com.通訊作者：常亞青(1967-)，男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師；研究方向：海洋生物學(xué)及水產(chǎn)動物繁育.E-mail:yqchang@dlou.edu.cn.