外植體的選擇對果樹葉片離體培養(yǎng)的影響研究

本文從外植體的基因型、葉片的發(fā)育程度、葉位及葉片切割方式等多方面對果樹葉片組織培養(yǎng)的影響因素做了有關(guān)論述，旨在對果樹葉片組織培養(yǎng)的研究方法及影響因子做一個比較系統(tǒng)的概述。

果樹葉片；離體葉片；外植體

植物的葉片是進(jìn)行光合作用的主要部位，其因體量大、獲取方便等原因常常被作為植物離體培養(yǎng)的外植體來源。葉片離體培養(yǎng)的成功在植物基因克隆研究領(lǐng)域具有重要意義。在果樹學(xué)領(lǐng)域，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用葉片進(jìn)行離體再生技術(shù)，已經(jīng)在變異篩選、引種、性狀保存、繁殖育種及轉(zhuǎn)基因工程等方面得到廣泛的應(yīng)用。本文就外植體的選擇情況對果樹離體葉片培養(yǎng)再生技術(shù)方面的影響做了詳細(xì)綜述。

1 外植體基因型對果樹葉片離體培養(yǎng)的影響

植物離體培養(yǎng)的情況首先受其基因型的限制。外植體的基因型是決定其離體再生能力的根本因素，具體表現(xiàn)為種和種以及品種之間再生能力的差異。時保華、趙政陽、孫清榮、達(dá)克東等均對不同蘋果品種的葉片離體培養(yǎng)再生能力進(jìn)行過比較試驗，結(jié)果表明：不同蘋果品種的不定芽誘導(dǎo)需不同的生長激素配比和組合，適合葉片分化的條件因品種而異。Nehra等在研究草莓葉片離體再生試驗中，發(fā)現(xiàn)在供試的10個品種中，相同條件下只有“Redcoat”品種獲得高頻率再生芽，其不定芽再生率高達(dá)94%，這說明草莓葉片直接再生芽能力受基因型影響。所以，在選擇外植體材料來源時，必須首先考慮供試材料的基因型背景。

2 葉片發(fā)育程度和再生代數(shù)對果樹葉片離體培養(yǎng)的影響

葉齡或者繼代培養(yǎng)時間也是影響葉片再生能力的一個重要因素。于冬梅等在草莓葉片離體培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)：M14葉齡為21～28 d的葉盤再生芽頻率最高，高達(dá)90%。葉齡在30 d以上，不定芽再生率普遍降低，僅為36%。用蘋果試管苗葉片為試材一般是選取繼代培養(yǎng)20～40 d的新梢葉片。如“皇家嘎拉”繼代培養(yǎng)21 d的葉片再生效果最好。在馬哈利櫻桃試管苗葉片離體培養(yǎng)試驗中，短于20 d的嫩葉培養(yǎng)初期均出現(xiàn)水浸狀態(tài)并且很容易出現(xiàn)死亡；50 d葉齡的葉片，在接種初期又極易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，再生頻率明顯降低。在枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)的報道中根據(jù)葉齡將葉片分為三個等級：成熟葉(展葉后30 d左右，墨綠色)、中度成熟葉(展葉后10 d左右，綠色)、嫩葉(新展開葉，嫩綠色)。結(jié)果表明：枇杷葉片離體再生能力與葉片成熟度密切相關(guān)，過嫩或者過老的葉片均不適合用于誘導(dǎo)愈傷組織，展葉10 d左右的中度成熟葉是最佳的誘導(dǎo)材料。

3 葉位對果樹葉片離體培養(yǎng)的影響

在葡萄葉片離體培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)：不定芽的再生受葉位影響非常明顯，再生率隨葉序位置的下降而降低，數(shù)據(jù)顯示：葉位最上的第1片葉不定芽再生率最高，為33%；第2片則為23%；第3片葉片則降低為15%，而中部葉片及以下均沒有不定芽產(chǎn)生。對蘋果的研究也發(fā)現(xiàn)：愈傷組織的脫分化和再分化能力均與葉位有關(guān)。無論是蘋果幼苗還是成苗，均是上位葉再分化率較高，高達(dá)80%，下位葉較低，為60%。

4 葉片不同部位對果樹葉片離體培養(yǎng)的影響

在蘋果“皇家嘎拉”的葉片培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)：在同一葉片上，葉中部比頂部或葉基部的葉段更易于再生植株。在梨的研究中也發(fā)現(xiàn)，“八月紅”不定芽產(chǎn)生于葉中部的中脈傷口及葉莖部傷口上較多，葉尖部則產(chǎn)生很少。這說明：葉片再生能力受所取葉片不同部位的影響也很大?？赡苁且驗閺娜~尖到葉基部，葉脈組織發(fā)達(dá)程度逐漸增強(qiáng)，運輸營養(yǎng)物質(zhì)和生長激素的能力也增強(qiáng)。

5 葉片切割方式對果樹葉片離體培養(yǎng)的影響

外植體受傷程度直接影響褐化，為避免褐化的發(fā)生，應(yīng)盡量減小切割長度并縮短外植體接種前與空氣的接觸時間。在蘋果試管苗葉片進(jìn)行切傷及不切傷處理試驗中發(fā)現(xiàn)：切傷與不切傷處理對不定芽的發(fā)生有很大影響，從再生力、不定芽數(shù)、再生率等方面看，切傷均比不切傷高。同時又做了劃傷、切塊、縱切和橫切處理做對比，發(fā)現(xiàn)任何切傷方法相比不切傷處理，不定芽的再生能力都有明顯的提高。另有研究報道，微金屬粒子的轟擊也可以提高再生效果。原因可能有以下兩點：一是粒子轟擊造成傷口，有利于對培養(yǎng)基中營養(yǎng)及激素的吸收，二是創(chuàng)傷誘導(dǎo)了細(xì)胞胚胎發(fā)生有關(guān)的基因表達(dá)。

6 葉片消毒方式對果樹葉片離體培養(yǎng)的影響

接種之前一定先要對外植體進(jìn)行消毒。一般先用軟毛刷子輕輕刷去表面的塵土，再將外植體浸入稀釋的洗衣粉水中浸泡30m in，再然后用自來水流水沖洗。接種前先用75%的酒精表面消毒20～30 s，再用0.1%～0.2%升汞消毒10m in。Fouad等指出：外植體采用0.5%次氯酸鈉表面殺菌15～20min，比用10%Ca(ClO)2或0.2%HgCl2處理芽的成活率高。Hammerschlag等人對5種常用消毒方法做了比較試驗，結(jié)果顯示：污染最輕的組合是外植體先用0.5%的NaClO+0.01%吐溫浸泡15～20min，再用100mg/L鏈霉素浸泡15m in，無菌水沖洗3次。消毒時間過長會對材料產(chǎn)生傷害，影響成活率。酒精消毒雖然效果較好，但易對材料造成傷害，加速褐化的發(fā)生。

7 小結(jié)

在果樹組織培養(yǎng)研究方面，利用葉片做外植體的報道已經(jīng)很多，研究也越來越深入，但是還有很多果樹沒有成功的離體培養(yǎng)技術(shù)，比如三倍體枇杷的葉片再生體系的建立至今尚未見成功報道。本文系統(tǒng)概述了外植體影響組織培養(yǎng)的六大關(guān)鍵因素，希望能對以后果樹組織培養(yǎng)的研究有一定的幫助。

[1]時保華，付潤民，趙政陽，等.蘋果葉片離體培養(yǎng)研究 [J].西北植物學(xué)報，2001，28(3)：189～193.

[2]趙政陽，付潤民，稅守歧，等.蘋果試管苗再生植株研究 [J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1992(6)：18～19.

[3]孫清榮，孫洪雁，劉慶忠，等.不同倍性蘋果葉片不定植株再生研究 [J].落葉果樹，2000(9)：9～11.

[4]達(dá)克東，李雅志，束懷瑞.蘋果葉片愈傷組織植株再生研究 [J].核農(nóng)學(xué)報，1995，9(3)：139～143.

[5]于冬梅，胡文玉，王關(guān)林，等.基因型和培養(yǎng)因子對誘導(dǎo)草莓葉片再生芽的影響 [J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)報，1998，29(2)：138～143.

[6]趙政陽，曹曉玲，黃英，等.葉片成熟度對蘋果試管苗葉片再生植株的影響 [J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997(1)：20～21.

[7]黃文江，劉慶忠，趙紅軍，等.馬哈利櫻桃葉片再生的研究 [J].落葉果樹，2002(4)：1～3.

[8]楊鳳玲，林順權(quán).枇杷葉片愈傷組織的誘導(dǎo)與保存 [J].亞熱帶植物科學(xué)，2005，34(4)：1～5.

[9]李云，馮慧.“紅地球”葡萄葉片葉柄不定芽再生體系的建立 [J].園藝學(xué)報，2002，29(1)：60～62.

[10]張玉萍.蘋果葉片愈傷組織誘導(dǎo)及其分化植株的研究 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994，22(4)：12～14.

[11]徐凌飛，馬鋒旺，任小林，等.“八月紅”梨葉片不定芽誘導(dǎo)研究 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版)，2002，30(4)：3～5.

[12]孫清榮.影響蘋果葉片不定芽再生的幾個因素[J].落葉果樹，1995(4)：3～4.

[13]臧運祥，鄭偉尉，孫仲序，等.蘋果葉片組培再生系統(tǒng)研究進(jìn)展 [J].生物科技通報，2004 (2)：15～18.

053000 衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 崔文寧