張新軍，劉長彬*，倪建宏，萬鵬程

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第七師一二七團(tuán)畜牧服務(wù)中心，新疆奎屯833200；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室）

優(yōu)質(zhì)綿羊冷凍胚胎引進(jìn)及胚胎移植試驗*

張新軍1，劉長彬2*，倪建宏2，萬鵬程2

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第七師一二七團(tuán)畜牧服務(wù)中心，新疆奎屯833200；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室）

2014—2015年先后從澳大利亞西奧谷河育種公司引進(jìn)薩?？撕腿庥妹览庋蚶鋬雠咛?73枚。解凍后可用于移植的胚胎為739枚，移植受體羊739只。其中，A級胚胎553枚，B級胚胎186枚，且A級胚胎移植受胎率為50.27%（278/553），明顯高于B級胚胎的39.25%（73/186），差異顯著。同時，對比了大尾羊和細(xì)毛羊2種受體羊品種間的受胎率，結(jié)果為差異不顯著。不同飼養(yǎng)條件下胚胎移植受胎率結(jié)果顯示，全舍飼羊受胎率為39.56%（178/450），放牧羊受胎率為49.48%（143/289），兩者差異顯著。大規(guī)模進(jìn)口肉羊冷凍胚胎進(jìn)行移植在基層生產(chǎn)單位的成功應(yīng)用，為肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了優(yōu)良的種質(zhì)資源。

綿羊；冷凍胚胎；胚胎移植

動物胚胎工程技術(shù)是家畜繁殖學(xué)領(lǐng)域的一項高新技術(shù)，既將良種母畜受孕后的早期胚胎通過人工方法取出，再將其移植到同種、同生理時期的母畜體內(nèi)，并繼續(xù)發(fā)育成新個體。胚胎移植亦稱為受精卵移植，或稱為“借腹懷胎”[1-2]。哺乳動物胚胎移植技術(shù)的發(fā)展已有100多年的歷史。1890年，英國劍橋大學(xué)的Walter Heape在安哥拉兔上首次成功獲得胚胎移植后代。美國的Warwick等在1934年成功進(jìn)行了綿羊胚胎移植，該技術(shù)已發(fā)展了78年[3]。以引進(jìn)動物冷凍胚胎的形式進(jìn)行胚胎移植，不但節(jié)省人力、物力、財力，還可一次大量引進(jìn)，而且可以把引種過程中疾病傳播的幾率降到最低限度[4]。馬保華研究報道，供體與受體之間同期發(fā)情同步差在±1 d或0～24 h，胚胎移植受胎率較高，能夠獲得較為理想的胚胎移植效果[5-10]。

目前，中國許多省市、自治區(qū)等都已嘗試進(jìn)行大規(guī)模羊胚胎移植工程，并取得了一定的成績。據(jù)統(tǒng)計，羊鮮胚胎移植妊娠率達(dá)54.4%～60.0%，最高達(dá)70.8%[11]?，F(xiàn)將在2014—2015年進(jìn)行的綿羊規(guī)?；鋬雠咛ヒ浦苍囼炦M(jìn)行總結(jié)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1胚胎品種及來源

品種為薩?？撕腿庥妹览?，購自澳大利亞西奧谷河育種公司。

1.1.2供試動物

受體羊為2～5歲生殖系統(tǒng)健康、無傳染病的本地大尾羊和新疆細(xì)毛羊。

1.1.3供試器材

擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的羊?qū)Ｓ檬中g(shù)架，腹腔內(nèi)窺鏡（OLYMPUS），實體顯微鏡（NIKON），Holding液、蔗糖液、冷凍液（ICP），CO2鋼瓶（國產(chǎn)），恒溫水浴鍋，止血鉗、手術(shù)刀、剪刀、持針鉗、縫合針及線、創(chuàng)巾、工作服、注射器（1 mL、5 mL和20 mL）、先穴式胚胎移植管、一次性培養(yǎng)皿、溫度計、布膠帶、曲別針、碘酒及酒精、消毒液、抽紙等主要實驗器材及耗材。

1.1.4供試藥品

同期發(fā)情陰道海綿栓、孕馬血清促性腺激素（PMSG，1 000 IU·瓶）、黃體酮、油劑青霉素、速眠新及蘇醒靈（長春農(nóng)牧大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所）。

1.2方法

1.2.1胚胎鑒定

在體視鏡下對解凍的胚胎進(jìn)行分級鑒定，根據(jù)胚胎形態(tài)的完整性及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的致密程度分為A、B、C級。胚胎鑒定標(biāo)準(zhǔn)：（1）胚胎細(xì)胞團(tuán)呈均勻?qū)ΨQ的球形，形態(tài)典型，單個分裂球的大小、顏色、密度一致，輪廓清晰，胚胎發(fā)育階段與預(yù)期的發(fā)育階段一致者為A級；（2）胚胎細(xì)胞團(tuán)的大小和形狀以及單個細(xì)胞的顏色和密度存在一定的不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)較致密，分布均勻，具有完好的、具活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)者為B級；（3）胚胎細(xì)胞團(tuán)的大小和形狀以及單個細(xì)胞有明顯變異，分裂球輪廓稍不清晰，或部分不清晰，細(xì)胞質(zhì)不致密，分布不均勻，色調(diào)發(fā)暗，但仍有部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完好的、有活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)者為C級。

1.2.2胚胎移植

采用微創(chuàng)手術(shù)，用移胚針將符合質(zhì)量要求的胚胎移植到與胚胎胚齡同期化的受體羊子宮角內(nèi)，移植后立即頸部肌肉深部注射黃體酮1 mL。

1.2.3妊娠檢查

于胚胎移植后45～60 d進(jìn)行B超檢查，統(tǒng)計受胎率。

1.2.4試驗資料的統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用卡方檢驗進(jìn)行差異顯著性分析。

2　結(jié)果

2.1不同胚胎級別對受體受胎率的影響

在本試驗中，共解凍了引進(jìn)冷凍胚胎773枚，達(dá)到移植級別的胚胎739枚，C和D級胚胎34枚，占可移植胚胎的4.6%（34/739）；將可移植胚胎用于移植后，A級胚胎受胎率為50.27%（278/553），B級胚胎為39.25%（73/186），兩者之間差異顯著（P＜0.05），見表1。

表1　冷凍胚胎解凍后胚胎級別分布及移植受胎率情況

2.2不同品種受體羊的受胎率分析

本試驗共處理了274只羊，大尾羊發(fā)情率為91.36%（148/162），細(xì)毛羊發(fā)情率96.43%（108/112）；大尾羊移植受胎率36.49%（54/148），細(xì)毛羊移植受胎率42.59%（46/108）。從表2可以看出，在相同的同期發(fā)情處理方式下，在同期發(fā)情效率上差異不顯著（P＞0.05），2個品種間的受胎率同樣差異不顯著（P＞0.05），見表2。

2.3不同飼養(yǎng)方式對受體受胎率的影響

表2　不同綿羊品種對受胎率的影響

本試驗共移植了受體739只，其中全舍飼羊450只，放牧羊289只。全舍飼羊受胎率為39.56%（178/450），放牧羊受胎率為49.48%（143/289），放牧飼養(yǎng)管理條件下的受體羊獲得更高的受胎率，差異顯著（P＜0.05），見表3。

表3　不同飼喂方式對綿羊受體受胎率的影響

3　結(jié)論

胚胎的冷凍對胚胎是一種傷害，因此，在冷凍前必須選擇A級胚胎進(jìn)行冷凍，以確保解凍后的胚胎能夠維持A級或B級的分級級別，才能有效保障受體羊獲得更高的移植受胎率。從表1可以看出，A級胚胎經(jīng)冷凍解凍后獲得了50.27%（278/553）的受胎率，而B級胚胎冷凍解凍后獲得了39.25%（73/186），兩者之間差異顯著（P＜0.05）。冷凍試驗的C和D級冷凍胚胎解凍后，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)散、透明帶破裂和解凍后找不到明顯的胚胎等情形，而無法進(jìn)行胚胎移植，因此，C和D級胚胎不用于冷凍，如果有條件可以直接鮮胚移植。

受體羊同期發(fā)情效率的高低是影響胚胎移植效率的關(guān)鍵因素之一，一般情況下，同期發(fā)情效率受季節(jié)、營養(yǎng)、處理方案、藥物等的影響。本試驗中對2種受體羊品種進(jìn)行了同期發(fā)情處理，采取每天觀察2次，每次觀察發(fā)情時間30 min至1 h，且看到受體羊表現(xiàn)為爬跨靜立、外陰出現(xiàn)紅腫、流透明粘液和精神不安等即判斷為發(fā)情[12]。從表2可以看出，大尾羊與小尾羊的發(fā)情效率相當(dāng)，差異不顯著。經(jīng)過胚胎移植后，兩組的受胎率差異同樣不顯著。

從表3可以看出，放牧綿羊的受胎率高于全舍飼，主要是因為放牧羊能夠充分運動，再者是放牧羊能夠采食到優(yōu)質(zhì)的新鮮牧草、牧草果實或優(yōu)質(zhì)干草。由于放牧羊能夠獲得更為全面的維生素、微量元素和蛋白的營養(yǎng)供應(yīng)，因此，放牧羊的移植受胎率明顯高于全舍飼羊的受胎率，差異顯著（P＜0.05）。

綜上所述，綿羊胚胎移植是一個系統(tǒng)工程，其受體選擇、激素、時間、季節(jié)和管理與營養(yǎng)等一系列環(huán)節(jié)緊密相扣，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都將導(dǎo)致胚胎移植失敗。只有做到精心挑選受體、嚴(yán)格操作、無菌措施以及精準(zhǔn)移植等，胚胎移植工作才能收到滿意效果。

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2016—09—23

國家級肉羊“胚胎移植基地”和兵團(tuán)級肉羊“胚胎生產(chǎn)”基地；兵團(tuán)院士基金專項（2013BB023）；兵團(tuán)重大科技項目（2013AA003-2）。

劉長彬（1977-），男，河南虞城人，副研究員，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail：xlchangbin@163.com。