祝 琳 施旭駿 高 謙

(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032)

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海分枝桿菌ppk基因的生物學(xué)功能研究

祝 琳 施旭駿 高 謙△

(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032)

目的 構(gòu)建海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)ppk基因敲除株,對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行研究。方法利用基因同源重組技術(shù),構(gòu)建了海分枝桿菌ppk基因敲除株;使用DAPI染色法檢測(cè)細(xì)菌胞內(nèi)多聚無機(jī)磷酸鹽(poly inorganic phosphate,poly-Pi)濃度;比較野生株及突變株在不同環(huán)境壓力下的生存能力;用野生株和突變株分別感染斑馬魚成魚,通過觀察斑馬魚的存活情況,研究ppk基因?qū)７种U菌毒力的影響。將野生株和突變株分別感染小鼠來源的巨噬細(xì)胞系RAW267.4,檢測(cè)其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖。結(jié)果ppk突變株胞內(nèi)poly-Pi濃度明顯下降;在斑馬魚成魚感染模型中出現(xiàn)顯著減毒表型;其在小鼠來源的巨噬細(xì)胞感染模型中的增殖較野生型菌株明顯減弱;在營養(yǎng)缺陷、抗生素(利福平、左氧氟沙星)等環(huán)境壓力下,其生存能力下降。結(jié)論ppk基因影響分枝桿菌在環(huán)境壓力下的生存,并且在其致病中發(fā)揮重要作用。

分枝桿菌; 多聚磷酸鹽激酶; 多聚無機(jī)磷酸鹽

由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染所引起的結(jié)核病是一種嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全的傳染性疾病。近年來,隨著結(jié)核病與HIV共感染、耐多藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)使結(jié)核病的控制更為困難[1],亟需探索預(yù)防和治療結(jié)核病的新策略。對(duì)結(jié)核分枝桿菌重要功能基因及細(xì)菌-宿主相互作用的深入研究對(duì)于開發(fā)新的抗結(jié)核藥物和疫苗具有重要意義。

磷元素是構(gòu)成生物體的必要元素,多聚無機(jī)磷酸鹽(poly inorganic phosphate,poly-Pi)是磷元素在生物體內(nèi)的主要存在形式。poly-Pi是由幾個(gè)到幾百個(gè)無機(jī)磷酸鹽單體通過高能磷酸鍵聚合而成的線性多聚體,廣泛分布于自然界和生物體[2]。poly-Pi可作為信號(hào)分子參與細(xì)菌對(duì)環(huán)境壓力的應(yīng)激性應(yīng)答[3-4]。對(duì)大腸埃希菌的研究發(fā)現(xiàn),在壓力環(huán)境下細(xì)菌胞內(nèi)poly-Pi聚集可以激活RNA聚合酶RpoS,從而增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)壓力環(huán)境的耐受[5]。此外,細(xì)菌蛋白酶體Lon可以與poly-Pi結(jié)合,通過降解核糖體蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸來應(yīng)對(duì)營養(yǎng)缺陷[6]。poly-Pi缺失菌株在平臺(tái)期生長受到抑制,并且對(duì)熱激、酸性、UV輻射以及氧化應(yīng)激更敏感[7-10],由此說明poly-Pi在細(xì)菌對(duì)環(huán)境壓力的應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。

由于poly-Pi在細(xì)菌生理過程中具有重要的作用,因此其在細(xì)菌體內(nèi)的合成與降解受到精確調(diào)控。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)參與poly-Pi代謝的酶包括多聚磷酸鹽激酶(polyphosphate kinase,PPK)、poly-Pi-AMP磷酸轉(zhuǎn)移酶(phosphotransferase,PAP)、多聚磷酸鹽外切酶(exopolyphosphatase,PPX)和多聚磷酸鹽內(nèi)切酶(endopolyphosphatase,PPN)[11]。 PAP、PPXs和PPNs均參與poly-Pi的降解:PAP能轉(zhuǎn)移poly-Pi末端磷酸基團(tuán)至AMP[12];PPX具有外切磷酸酶活性,能將poly-Pi降解成無機(jī)磷酸根離子[13-14];PPN具有內(nèi)切磷酸酶活性,能將poly-Pi降解成短鏈的寡聚磷酸鹽鏈。PPK與poly-Pi的合成有關(guān):PPK1能催化ATP末端的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移合成poly-Pi[15],即nATP→(poly-Pi)n+nADP;而PPK2是雙向酶,催化GTP+(poly-Pi)n-1→GDP+(poly-Pi)n,并且其降解活性顯著高于合成活性[16]。不同細(xì)菌中PPK蛋白的種類有所不同,在一些細(xì)菌中,同時(shí)含有PPK1和PPK2 (如結(jié)核分枝桿菌、銅綠假單胞菌等)[17];而在另一些細(xì)菌中(如大腸埃希菌、海分枝桿菌等)只含有PPK1[16]。

目前在不同分枝桿菌研究中PPK的相關(guān)報(bào)道顯示:恥垢分枝桿菌的ppk1缺失株在氧化應(yīng)激、表面壓力以及缺氧條件下的生存能力減弱[18];在結(jié)核分枝桿菌中,ppk1的缺失引起細(xì)菌胞內(nèi)poly-Pi水平顯著下降,表現(xiàn)出在平臺(tái)期、NO壓力下和巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長缺陷。同時(shí),ppk1敲除株對(duì)一線抗結(jié)核藥物如利福平(rifampin,Rif)、異煙肼更加敏感,并在豚鼠感染模型上的毒力顯著減弱[19]。這些研究結(jié)果說明poly-Pi對(duì)分枝桿菌的生理功能和致病性具有重要的作用。在海分枝桿菌中,PPK1蛋白的功能還不清楚。為探討PPK在海分枝桿菌中的作用,我們通過基因同源重組技術(shù)構(gòu)建了海分枝桿菌ppk(MMAR_1730)基因的缺失突變株。通過壓力實(shí)驗(yàn)、耐藥性實(shí)驗(yàn)、巨噬細(xì)胞和斑馬魚感染實(shí)驗(yàn),對(duì)PPK在海分枝桿菌中的作用進(jìn)行了初步的探索。

材 料 和 方 法

菌株和質(zhì)粒 海分枝桿菌ATCCBAA-535(M菌株)由加拿大多倫多大學(xué)的劉軍教授饋贈(zèng);質(zhì)粒pPR27由法國巴斯德研究所Gicquel B教授惠贈(zèng);綠色熒光質(zhì)粒pTEC15由美國華盛頓大學(xué)Ramakrishnan L教授惠贈(zèng);pMV306由倫敦帝國學(xué)院的 Young D 教授饋贈(zèng)。

主要試劑和儀器 膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒(天根生化科技);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara 公司);Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國Varian 公司);熒光定量PCR儀CFX96(美國Bio-Rad 公司);Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國ThermoFisher公司)。

動(dòng)物和細(xì)胞 斑馬魚成魚于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)繁育飼養(yǎng)。小鼠來源巨噬細(xì)胞系RAW264.7購自中科院生化所。

細(xì)菌培養(yǎng) 大腸埃希菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)。海分枝桿菌培養(yǎng)基為Middlebrook 7H9肉湯培養(yǎng)基(液體)和Middlebrook 7H10瓊脂培養(yǎng)基(固體),32 ℃培養(yǎng)。必要時(shí)添加抗生素:卡那霉素40 μg/mL,潮霉素50 μg/mL,Rif 4 μg/mL,左氧氟沙星(lavo-ofloxacin,Levo)10 μg/mL。

海分枝桿菌ppk基因敲除突變株構(gòu)建 使用經(jīng)典的同源重組技術(shù),通過pPR27-wasabi質(zhì)粒進(jìn)行反向篩選,構(gòu)建海分枝桿菌ppk基因突變株。原有的pPR27質(zhì)粒帶有2個(gè)反向篩選標(biāo)記:sacB基因及1個(gè)分枝桿菌溫敏復(fù)制起點(diǎn)[20]。但是,海分枝桿菌最適生長溫度為32 ℃,無法在39 ℃高溫下存活,所以pPR27質(zhì)粒上的溫敏篩選并不適用于海分枝桿菌。因此,我們額外引入了wasabi綠色熒光蛋白來進(jìn)行敲除菌株的篩選。用引物wasabi_R/wasabi_F從pTEC15質(zhì)粒上擴(kuò)增wasabi片段,連接到pPPR27質(zhì)粒,構(gòu)建pPR27-wasabi質(zhì)粒。用引物MMppkKO Fw/MMppkKO Rv(表1)擴(kuò)增海分枝桿菌ppk基因及其兩端各約1 kb的同源區(qū)域,連接入T載體中,BglⅡ/PstⅠ酶切,去除ppk基因片段,并膠回收長片段,引物Hyg_Fw/Hyg_Rv PCR擴(kuò)增hyg基因片段,BglⅡ/PstⅠ酶切后連入上述長片段,將重組質(zhì)粒SpeI酶切得到含有ppk基因兩端同源臂及hyg基因的片段即為等位交換底物(allelic exchange substrate,AES)。將AES 連接入 pPR27_wasabi 質(zhì)粒(SpeI)中,電轉(zhuǎn)化入海分枝桿菌,涂布于潮霉素 B 抗性的 7H10-OADC 平板上,挑取單克隆培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,轉(zhuǎn)接后大量培養(yǎng),制備單細(xì)菌(約 5×106CFU),涂布于含10%蔗糖的潮霉素B抗性平板上;通過熒光顯微鏡進(jìn)行反向篩選,挑取無熒光單克隆進(jìn)行 PCR 鑒定。

表1 引物名稱和序列

海分枝桿菌ppk基因敲除互補(bǔ)株構(gòu)建 引物MMppkCO_Fw/ MMppkCO_Rv擴(kuò)增包含ppk基因編碼序列及其上下游序列在內(nèi)的DNA 片段,PCR產(chǎn)物純化,回收后的DNA片段及質(zhì)粒pMV306分別使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切,回收后連接,轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌 DH5α并抽提質(zhì)粒。抽提的質(zhì)粒經(jīng)過 PCR鑒定正確后再進(jìn)行測(cè)序鑒定。鑒定正確后分別電轉(zhuǎn)化進(jìn)入海分枝桿菌,構(gòu)建海分枝桿菌ppk基因敲除互補(bǔ)株。

海分枝桿菌胞內(nèi)poly-Pi檢測(cè) 收集海分枝桿菌,使用100 mmol/L的Tris鹽酸緩沖液(pH=7.4)洗滌3次后重懸細(xì)菌,使用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量(海分枝桿菌懸液D600值不低于0.2)。EP管中加入2 mL細(xì)菌懸液,再加入1 mmol/L的DAPI溶液20 μL,使其終濃度為10 μmol/L,即刻用錫箔紙包裹,避光混勻5 min;立刻加入干凈的透明比色皿,置于熒光分光光度計(jì)中進(jìn)行測(cè)量,系統(tǒng)自動(dòng)記錄450～650 nm每1.0 nm的發(fā)射光值。選取550 nm處記錄值,與測(cè)量菌液的D600進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后,即可得到每1.0單位D600的菌胞內(nèi)poly-Pi的相對(duì)量。

體外H2O2壓力實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌于7H9-OADC培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期(D600=0.5～1.0),常溫下10 528×g離心5 min,收集細(xì)菌并用玻璃珠震蕩打散成單細(xì)菌,PBS洗滌2次后調(diào)整D600至0.3,以終濃度為 10 mmol/L H2O2處理2 h,同時(shí)設(shè)置未處理對(duì)照組,對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鋪板計(jì)數(shù),比較野生株及突變株對(duì)H2O2的敏感性。

體外營養(yǎng)缺陷實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌于7H9-OADC培養(yǎng)基中32 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期(D600=0.5～1.0),常溫下10 528×g離心5 min,收集細(xì)菌并用玻璃珠震蕩打散成單細(xì)菌,使用PBS-Tween 80洗滌細(xì)菌3次后,重懸于PBS-Tween 80,將單細(xì)菌懸液的D600值調(diào)整至0.1,按1∶10稀釋至0.01。將細(xì)菌懸液移入透氣培養(yǎng)瓶中,32 ℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(100 r/min)。并于2、4、6天后收集100 μL細(xì)菌懸液,鋪板計(jì)數(shù)。

體外十二烷基硫酸鈉實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌于7H9-OADC培養(yǎng)基中32 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期(D600=0.5～1.0),常溫下10 528×g離心5 min,收集細(xì)菌并用玻璃珠震蕩打散成單細(xì)菌,將單細(xì)菌懸液的D600值調(diào)整至0.02和0.002,分別吸取5 μL菌液懸滴于含有0.02%十二烷基硫酸鈉(SDS)的7H10-OADC平板上,于32 ℃培養(yǎng)7天,觀察菌落形態(tài)。

海分枝桿菌的藥敏實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌于7H9-OADC培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期(D600=0.5～1.0),常溫下10 528×g離心5 min,收集細(xì)菌并用玻璃珠震蕩打散成單細(xì)菌,調(diào)整D600至 0.1,加入Rif(終濃度分別為4和10 μg/mL),Levo處理,32 ℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(100 r/min)。分別于處理3、7天后收集100 μL細(xì)菌懸液,鋪板計(jì)數(shù)。

斑馬魚成魚腹腔注射感染 制備海分枝桿菌單細(xì)菌,將菌液稀釋到1×106CFU/mL。成年斑馬魚用0.02%的三卡因溶液麻醉3～5 min。使用無菌HPLC 級(jí)微量進(jìn)樣器注射,每條魚10 μL菌液,即1×104CFU,于泄殖腔附近行腹腔注射;對(duì)照組注射相同體積PBS。觀察感染后不同時(shí)間點(diǎn)的斑馬魚存活狀況。

海分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖檢測(cè) 小鼠來源巨噬細(xì)胞系RAW264.7采用含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、0.5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰酶消化細(xì)胞,計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整濃度為105/mL。將上述細(xì)胞懸液加入24 孔培養(yǎng)板中(1 mL/孔),37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h,使單層細(xì)胞貼于板壁上即可應(yīng)用于侵染實(shí)驗(yàn)。制備單細(xì)胞懸液,每孔加入1 mL上述菌液,共培養(yǎng)4 h(MOI=1)。在指定時(shí)間點(diǎn)去除培養(yǎng)基,每孔加入0.1 mL 0.1%Triton X-100,于32 ℃培養(yǎng)箱中孵育15 min,裂解細(xì)胞,胞內(nèi)的細(xì)菌用無菌PBS梯度稀釋并鋪板,于32 ℃培養(yǎng),進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad 5.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,差異顯著性采用雙側(cè)t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

ppk在分枝桿菌中的序列保守度分析 在海分枝桿菌中,ppk基因由MMAR_1730編碼。通過生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn),MMAR_1730與結(jié)核分枝桿菌Rv2984(ppk1)和恥垢分枝桿菌MSMEG_2391(ppk1)高度同源,其氨基酸序列一致性分別為 89%和94%(圖1),提示ppk基因在分枝桿菌中高度保守,因此海分枝桿菌ppk基因很有可能與結(jié)核分枝桿菌ppk1發(fā)揮相似的功能。

海分枝桿菌ppk基因的敲除與鑒定 為了研究海分枝桿菌中ppk基因的功能及poly-Pi的調(diào)控方式,我們使用經(jīng)典的同源重組技術(shù),通過 pPR27-wasabi質(zhì)粒進(jìn)行反向篩選,構(gòu)建海分枝桿菌ppk基因的敲除菌株。抽提基因組,用ppk敲除鑒定引物1和2進(jìn)行PCR驗(yàn)證(表1),敲除成功的菌株ppk基因內(nèi)插入了Hygromycin抗性基因(圖2A),經(jīng)PCR及測(cè)序驗(yàn)證后證明海分枝桿菌ppk突變株構(gòu)建成功(圖2B),繼續(xù)構(gòu)建ppk基因敲除互補(bǔ)株。使用DAPI-poly-Pi染色法檢測(cè)細(xì)菌胞內(nèi)poly-Pi水平,結(jié)果顯示ppk突變株胞內(nèi)poly-Pi濃度下降至約15% (P<0.01,Student′st檢驗(yàn),圖2C),證明PPK在海分枝桿菌中與ploy Pi的合成相關(guān),敲除ppk基因后ploy Pi的濃度明顯降低。

ppk基因缺失對(duì)壓力環(huán)境下細(xì)菌生存的影響 已知poly-Pi能作為信號(hào)分子參與細(xì)菌對(duì)環(huán)境壓力的應(yīng)激性應(yīng)答[18-19]。為了研究海分枝桿菌ppk基因缺失是否影響細(xì)菌在壓力環(huán)境下的生存,我們分別檢測(cè)了突變株在H2O2處理和營養(yǎng)缺陷狀態(tài)下的生存能力,及其對(duì)細(xì)胞壁裂解劑SDS的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變株經(jīng)10 mmol/L H2O2處理2 h后的生存能力較野生株無顯著差異(圖3A);在PBS模擬的營養(yǎng)缺陷環(huán)境中培養(yǎng)6天后,突變株的生存率下降了 60%,而野生株未見明顯下降。在Δppk菌株中互補(bǔ)該蛋白使表型差異得以恢復(fù)(圖3B)。在含有0.02% SDS的平板上,突變株失去了生長的能力,野生株仍然可以正常生長并形成完整的菌落形態(tài)(圖3C)。以上結(jié)果說明PPK對(duì)于海分枝桿菌在營養(yǎng)缺陷和細(xì)胞壁壓力環(huán)境下的生存十分重要。

ppk基因缺失增強(qiáng)海分枝桿菌的藥敏性 結(jié)核分枝桿菌poly-Pi的累積被認(rèn)為與藥物的耐受性相關(guān)[19]。為了證實(shí)這一點(diǎn),我們將海分枝桿菌野生株、ppk突變株及互補(bǔ)株分別用Rif和Levo處理。結(jié)果顯示(圖4):用Rif及Levo處理3天后,突變株菌量下調(diào)至20%;用Rif處理7天后,突變株菌量下調(diào)至10%;用Levo處理7天后,突變株菌量下調(diào)至6%。這些結(jié)果說明ppk基因的缺失使海分枝桿菌對(duì)某些藥物更加敏感。

ppk基因缺失對(duì)海分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖的影響 為了進(jìn)一步研究ppk基因的缺失是否影響分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活,我們分別用野生株、突變株和互補(bǔ)株感染小鼠來源的巨噬細(xì)胞株 RAW264.7,CFU鋪板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,ppk基因缺失使突變株無法在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖,而互補(bǔ)株使表型差異得以全部恢復(fù)(圖5)。由此提示PPK對(duì)于海分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖是必需的。

ppk基因突變株在斑馬魚模型中呈現(xiàn)減毒表型為了進(jìn)一步研究ppk基因?qū)λ拗鞯闹虏∽饔?我們分別用1×104CFU劑量的野生株、突變株及互補(bǔ)株分別感染斑馬魚模型,比較不同菌株的毒力。結(jié)果顯示,在感染的25天內(nèi),對(duì)照組(PBS)及突變株組斑馬魚沒有出現(xiàn)死亡,而被野生株及互補(bǔ)株感染的斑馬魚在1周后逐漸出現(xiàn)活力降低、腹部腫脹等癥狀,直至死亡。斑馬魚生存曲線如圖6所示,可見野生株和互補(bǔ)株感染的斑馬魚分別從第10天和第11天開始死亡,而被突變株感染的斑馬魚直至觀察結(jié)束沒有出現(xiàn)死亡。這一結(jié)果說明ppk基因?qū)τ诤７种U菌的致病十分重要。

A:Schematic representation of MT strains.The region containingppkhas been replaced by the hygromycin cassette allelic exchange substrate.B:The PCR result using WT and MT as the template and usingppkPR1 andppkPR2 as the primer.C:Measurement of intracellular poly-Pi inM.marinum.Poly-Pi concentration was determined by the fluorescence emission of DAPI-poly-Pi complex at 550 nm.AU:Arbitrary fluorescence emission units;WT:Wild type;MT:Mutant type.(1)P<0.01.

圖2 海分枝桿菌ppk突變株構(gòu)建及鑒定

Fig 2 The construction and identification ofppkmutant inM.marinum

A:Survival of WT,MT and complement strain after exposure to H2O2.Aliquots (1 mL) of culture atD600of 0.3 were exposed to PBS(control) or 10 mmol/L H2O2for 2 h at 32 ℃.The cultures were serially diluted and plated onto 7H10+OADC plates and the colonies counted after 7-10 days of incubation at 32 ℃ (P>0.05).B:WT,MT and complement strain were grown in PBS for 7 days at 32 ℃.Mycobacteria CFUs were determined at the indicated time points.Data were generated from 3 independent experiments.(1)P<0.05,Student’sttest.C:The growth of WT,MT and complement strain on 7H9+OADC agar with or without 0.01% SDS were visualized after 7-10 days of incubation.WT:Wild type;MT:Mutant type.

圖3 海分枝桿菌對(duì)壓力環(huán)境的敏感性

Fig 3 The sensitivity ofM.marinumto external stress

Different strains were grown atD600of 0.1.These cultures were diluted and exposed to Rif (4 μg/mL) and Levo (10 μg/mL) for 3 or 7 days at 32 ℃.The percentage of survival was measured in the culture after incubation with the drug relative to it before the addition of drug.Data were generated from 3 independent experiments.(1)P<0.05;(2)P<0.01.

圖4 海分枝桿菌的藥敏性

Fig 4 Drug tolerance ofM.marinum

討 論

RAW 264.7 cells were co-cultured with WT,MT and complement strain at an MOI of 1 for 4 h at 32 ℃.Data were generated from 3 independent experiments.(1)P<0.01,(2)P<0.001 (Student’sttest).

圖5 海分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存情況

Fig 5 Intracellular survival ofM.marinumin macrophage

The zebrafish were infected with WT,mutant,complent strain and PBS by intraperitoneal injection (for each group,n=30).The injection dose was about 1×104CFU per fish.

圖6 斑馬魚感染海分枝桿菌后的生存曲線

Fig 6 Survival curve of the zebrafish infected withM.marinum

在本研究中,海分枝桿菌ppk基因缺失后,細(xì)菌在營養(yǎng)缺陷環(huán)境中的生存能力顯著下降,對(duì)Rif和Levo更加敏感。這說明poly-Pi在細(xì)菌對(duì)環(huán)境壓力的應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用。我們還發(fā)現(xiàn)ppk突變株在巨噬細(xì)胞中的增殖被抑制,在斑馬魚感染模型上呈現(xiàn)完全減毒表型,這些都提示ppk基因?qū)Ψ种U菌的致病非常重要。

在結(jié)核桿菌中的研究表明,poly-Pi的缺失導(dǎo)致“應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)子”——ppGpp合成基因relA的表達(dá)下調(diào)和ppGpp含量降低[3],而ppGpp為細(xì)菌應(yīng)答饑餓環(huán)境刺激所必需的物質(zhì)。在大腸埃希菌中的研究表明,在營養(yǎng)缺陷環(huán)境下poly-Pi可以和蛋白酶體Lon結(jié)合,促進(jìn)蛋白質(zhì)降解,產(chǎn)生氨基酸來應(yīng)對(duì)營養(yǎng)缺陷[6]。在海分枝桿菌中,poly-Pi的缺失可能也是通過這些途徑導(dǎo)致突變株在這一環(huán)境下生存能力下降。

本研究結(jié)果顯示,海分枝桿菌ppk基因敲除株對(duì)SDS更敏感。Sureka等[18]在結(jié)核分枝桿菌的研究中發(fā)現(xiàn),SDS處理組與非處理組相比,胞內(nèi)的poly-Pi濃度也顯著增高,敲除結(jié)核分枝桿菌ppk1基因,細(xì)菌對(duì)SDS更敏感。結(jié)核分枝桿菌relA基因突變引起眾多細(xì)菌細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)改變,提示分枝桿菌的應(yīng)激反應(yīng)與細(xì)胞壁的重塑性有關(guān)[21]。代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)poly-Pi水平失衡導(dǎo)致脂肪酸合成降低,提示poly-Pi在調(diào)控細(xì)菌細(xì)胞壁合成中發(fā)揮重要作用[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)海分枝桿菌ppk基因敲除菌株對(duì)Rif和Levo更加敏感,說明poly-Pi對(duì)于細(xì)菌應(yīng)對(duì)抗生素壓力非常重要。Singh等[19]用Rif、Levo、慶大霉素處理結(jié)核分枝桿菌,發(fā)現(xiàn)與非處理組相比,ppk基因的表達(dá)顯著上調(diào),胞內(nèi)poly-Pi濃度顯著增高。由此說明,ppk1基因缺失后,細(xì)菌對(duì)Rif、異煙肼、Levo等抗生素也更加敏感。對(duì)銅綠假單胞菌的研究發(fā)現(xiàn),ppk基因缺失后細(xì)菌也對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素更加敏感。poly-Pi的累積可能誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入低代謝狀態(tài),而代謝不活躍的細(xì)菌更容易在體內(nèi)形成耐藥性。突變株則可能因?yàn)閜oly-Pi的減少而改變細(xì)菌的代謝水平,因此更易被藥物清除。

在結(jié)核分枝桿菌中,PPK1的缺失引起細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)生長缺陷以及在豚鼠感染模型上的毒力顯著減弱。本研究發(fā)現(xiàn)海分枝桿菌ppk基因突變株在巨噬細(xì)胞中的增殖被抑制,在斑馬魚感染模型上呈現(xiàn)完全減毒表型,提示ppk基因?qū)Ψ种U菌的致病非常重要。但是對(duì)于ppk基因的功能及其影響毒力的具體機(jī)制,目前尚不清楚。有研究顯示poly-Pi調(diào)控細(xì)菌細(xì)胞壁合成[22],由此推測(cè)ppk基因缺失可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)宿主的某些殺傷機(jī)制更加敏感。

綜上所述,本研究證實(shí)了ppk對(duì)于海分枝桿菌在壓力環(huán)境下的生存具有重要作用,poly-Pi降低則細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性增加,并且與細(xì)菌的毒力減弱相關(guān),這些結(jié)果都揭示了poly-Pi與分枝桿菌持續(xù)性感染之間的聯(lián)系。ppk缺失引起的poly-Pi水平下降有可能改變ATP水平、NAD+/NADH比值及細(xì)菌的氧化還原狀態(tài),這些都與細(xì)菌的持續(xù)性感染相關(guān),在此基礎(chǔ)上還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究去探索poly-Pi在細(xì)菌生理和持續(xù)性感染中的作用。

[1] CORBETT EL,WATT CJ,WALKER N,etal.The growing burden of tuberculosis:global trends and interactions with the HIV epidemic[J].ArchInternMed,2003,163(9):1009-1021.

[2] KORNBERG A,RAO NN,AULT-RICHé D.Inorganic polyphosphate:a molecule of many functions[J].AnnuRevBiochem,1999,68:89-125.

[3] TRAXLER MF,SUMMERS SM,NGUYEN HT,etal.The global,ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation inEscherichiacoli[J].MolMicrobiol,2008,68(5):1128-1148.

[4] POTRYKUS K,CASHEL M.(p)ppGpp:still magical?[J].AnnuRevMicrobiol,2008,62(1):35-51.

[5] SHIBA T,TSUTSUMI K,YANO H,etal.Inorganic polyphosphate and the induction of rpoS expression[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,94(21):11210-11215.

[6] KURODA A,NOMURA K,OHTOMO R,etal.Role of inorganic polyphosphate in promotingribosomal protein degradation by the Lon protease inE.coli[J].Science,2001,293(5530):705-708.

[7] KIM KS,RAO NN,KORNBERG A,etal.Inorganic polyphosphate is essential for long-term survival and virulence factors in Shigella and Salmonella spp[J].ProcNatlAcadSciUSA,2002,99(11):7675-7680.

[8] KURODA A,TANAKA S,IKEDA T,etal.Inorganic polyphosphate kinase is required to stimulate protein degradation and for adaptation to amino acid starvation inEscherichiacoli[J].ProcNatlAcadSciUSA,1999,96(25):14264-14269.

[9] CHEN W,PALMER RJ,KURAMITSU HK.Role of polyphosphate kinasein biofilm formation byPorphyromonasgingivalis[J].InfectImmun,2002,70(8):4708-4715.

[10] GHORBEL S,SMIRNOV A,CHOUAYEKH H,etal.Regulation of ppk expression and in vivofunction of Ppk in Streptomyces lividansTK24[J].JBacteriol,2006,188(17):6269-6276.

[11] BROWN MR,KORNBERG A.The long and short of it-polyphosphate,PPK and bacterial survival[J].TrendsBiochemSci,2008,33(6):284-290.

[12] KORNBERG A.Inorganic polyphosphate:toward making a forgotten polymer unforgettable[J].JBacteriol,1995,177(3):491-496.

[13] RAO NN,LIU S,KORNBERG A.Inorganic polyphosphate inEscherichiacoli:the phosphate regulon and the stringent response[J].JBacteriol,1998,180(8):2186-2193.

[14] KURODA A,KORNBERG A.Polyphosphate kinase as a nucleoside diphosphate kinase inEscherichiacoliandPseudomonasaeruginosa[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,94(2):439-442.

[15] AHN K,KORNBERG A.Polyphosphate kinase fromEscherichiacoli.Purification and demonstration of aphosphoenzymeintermediate[J].JBiolChem,1990,265(20):11734-11739.

[16] ZHANG H,ISHIGE K,KORNBERG A.A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria[J].ProcNatlAcadSciUSA,2002,99(26):16678-16683.

[17] RAO NN,KORNBERG A.Inorganic polyphosphate supports resistance and survival of stationary-phaseEscherichiacoli[J].JBacteriol,1996,178(5):1394-1400.

[18] SUREKA K,DEY S,DATTA P,etal.Polyphosphate kinase is involved in stress-induced mprAB-sigE-relsignalling in mycobacteria[J].MolMicrobiol,2007,65(2):261-276.

[19] SINGH R,SINGH M,ARORA G,etal.Polyphosphate deficiency inMycobacteriumtuberculosisis associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs[J].JBacteriol,2013,195(12):2839-2851.

[20] PELICIC V,JACKSON M,REYRAT JM,etal.Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis inMycobacteriumtuberculosis[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,94(20):10955-10960.

[21] DAHL JL,KRAUS CN,BOSHOFF HI,etal.The role of RelMtb-mediated adaptation to stationary phase in long-term persistence ofMycobacteriumtuberculosisin mice[J].ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(17):10026-10031.

[22] CHUANG YM,BANDYOPADHYAY N,RIFAT D,etal.Deficiency of the novel exopolyphosphatase Rv1026/PPX2 leads to metabolic downshift and altered cell wall permeability inMycobacteriumtuberculosis[J].MBio,2015,6(2):e02428.

[23] FRALEY CD,RASHID MH,LE SS,etal.A polyphos-phate kinase 1 (ppk1) mutant of Pseudomonas aeruginosa exhibits multiple ultrastructural and functional defects[J].ProcNatlAcadSciUSA,2007,104(9):3526-3531.

The biological function of ppk gene in Mycobacterium marinum

ZHU Lin, SHI Xu-jun, GAO Qian△

(KeyLaboratoryofMedicalMolecularVirology,MinistryofEducationandHealth,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To construct theppkmutant inMycobacteriummarinum(M.marinum) and to investigate its role in the physiology. Methods Theppkmutant inM.marinumwas constructed by homologous recombination.Intracellular poly inorganic phosphate (poly-Pi) concentration was measured in cell suspensions by using a DAPI-based fluorescence approach.Theninvitrobacterial viability ofppkmutant type and the wild type strain was compared under different stress conditions.Furthermore,invivomycobacterial virulence was checked by infecting the adult zebrafish with mutant and wild type strain.And the intracellular growth ability was investigated by infection of the murine macrophage cell line RAW267.4. Results The intracellular poly-Pi concentration ofM.marinumwas significantly decreased after the deletion ofppkgene.In addition,theppkmutant displayed attenuated phenotype in the zebrafish model.In mice-derived macrophage cell line,the cell proliferation ofppkmutant type declined significantly compared with wild type.Moreover,theppkmutant type was more sensitive to nutrient starvation and antibiotic treatment,including rifampicin and levo-floxacin.Conclusions These results indicate thatppkis involved in stress response and required for mycobacterial virulence.

mycobacterium; polyphosphate kinase; poly inorganic phosphate

Q933

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.003

2016-01-21;編輯:段佳)

△Corresponding author E-mail:qgao99@yahoo.com