尹利方，陳澤斌, 2 *，夏體淵, 2 **，耿開友，趙 鳳，靳 松，李靜雯，牛燕芬

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214；3.昆明學(xué)院科研處，云南 昆明 650214)

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一株鐵皮石斛組織培養(yǎng)污染內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定

尹利方1，陳澤斌1, 2 *，夏體淵1, 2 **，耿開友3，趙 鳳3，靳 松1，李靜雯1，牛燕芬1

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214；3.昆明學(xué)院科研處，云南 昆明 650214)

對污染鐵皮石斛組培苗的內(nèi)生細(xì)菌進行分離和鑒定，為預(yù)防鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程中內(nèi)生細(xì)菌污染提供科學(xué)依據(jù)。采用NA培養(yǎng)基分離純化細(xì)菌，通過形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)結(jié)合16S rDNA序列同源性分析，對引起鐵皮石斛組培苗污染的內(nèi)生細(xì)菌進行鑒定。引起鐵皮石斛組培苗污染的內(nèi)生細(xì)菌為SH42菌株，其形態(tài)特征及生理生化指標(biāo)與莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)基本相同；16S rDNA序列分析結(jié)果表明，SH42與B.mojavensis(AM948970)聚在同一系統(tǒng)發(fā)育分支，其同源性為99.4 %。因此確定引起鐵皮石斛組培苗污染的內(nèi)生細(xì)菌SH42為莫海威芽孢桿菌。

鐵皮石斛；組織培養(yǎng)；內(nèi)生細(xì)菌；分離；鑒定

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)，為蘭科多年生附生草本植物。生于海拔1600 m的山地半陰濕的巖石上，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環(huán)境，不耐寒。石斛可分為黃草、金釵、馬鞭等數(shù)10種，鐵皮石斛為石斛之極品，鐵皮石斛因表皮呈鐵綠色而得名[1]。鐵皮石斛具有獨特的藥用價值，以其莖入藥，中藥名：石斛，屬補益藥中的補陰藥，《中國藥典》：益胃生津，滋陰清熱[2]。多年以來，商品石斛主要依靠野生藥用石斛資源，隨著藥用石斛開發(fā)利用的不斷深入和國內(nèi)外需求量的逐年增加，中國野生藥用石斛資源遭到了嚴(yán)重破壞，有些地區(qū)甚至面臨枯竭[3]。

鐵皮石斛的種子極為細(xì)小，胚胎發(fā)育不完全，缺乏胚乳組織，萌發(fā)率極低(不足5 %)，且自然條件下必須與蘭菌共生才能萌發(fā)。因此無法在大田或苗床上播種，很難生產(chǎn)足夠的實生苗用于栽培。鐵皮石斛對生長環(huán)境要求苛刻，成苗更困難。傳統(tǒng)的人工繁殖方式如分株、扦插等，繁殖速度慢，增殖率很低。因此對其進行人工種苗組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究是十分必要的[4]。但在植物組織培養(yǎng)過程中，普遍存在兩種類型的污染：一類是通常所說的污染，即外植體消毒不徹底，無菌操作和培養(yǎng)過程中，如：培養(yǎng)基、接種工具、接種室消毒不嚴(yán)格或操作不規(guī)范而導(dǎo)致的污染；另一類是內(nèi)生菌污染，內(nèi)生菌包括真菌和細(xì)菌，本研究探討的是內(nèi)生細(xì)菌所致的污染[5-6]。在鐵皮石斛組培快繁過程中，雖然對初代培養(yǎng)的外植體進行了嚴(yán)格的消毒滅菌，但10 d后發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)菌污染，污染率高達10 %以上，一旦被污染，菌苔很快布滿培養(yǎng)基表層及外植體的基部，大量消耗營養(yǎng)；外植體停止生長，逐漸枯萎死亡，嚴(yán)重影響組培苗的正常生長和繼代。

關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌在植物組織培養(yǎng)中引起污染的報道，如金線蓮(Anoectochilusroxburghii)組培中污染率達到50 %[7]，仙客來(Cyclamenpersicum)的塊莖組織內(nèi)生細(xì)菌污染率達83.0 %[8]，地黃(Rehmanniaglutinosa)由于有內(nèi)生細(xì)菌的存在污染率達100 %等[9]。從已有的報道看，被鑒定的種類主要有黃單胞菌屬(Xanthomonas)[10]、芽孢桿菌屬(Bacillus)、萄球菌屬(Staphylococcus)[11]、假單胞屬(Pseudomonas)[12]、土壤桿菌屬(Agrobacterium)[13]、葡腸桿菌屬(Enterobacter)、棒桿狀菌屬(Corynebacterium) 、沙雷氏菌屬(Serratia)、短小桿菌屬(Curtobacterium)[14]、歐文氏菌屬(Erwinia)[15-18]等。在組培苗內(nèi)生菌污染防治的相關(guān)報道中，多采用對外植體進行預(yù)處理，比如：黃化處理、熱擊、多次消毒、灼燒、酸化培養(yǎng)基、在培養(yǎng)基中加入抗生素，特別是抗生素的使用具有較好的效果[12]。本研究通過NA培養(yǎng)基分離純化內(nèi)生細(xì)菌，再通過形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)結(jié)合16S rDNA序列同源性分析，對1株引起鐵皮石斛組織培養(yǎng)污染的內(nèi)生細(xì)菌進行了鑒定，為后期鐵皮石斛組織培養(yǎng)污染的預(yù)防、無性繁殖技術(shù)體系的順利建立提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

污染的鐵皮石斛組培苗由昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實驗中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

內(nèi)生細(xì)菌分離和培養(yǎng)用NA培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，細(xì)菌DNA提取，16S rDNA片段擴增所用的各種酶、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為寶生物工程(大連)產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)菌的分離純化及保藏

挑取污染菌苔接種于NA培養(yǎng)基上進行劃線純化，挑取單菌落于試管斜面中4 ℃保存。

1.4 形態(tài)特征觀察及生理生化指標(biāo)的測定

參照文獻[19]進行芽孢染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。形態(tài)特征觀察及生理生化試驗參見《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]，主要測定項目包括培養(yǎng)性狀、菌體大小、甘露醇產(chǎn)酸、過氧化氫酶試、明膠液、酪蛋白水、苯丙氨酸脫氨、V-P反應(yīng)、厭氧生長、還原硝酸鹽、水解淀粉、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、葡萄糖產(chǎn)氣、利用葡萄糖、利用蔗糖、利用麥芽糖、利用D-山梨醇、利用乳糖、利用異戊醇、利用蛋白胨、利用牛肉浸膏、利用酵母浸膏、利用KNO3、利用氯化銨。

1.5 16S rDNA序列分析

用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0提取細(xì)菌基因組DNA，方法參見試劑盒說明書。PCR反應(yīng)體系(50 μl)組成：10×PCR緩沖液5 μl，dNTPs (10 mmol/L) 4 μl，引物F27/R1492[20](10 μmol/L) 2 μl，模板DNA (約50 g/L) 1 μl，Taq酶2.5 U，雙蒸水35.5 μl。PCR擴增按Sambrook方法進行[21]。擴增產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，送上海桑尼生物科技有限公司進行序列測定。將測得的16S rDNA全序列用EzTaxon Server version 2.1(http://www.ezbiocloud.net/)進行同源性搜索[22]，通過MEGA4.0進行比對，隨后選用Maximum Composite Likelihood距離模型進行UPGMA分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹用Bootstrap法(1000次重復(fù))檢驗。用Megalign軟件，將這些序列用Clustal W法進行多序列比對，建立系統(tǒng)發(fā)育進化距離圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征觀察

菌株SH42(圖1b)在NA培養(yǎng)基上呈乳白色不透明菌落，菌落卵狀，邊緣稍凸起，中間凹陷，表面干燥有褶皺，邊緣不整齊；芽孢直桿狀(圖2)，約2 μm。依據(jù)常見細(xì)菌鑒定手冊，生理生化指標(biāo)均與莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)特征相同(表1)。

a：被SH42污染的鐵皮石斛組培苗；b：SH42在NA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)a：Dendrobium candidum’s cultivation seedling polluted by the strain SH42; b：Colony morphologies of SH42 on NA culture medium圖1 菌株SH42的形態(tài)特征Fig.1 Morphology of strain SH42

圖2 SH42的芽孢染色(放大1000×)Fig.2 Spore morphologies of strain SH42 under light microscopy (magnification, 1000×)

生理生化指標(biāo)IndexesofphysiologyandbiochemistrySH42甘露醇產(chǎn)酸+過氧化氫酶試驗+明膠液化+酪蛋白水解-苯丙氨酸脫氨-V?P反應(yīng)+厭氧生長-還原硝酸鹽+水解淀粉+D?葡萄糖+L?阿拉伯糖+D?木糖+D?甘露醇+葡萄糖產(chǎn)氣-利用葡萄糖+利用蔗糖+利用麥芽糖+利用D?山梨醇+利用乳糖-利用異戊醇-利用蛋白胨+利用牛肉浸膏+利用酵母浸膏+利用KNO3-利用氯化銨-

2.2 16S rDNA序列分析

通過BankIt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank)將本研究所得序列SH42提交到Genbank數(shù)據(jù)庫中，登錄號為KP900948。將菌株SH42的16S rDNA與從GenBank中獲取與該菌株序列同源性較高的部分菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(表2、圖3)，該菌株與B.mojavensis(AM948970)聚在同一系統(tǒng)發(fā)育分支(圖3)。通過Megalign進行同源性比對發(fā)現(xiàn)，SH42與B.licheniformis(EF644414)同源性最高，達99.8 %，而與B.mojavensis(AM948970)同源性為99.4 %(圖4)；系統(tǒng)發(fā)育樹與系統(tǒng)發(fā)育進化距離表得出的結(jié)果不一致，但結(jié)合生理生化指標(biāo)分析，將SH42鑒定為B.mojavensis。

3 討 論

Leifert[23]等研究表明，在初代培養(yǎng)中，表面細(xì)菌引起的污染通常在2～3 d就能在外植體周圍的培養(yǎng)基表面形成明顯的水污狀、油污狀、氣泡或干縮的紅、黃、乳白等顏色的菌落；而在外植體培養(yǎng)后3～5 d后才出現(xiàn)的細(xì)菌菌落，則可能是由內(nèi)生細(xì)菌引起的污染。本研究在對鐵皮石斛組培苗污染情況調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)在外植體培養(yǎng)后3～5 d沒有細(xì)菌污染，而是在10 d后才出現(xiàn)的污染，所以推測可能是內(nèi)生細(xì)菌引起的污染。

表2 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的菌株相關(guān)信息

括號中的序號為Genbank登錄號；分支上的數(shù)字為自展值百分比；線段0.005為核酸替換率Genbank accession numbers were shown in the parentheses. The number at each branch point was the percentage supported by bootstrap. Bar: 0.0005 subsitutions per nucleotide position圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

圖4 系統(tǒng)發(fā)育進化距離Fig.4 Sequence distance of SH42 based on 16S rDNA full-length sequence

在組培內(nèi)生菌污染防治的研究中，在培養(yǎng)基中加入抗生素的方法已有報道。Reed等[24]在天竺葵(Pelargoniumhortorum)組培中發(fā)現(xiàn)頭孢噻肟(Cefotaxime Sodium)的抑菌效果良好，且對芽的增殖有促進作用。韓美麗[25]等在綠巨人(Spathiphyllumkochii)組培中研究了青霉素鈉、先鋒霉素和慶大霉素對繼代培養(yǎng)中細(xì)菌污染的抑制效果，結(jié)果表明先鋒霉素的抑菌效果最好，青霉素鈉和慶大霉素次之。本研究中16S rDNA序列分析和生理生化鑒定表明引起鐵皮石斛組培苗污染的細(xì)菌是莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)，屬于革蘭氏陽性菌，由于革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的特殊成分，使大多數(shù)革蘭氏陽性菌對青霉素敏感，因此，可以篩選出一部分既能抑制細(xì)菌生長但對植物的生長不產(chǎn)生影響的抗生素應(yīng)用于鐵皮石斛的組織培養(yǎng)。

從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)來看，SH42與B.mojavensis(AM948970)聚在同一系統(tǒng)發(fā)育分支，但從同源性比對來看，SH42與B.licheniformis(EF644414)同源性最高，達99.8 %，而與B.mojavensis(AM948970)同源性為99.4 %，結(jié)合生理生化指標(biāo)結(jié)果，最終將SH42鑒定為B.mojavensis。由此可見，基于16S rDNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究有一定的局限性，16S rDNA序列同源性更適用于屬以上分類單元，對于屬以下分類單元分辨率明顯低。在某些近緣種的鑒定中，如芽孢桿菌屬中解淀粉芽孢桿菌近緣種，很難精確確定它們的分類地位。因此只有有效地將細(xì)菌經(jīng)典分類學(xué)和現(xiàn)代分子分類學(xué)進行結(jié)合，將表型鑒定和分子生物學(xué)鑒定綜合分析才能得出更為可靠的結(jié)論。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Isolation and Identification of Pollution Endophytic Bacteria during Tissue Culture ofDendrobiumcandidum

YIN Li-fang1, CHEN Ze-bin1, 2 *, XIA Ti-yuan1, 2 **, GENG Kai-you3, ZHAO Feng3, JIN Song1, LI Jing-wen1, NIU Yan-fen1

(1.Agriculture College, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China;2.Engineering Research Center for Characteristics Agriculture of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China;3.Scientific Research Department, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China)

The advantaged endogenous bacteria, which caused contamination ofDendrobiumcandidumplantlets, was isolated and identified so as to provide scientific references for pollution prevention during its tissue culture. Using the NA culture medium to isolate the strain, the bacterial species were identified by morphology, biochemical and the sequence analysis of the 16S rDNA. The results from physiological and biochemical tests showed that the morphological characteristics of the strain SH42 matched the descriptions ofBacillusmojavensis. The sequence analysis of 16S rDNA indicated that this strain had the same embranchment with theB.mojavensis(AM948970) in the phylogenetic tree with the homology of 99.4 %. The SH42 strain was identified asB.mojavensis.

Dendrobiumcandidum; Tissue culture; Endophytic bacteria; Isolation; Identification

1001-4829(2016)08-1982-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.042

2015-03-26

云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心項目(TSNY0201)；國家自然科學(xué)基金項目(31460491)；云南省科技廳基礎(chǔ)研究項目(2013FD040)；云南省教育廳科學(xué)研究項目(2014Y390)；昆明學(xué)院大學(xué)生科研項目(XJD16081)；昆明學(xué)院“人才引進項目”(YJL14005)；云南省高校優(yōu)勢特色重點學(xué)科(生態(tài)學(xué))建設(shè)項目(05000511311)

尹利方(1981-)，女，云南昆明人，碩士，講師，主要從事都市農(nóng)業(yè)的教學(xué)科研工作，E-mail: 563454379@qq.com，*為共同第一作者，**為通訊作者，E-mail: xiatiyuan@sohu.com。

S182

A