孫嘉曼，尹 玲，張進忠，韋紹龍，李朝生，劉金成，盧 江*

(1.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室,廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,廣西 南寧 530007)

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廣西香蕉種質(zhì)資源的SSR分析

孫嘉曼1，尹 玲1，張進忠2，韋紹龍2，李朝生2，劉金成1，盧 江1*

(1.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室,廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,廣西 南寧 530007)

研究廣西特色香蕉種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為香蕉種質(zhì)資源分類、品種鑒定和有效利用提供理論參考。采用13對SSR熒光標(biāo)記引物，對收集到的24份廣西主栽香蕉品種及特色種質(zhì)資源進行擴增，采用毛細(xì)管電泳對其進行基因分型。共擴增得到131個等位基因，平均每對引物擴增得到10.1個等位基因。引物的多態(tài)性信息含量(PIC)為0.65～0.87，平均0.77。在相似系數(shù)0.85附近，24個香蕉品種劃分為4個大類：第一大類包含栽培種的香牙蕉和廣西各地區(qū)的野生近緣種，第二大類為大蕉，第三大類為粉蕉，第四大類為貢蕉。從收集到的野生資源中篩選與栽培種親緣關(guān)系較近、且具有良好抗病性的品種，可作為抗病育種的中間材料，并從分子角度入手挖掘優(yōu)良的基因加以應(yīng)用。

香蕉；SSR標(biāo)記；指紋圖譜；廣西

香蕉屬芭蕉科(Musaceae)芭蕉屬(Musa)單子葉植物，是著名的亞熱帶水果，也是熱帶地區(qū)的主要糧食作物[1]。香蕉栽培品種是由尖葉蕉(記為A基因組)和長梗蕉(記為B基因組)這兩個野生蕉的種內(nèi)或種間雜交后進化而成，多為三倍體[2]。除三倍體外，還有少量的二倍體和四倍體品種(系)。當(dāng)前，香蕉枯萎病是阻礙香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展主要的問題。由于栽培品種香蕉的三倍體特性、不育性以及目前抗性材料的匱乏，應(yīng)用傳統(tǒng)的雜交育種方法進行品種創(chuàng)新的難度較大，雜交抗病育種進展緩慢，取得的成功有限。生產(chǎn)中栽培的大多數(shù)香蕉品種都是通過體細(xì)胞無性系變異獲得的，無性繁殖并未引起基因多樣性的變化。由于香蕉品種的規(guī)?；蛦我换N植，導(dǎo)致遺傳多樣性減少，品種的抗逆性不斷下降。如不引入外源野生型或其他基因型香蕉的基因，或很難通過自身或者傳統(tǒng)育種的方法增加其基因多樣性。

廣西是全國重要的香蕉產(chǎn)區(qū)及優(yōu)質(zhì)香蕉貨源地，香蕉種植面積占全國29 %，產(chǎn)量占廣西水果總產(chǎn)量的三分之一，重點產(chǎn)區(qū)的香蕉生產(chǎn)已成為當(dāng)?shù)氐闹饕r(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)。目前廣西的主栽香蕉品種為Williams品系的“桂蕉1號”和“桂蕉6號”，其他蕉類有少量種植。另外，廣西具有豐富的野生蕉類資源，分布在桂林、憑祥、防城等地。面對繁多的品種資源，利用傳統(tǒng)的形態(tài)特征進行分類鑒定具有一定的局限性[3]。結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)對香蕉種質(zhì)資源進行品種鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性等研究尤為必要。從眾多的香蕉種質(zhì)資源中挖掘遺傳多樣性高、具有良好抗逆性的品種加以利用，成為香蕉抗病育種的途徑之一。

SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記，又稱微衛(wèi)星分子標(biāo)記(Microsatellite，MS)，是目前最常用的分子標(biāo)記之一。SSR標(biāo)記原理簡單，具有高度的多態(tài)性、共顯性遺傳、引物公開且易獲得、試驗重復(fù)性高、操作簡單、易于分析等優(yōu)點[4-6]。SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于香蕉種質(zhì)資源的品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建及親緣關(guān)系分析等[7-10]。

本研究選用已開發(fā)的SSR熒光標(biāo)記引物，對收集及誘變育種獲得的廣西香蕉種質(zhì)資源共24個樣品進行擴增，利用毛細(xì)管電泳技術(shù)對擴增產(chǎn)物進行分離，從分子水平上闡明這些香蕉品種之間的親緣關(guān)系，進行品種間遺傳改良，可為評價香蕉種質(zhì)資源的親緣關(guān)系提供理論依據(jù)，對培育香蕉抗病品種、防控香蕉枯萎病乃至促進香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試香蕉材料主要由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供，部分材料采集自廣西各市縣(表1)。選取生長健壯植株的健康幼嫩葉片，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 用于SSR分析的香蕉品種

1.2 基因組DNA提取

采用CTAB法[11]提取葉片DNA，具體步驟如下：取適量嫩葉加入液氮快速研磨成粉，取0.1 g于2 mL離心管中；加入700 μl CTAB提取緩沖液[2 % CTAB，20 mmol·L-1EDTA，1.4 mol·L-1NaCl，100 mmol·L-1Tris-HCl buffer(pH 8.0)]，搖勻，60 ℃水浴30 min；加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，13 000 g，4 ℃離心5 min，轉(zhuǎn)移上清；上清液加1 μl RNA酶37 ℃反應(yīng)1 h；再加入氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1遍；加入等體積預(yù)冷異丙醇，-20 ℃下沉淀2 h，離心，去上清；沉淀用70 %乙醇清洗2～3次；用滅菌的ddH2O溶解DNA。

1.3 SSR引物選擇

從已報道[7,12]的一些香蕉品種鑒定或指紋圖譜構(gòu)建的引物中選擇多態(tài)性較高的13對引物用于試驗，引物序列見表2。所有正向引物5’端使用熒光標(biāo)記。引物AGMI35/36、AGMI121/122、AGMI123/124、ITBB01使用5’-HEX(六氯熒光素)標(biāo)記；其余引物使用5’-FAM(羥基熒光素)標(biāo)記。所有供試引物交由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR擴增

PCR擴增反應(yīng)體系總體積為20 μl，包含2 μl 10×PCR Buffer、0.2 mmol/L dNTP、10 μmol·L-1正反向引物各2 μl、3 ng/μl DNA模板和0.05 U/μlTaq酶。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物4 ℃保存。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳及毛細(xì)管電泳

用2 %(w)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增結(jié)果并保存圖像，確定PCR反應(yīng)是否成功。將擴增成功的PCR產(chǎn)物進行純化，取1 μl純化后產(chǎn)物，加入0.5 μl分子量內(nèi)標(biāo)和8.5 μl甲酰胺，置于96孔板中；95 ℃變性5 min，用ABI 3730XL進行上機檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析

參照尹玲等[13]的方法，利用GeneMapper v3.2軟件分析產(chǎn)物大小，分析結(jié)果以Excel表的形式導(dǎo)出。根據(jù)毛細(xì)管電泳檢測的峰圖和每個峰值的大小，對供試24份香蕉種質(zhì)材料的基因型數(shù)據(jù)進行判讀與整理，建立不同品種的分子標(biāo)記圖譜[14]。采用NTSYS2.1[15]軟件計算遺傳距離，然后用非加權(quán)對群數(shù)學(xué)平均法(UPGMA)進行聚類分析，建立樹狀聚類圖，分析各樣本之間的親緣關(guān)系。

表2 SSR引物

表3 13對引物擴增出的等位基因數(shù)量及多態(tài)性信息含量

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴增結(jié)果多態(tài)性分析

供試的13對引物擴增條帶清晰且特異，表現(xiàn)出高度的多態(tài)性。每對引物擴增出的等位基因數(shù)量及多態(tài)性信息含量如表3所示。供試的24份香蕉材料中共擴增得到131個等位基因，平均每對引物擴增得到10.1個等位基因。引物的多態(tài)性信息含量(PIC)為0.65～0.87，平均0.77。其中，引物AGMI123/124擴增得到的等位基因數(shù)目最多，可以檢測到17個等位基因；引物AGMI35/36、ITBB02和ITBB05擴增得到的等位基因均為最少(7個)。

2.2 DNA指紋圖譜

二倍體野生蕉的基因型在毛細(xì)管電泳峰圖中表現(xiàn)為明顯的單峰，而主栽的三倍體品種則表現(xiàn)為三峰。“桂蕉6號”、“桂蕉9號”、“巴西蕉”在ITBB01位點上的帶型相同，為148∶151∶154；而在AGMI123/124位點上，“桂蕉6號”、“桂蕉9號”的帶型一致為278∶300∶354，“巴西蕉”的則為298∶300∶336∶338。這些指紋圖譜為香蕉品種鑒定提供了很好的依據(jù)。

2.3 香蕉品種的親緣關(guān)系分析

對13對引物的擴增結(jié)果進行統(tǒng)計，根據(jù)各香蕉品種之間的相似系數(shù)，對所有品種進行聚類分析，聚類結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，在相似系數(shù)0.85附近，可將供試24個香蕉品種分為4大聚類組。

第一大類：共有21個品種。第一大類可進一步分為4個組。其中第Ⅰ組包括“桂蕉1號”、“桂蕉6號”、“桂蕉9號”、T1-1、T1-2、T1-3、T1-4、T1-5、Williams突變體(Williams-M1)。這些都是AAA基因組的香牙蕉。第Ⅱ組包括防城二倍體、桂林二倍體、WB-M1、WB-M2、WB-M3、WB-M4、WB-M5、“巴西蕉”、M-hd1、M-hd2。其中WB-M1、WB-M2、WB-M3、WB-M4、WB-M5是由防城二倍體誘導(dǎo)突變產(chǎn)生的突變體。從圖1中可以看出，這幾個品種都聚在一起。WB-M5相比較其他幾個突變體，與防城二倍體(WB-FC)的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，而WB-M2與WB-FC的親緣關(guān)系最近。憑祥二倍體(WB-PX)(AA)為第Ⅲ組，采集自廣西靖西縣的土蕉(Tujiao)為第Ⅳ組。

第二大類是從廣西象州采集的大蕉(ABB)品種。第三大類是粉蕉品種金粉1號(ABB)。第四大類是貢蕉(AA)。

3 結(jié)論與討論

本研究應(yīng)用已開發(fā)的13對SSR引物對24個香蕉品種的基因組DNA進行擴增，共擴增得到131個等位基因。通過基于SSR數(shù)據(jù)的樹狀聚類分析，將廣西的24份香蕉種質(zhì)分為4類，這與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致。Ning等[12]利用SSR標(biāo)記對NBGCC收集的香蕉種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析；王靜毅等[16]采用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了部分香蕉品種的分子指紋圖譜，為香蕉品種鑒定提供依據(jù)；余智城等[17]應(yīng)用植株形態(tài)特征和SSR分子標(biāo)記，將選育的13份優(yōu)良三倍體材料與漳州地區(qū)主栽品種共20份材料進行遺傳多樣性比較分析。本研究的結(jié)果與這些報道一致。

圖1 香蕉品種基于SSR的樹狀聚類分析Fig.1 Dendrogram of banana cultivars based on SSR markers

本研究結(jié)果表明，聚為第一大類的種質(zhì)資源包含了栽培種的香牙蕉類和從廣西各地收集的野生近緣種，栽培的三倍體品種與野生二倍體的親緣關(guān)系較近。由此，可以從收集到的野生資源中篩選與栽培種親緣關(guān)系較近、且具有良好抗病性的品種，作為抗病育種的中間材料，從分子角度入手挖掘優(yōu)良的基因并加以應(yīng)用。然而，M-hd1與M-hd2，T1-2、T1-3、T1-4與T1-5是通過無性系變異篩選獲得的，相互之間的差異很小，這些品種相似性為100 %的結(jié)果也表明，這些SSR位點不能將Cavendish亞組的品種完全區(qū)分開。

由于香蕉傳統(tǒng)雜交育種的難度較大，目前針對香蕉產(chǎn)業(yè)中危害嚴(yán)重的枯萎病問題，國內(nèi)香蕉育種工作都把重點放在從AAA基因型的品系中篩選新的抗性突變體。許多新選育的香蕉品種都是香牙蕉類，其遺傳基礎(chǔ)狹窄，遺傳多樣性相對較低，目前已開發(fā)的SSR引物在鑒別AAA基因型尤其是Cavendish亞組的品種方面表現(xiàn)出一定的局限性，這與Ning等[12]的研究結(jié)果一致。可以探索用其他分子標(biāo)記技術(shù)開展相關(guān)研究，為近似品種的鑒定提供理論依據(jù)和參考。

相對于AAA基因型的品種，含有B基因組的品種及AA型的品種具有較高的遺傳多樣性，這些品種可以作為未來香蕉抗性育種的豐富資源。也可以從這些品種中開發(fā)新的SSR標(biāo)記，對香蕉種質(zhì)資源進行分類，對形態(tài)學(xué)分類和鑒定的局限性進行補充，從而完善和豐富香蕉品種的數(shù)據(jù)庫。

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(責(zé)任編輯 溫國泉)

SSR Analysis of Banana Cultivars/Accessions in Guangxi

SUN Jia-man1, YIN Ling1, ZHANG Jin-zhong2,WEI Shao-long2, LI Chao-sheng2, LIU Jin-cheng1, LU Jiang1*

(1. Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Key Lab, Guangxi Nanning 530007, China; 2. Institute of Biotechnology of Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007, China)

The genetic relationship of banana germplasm in Guangxi was defined to provide references for classification, identification and utilization of banana. 24 banana cultivars and wild germplasm collections were analyzed with SSR markers. Twenty-four banana cultivars/accessions were genotyped with 13 pairs of fluorescence labeled SSR primers by capillary electrophoresis. We amplified 131 alleles, with the average of 10.1 alleles for each primer amplification. The polymorphism information content(PIC) was 0.65-0.87(average value of 0.77). Twenty-four banana cultivars/accessions were grouped into 4 clusters based on the similarity coefficient of 0.85. The first group includesMusaAAA Cavendish and wild relatives of banana collected from Guangxi.The second group is plantain, and the other two groups are dwarf banana andMusaAA Pisang, respectively. The good disease-resistance varieties, which had close genetic relationship with cultivated varieties, would be selected from wild germplasm and be used as the middle materials of disease-resistant breeding. From these varieties good genes could be explored and utilized.

Banana；SSR marker；DNA fingerprint；Guangxi

1001-4829(2016)08-1952-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.036

2016-04-20

廣西自然科學(xué)基金項目(2015GXNSFDA139014)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金(2015JZ07)；廣西八桂學(xué)者專項經(jīng)費項目([2013]3號)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目(nycytxgxcxtd-04-18)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項項目(2015YT53)

孫嘉曼(1986-)，女，陜西咸陽人，博士，助理研究員，主要從事植物功能基因組和分子育種研究，E-mail：jiamansun@hotmail.com,*為通訊作者，E-mail：jiang.lu.cau@gmail.com。

S668.1

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