王彥輝，杜良偉，李紅紅，封國(guó)君，羅 韜

(1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧 530007；2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530007，3.廣西大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，廣西 南寧 530005)

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功夫菊酯高效降解菌的篩選、鑒定及降解特性研究

王彥輝1，杜良偉2*，李紅紅3，封國(guó)君3，羅 韜3

(1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧 530007；2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530007，3.廣西大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，廣西 南寧 530005)

以功夫菊酯為目標(biāo)，從生產(chǎn)擬除蟲菊酯農(nóng)藥廠污水處理口的淤泥里篩選高效降解真菌，并對(duì)降解菌進(jìn)行鑒定和降解特性研究。經(jīng)形態(tài)學(xué)和18S rDNA測(cè)序鑒定，該高效降解真菌為青霉菌(Penicilliumsp.)。采用色譜法對(duì)降解特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明：在pH=7.0，溫度30 ℃，底物濃度50 mg/L時(shí)降解效果最好，7 d時(shí)對(duì)功夫菊酯降解率達(dá)到83.90 %；該菌株還可降解溴氰菊酯、高效氯氰菊酯。

功夫菊酯；生物降解；青霉菌；降解特性

農(nóng)藥產(chǎn)品在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，但同時(shí)其自身對(duì)人類健康及環(huán)境安全具有一定的威脅性，因此，低效、劇毒性以及高殘留農(nóng)藥產(chǎn)品逐步被高效、低毒性、低殘留農(nóng)藥產(chǎn)品所替代。擬除蟲菊酯農(nóng)藥是作為目前最有發(fā)展前景的殺蟲劑，常用于防治一系列農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生害蟲，其具有高效低毒低殘留等特性，使用量?jī)H次于有機(jī)磷殺蟲劑[1]。由于擬除蟲菊酯農(nóng)藥對(duì)光和熱穩(wěn)定的特點(diǎn)，在環(huán)境中半衰期較長(zhǎng)，且長(zhǎng)期大量的使用勢(shì)必造成環(huán)境中農(nóng)藥殘留蓄積，進(jìn)而威脅到人類健康[2]。最近的研究表明長(zhǎng)期大量接觸擬除蟲菊酯農(nóng)藥有致癌的風(fēng)險(xiǎn)[3-5]，因此，研究擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留降解特性對(duì)農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)及人類健康均具有重要意義。

微生物降解是一種環(huán)保無(wú)污染的農(nóng)藥消除方式，近幾年有關(guān)擬除蟲菊酯農(nóng)藥降解菌的相關(guān)研究報(bào)道涉及芽孢桿菌(Bacillussp.)[6]、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.)[7]、金色鏈霉菌(Streptomycesaureus)[8]、枝孢菌(Cladosporiumsp.)[9]、蒼白桿菌(Ochrobactrumlupine)[10]、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)[11]、假單胞菌(Pseudomonassp.)[12]、紅球菌(Rhodococcussp.)[13]等方面，其中大部分降解菌是細(xì)菌，關(guān)于真菌降解菌的報(bào)道相對(duì)較少。

本研究以功夫菊酯為目標(biāo)，從生產(chǎn)擬除蟲菊酯農(nóng)藥廠污水處理口的淤泥里篩選高效降解真菌，并對(duì)降解菌進(jìn)行鑒定和降解特性研究，旨在豐富擬除蟲菊酯農(nóng)藥降解菌資源庫(kù)，為其在生物修復(fù)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

功夫菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(98.00 %)；溴氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氰戊菊酯、高效氯氰菊酯原藥(廣西田園生化股份有限公司)，使用前甲醇溶解配制成儲(chǔ)備液，按照所需要濃度添加到培養(yǎng)基中；色譜純乙腈(美國(guó)Fisher公司)；TIANampFungal DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker(天根生化科技有限公司)；10×PCR Buffer、dNTP mixture、Taq聚合酶(大連寶生物工程有限公司)；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)：NH4NO31.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO40.025 g，微量元素1 mL，H2O 1000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn))。YPD培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨 20 g，葡萄糖20 g，H2O 1000 mL，115 ℃滅菌15 min。以上培養(yǎng)基滅菌后加入功夫菊酯儲(chǔ)備液使其終質(zhì)量濃度為20、50和100 mg/L。

1.3 儀器設(shè)備

Waters液相色譜儀(美國(guó)waters公司)；恒溫?fù)u床(上海智城分析儀器制造)；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上?；厶﹥x器制造有限公司)；SIGMA1-14離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)；PCR儀(Bio-Rad公司)；DYY-7B電泳儀(北京六一儀器廠)；超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；pH計(jì)(上海雷磁有限公司)；尼康光學(xué)顯微鏡(尼康儀器上海有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)密理博公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 分離與富集降解菌 取5.0 g活性淤泥加入50 mL的含50 mg/L功夫菊酯無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫?fù)u床中180 r/min振蕩培養(yǎng)。7 d后取5 mL的該培養(yǎng)液加到新的含50 mg/L功夫菊酯無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中。按照上述操作連續(xù)培養(yǎng)6次。最終的培養(yǎng)液通過(guò)梯度稀釋涂布在MSM瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d。將生長(zhǎng)出的不同形態(tài)的菌落分離出來(lái)，通過(guò)在PDA平板上連續(xù)劃線分離純化菌落。將純化的菌株用20.00 %甘油于-80 ℃冷凍保存。

1.4.2 功夫菊酯降解菌的鑒定 ①降解菌形態(tài)學(xué)鑒定：參照《真菌鑒定手冊(cè)》[14]，將真菌在PDA培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)5 d，通過(guò)肉眼觀察菌落形態(tài)和顯微鏡觀察菌絲、孢子形態(tài)等。②降解菌18SrDNA鑒定：采用試劑盒提取降解菌的總DNA進(jìn)行18S rDNA擴(kuò)增。采用18S rDNA的PCR反應(yīng)的通用真菌引物，通用引物Primer1序列：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；Primer2序列：TCCTCCGCTTATTGATATGC。反應(yīng)體系：H2O 17.8 μl，Buffer 3 μl，dNTP 2 μl，Primer1 3 μl，Primer2 3 μl，DNA模板1 μl，酶0.2 μl，總體積3 0 μl。PCR條件：95 ℃變性，5 min；95 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，1 min；循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)1.00 %瓊脂糖凝膠電泳純化回收，送華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇同源性高的序列以及對(duì)擬除蟲菊酯有降解功能的菌株的相關(guān)序列，使用MEGA(version 6.0)計(jì)算進(jìn)化距離，用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，1000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算自引導(dǎo)值以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的置信度。

1.4.3 降解特性研究 從PDA平板上挑取單菌落，接種于50 mL YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃搖床180 r/min培養(yǎng)3 d，離心收集菌體，用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌菌體2次后，以0.5 g/L的量接入無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，以功夫菊酯為唯一碳源或者氮源，在30 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)。同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照即無(wú)菌對(duì)照用來(lái)評(píng)估化學(xué)水解。每隔一定的時(shí)間取2 mL均勻培養(yǎng)液在12 000 r/min下離心2 min，將上清液過(guò)0.22 μm的水相膜，用HPLC對(duì)濃度進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算降解率。HPLC檢測(cè)條件：色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18 (250×4.6 mm i.d.；5 μm)；流動(dòng)相為甲醇∶水=9∶1(v∶v)，流速1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm，柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl。功夫菊酯降解率η( %)按下式計(jì)算：

式中，C0為空白對(duì)照中功夫菊酯總濃度(mg/L)，Ct為t時(shí)刻樣品培養(yǎng)液中功夫菊酯殘留濃度(mg/L)。

為了研究功夫菊酯濃度對(duì)降解菌降解效果的影響，在pH=7.0，溫度為30 ℃時(shí)，分別加入功夫菊酯使其濃度為20、50和100 mg/L。為了評(píng)估pH的影響，在溫度為30 ℃，功夫菊酯濃度為50 mg/L時(shí)，分別調(diào)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH為5.0、7.0和9.0。同時(shí)還研究溫度對(duì)降解的影響，在pH=7.0和功夫菊酯濃度為50 mg/L時(shí)，調(diào)節(jié)溫度為20、30和40 ℃。

1.4.4 降解譜檢測(cè) 按1.4.3方法，將降解菌按0.5 g/L接入量分別接種于包含50 mg/L溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、聯(lián)苯菊酯的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30 ℃和180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d，pH設(shè)定為7，測(cè)定菌株對(duì)溴氰菊酯、氰戊菊酯、高效氯氰菊酯和聯(lián)苯菊酯的降解率，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 功夫菊酯降解菌的篩選與鑒定

按照上述的篩選方法從農(nóng)藥廠排污口淤泥中分離到1株高效降解功夫菊酯的真菌菌株P(guān)N12，將該菌株接種于50 mg/L氟氯氰菊酯的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d后，可降解功夫菊酯83.90 %。因此，將菌株P(guān)N12作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究菌株。

2.1.1 菌株形態(tài)學(xué)特性 在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)，菌落生長(zhǎng)初期菌絲為白色，到第3天菌落變?yōu)榍嗌＞z有隔，分生孢子梗為掃帚狀，共有二輪分生孢子小梗，在第二輪分生孢子小梗的頂端分化出分生孢子。分生孢子為圓形或橢圓形(圖1)。

2.1.2 序列分析結(jié)果 采用試劑盒提取菌株DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，測(cè)得該序列片段長(zhǎng)為561 bp。對(duì)該菌株的ITS序列在NCBI上進(jìn)行Blast基因同源性比對(duì)分析，菌株P(guān)N12與Penicilliumsp. YY26(JF727885.1)、Penicilliumsp. PTN19(KF656713.1)和Penicilliumoxalicum114-2(KF152942.1)等青霉有99.00 %的相似度。結(jié)合該菌株的形態(tài)學(xué)特征及序列比對(duì)結(jié)果，最終將該菌株鑒定為青霉(Penicilliumsp.)。在NCBI上選擇相似度高和具有降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的菌株序列，采用mega6.0步值法計(jì)算1000次做系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

2.2 青霉降解功夫菊酯的特性

2.2.1 降解功夫菊酯的條件優(yōu)化 采用單因素分析法，分別優(yōu)化了溫度和pH，底物濃度等條件對(duì)青霉PN12在無(wú)機(jī)鹽中對(duì)功夫菊酯的降解效果，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。首先固定pH和底物濃度，考察溫度對(duì)青霉PN12降解功夫菊酯的影響。檢測(cè)結(jié)果(圖3)表明，溫度明顯影響青霉PN12降解功夫菊酯，30 ℃時(shí)培養(yǎng)7 d對(duì)功夫菊酯的降解效果最好，降解率為83.90 %；溫度20和35 ℃時(shí)降解率較低，降解率分別為53.50 %和64.30 %。這可能與該菌在30 ℃生長(zhǎng)最佳有關(guān)。固定培養(yǎng)過(guò)程中的溫度和功夫菊酯濃度， 由pH值對(duì)青霉PN12降解功夫菊酯的影響可知(圖4)，pH值對(duì)青霉PN12降解功夫菊酯的影響比較明顯，pH 在6和7時(shí)降解效果好，降解率分別為80.90 %和81.30 %，pH為4時(shí)降解率最低，為33.40 %，可見(jiàn)pH是影響青霉降解功夫菊酯的一個(gè)重要因素。pH值太低和太高會(huì)抑制該菌的生長(zhǎng)。由底物濃度對(duì)功夫菊酯的降解的影響(圖5)可知，菌株青霉PN12對(duì)不同濃度的功夫菊酯底物的降解效果差異不顯著，對(duì)50 mg/L功夫菊酯的降解率最大。青霉PN12對(duì)不同濃度的功夫菊酯的降解符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。在溫度為30 ℃，pH為7時(shí)，青霉PN12對(duì)50 mg/L功夫菊酯的降解效果最好，7 d的降解率達(dá)到83.90 %。該溫度和pH同時(shí)也是青霉PN12生長(zhǎng)的最好條件。

圖1 菌株P(guān)N12在顯微鏡下的孢子形態(tài)特征Fig.1 The spore morphological characteristics of PN12

圖2 菌株P(guān)N12的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the 18S rRNA gene sequence of strain PN12 and related species

圖3 不同溫度下青霉PN12降解功夫菊酯效果Fig.3 Degradation of lambda-cyhalothrin at different temperatures

圖4 不同pH下青霉PN12降解功夫菊酯效果Fig.4 Degradation of lambda-cyhalothrin at different pH values

2.2.2 降解譜檢測(cè) 將青霉PN12按照上述條件培養(yǎng)，采用色譜法分別測(cè)定其對(duì)溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯和聯(lián)苯菊酯的降解效果，結(jié)果見(jiàn)圖6。其中對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的降解效果較好，分別為64.30 %和57.10 %，對(duì)氰戊菊酯和聯(lián)苯菊酯的降解率分別為18.90 %和15.30 %。這可能是由于不同的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥結(jié)構(gòu)差異所造成的。

3 小結(jié)與討論

從生產(chǎn)擬除蟲菊酯農(nóng)藥廠污水處理口的淤泥里篩選得到一株對(duì)功夫菊酯具有降解能力的真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征并結(jié)合ITS序列比對(duì)分析，將該菌株鑒定為青霉。該菌在pH=7.0，溫度30 °C時(shí)，以0.5 g/L的菌量接種到含50 mg/L功夫菊酯的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，7 d內(nèi)能降解83.90 %的功夫菊酯。目前，報(bào)道的降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解菌大部分為細(xì)菌和酵母，而絲狀真菌較少[15]。

圖5 青霉PN12對(duì)不同濃度的降解功夫菊酯的降解效果Fig.5 Effect of initial lambda-cyhalothrin concentration on its degradation

同時(shí)對(duì)降解譜進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其還能降解溴氰菊酯、高效氟氯氰菊酯，但不能降解聯(lián)苯菊酯和氰戊菊酯。且已有報(bào)道的該屬的草酸青霉ZHJ6可降解甲胺磷、阿特拉津、氯磺隆等農(nóng)藥，還可以用于降解纖維素等大分子碳水化合物[15]?？梢?jiàn)該菌應(yīng)用比較廣泛，具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。

國(guó)內(nèi)外針對(duì)農(nóng)藥降解菌的篩選做了大量的工作，但僅局限于實(shí)驗(yàn)室條件下的純培養(yǎng)和降解，然而在從實(shí)驗(yàn)室走向田間時(shí)受各種因素的影響和制約，應(yīng)用效果并不理想。同時(shí)降解菌應(yīng)用于田間后的安全性還有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)。因此，需進(jìn)一步開(kāi)展降解機(jī)理的研究和環(huán)境安全性評(píng)價(jià)的工作。

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(責(zé)任編輯 汪羽寧)

Screening, Identification and Characteristics of Lambda-cyhalothrin Degrading Fungus

WANG Yan-hui1, DU Liang-wei2*, LI Hong-hong3, FENG Guo-jun3,LUO Tao3

(1.Plant Protection Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Guangxi Nanning 530007, China;2.Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests, Guangxi Nanning 530007, China; 3.College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Guangxi Nanning 530007, China; 4.Institute of Pesticide & Environmental Toxicology, Guangxi University, Guangxi Nanning 530005, China)

A strain of cyhalothrin-degrading fungus was isolated from activated sludge from wastewater outlet of a pesticide factory. The strain was identified asPenicilliumsp. by morphological characteristics analysis and 18S rDNA sequence analysis. The degrading characteristics of this fungus for lambda-cyhalothrin were investigated with HPLC. The optimal conditions for the fungus to degrade lambda-cyhalothrin were as follows: pH 7.0, 30 ℃ and 50 mg/L. Under this condition, the strain could degrade 83.90 % of lambda-cyhalothrinin medium after 7 d. The strain also degraded deltamethrin and beta-cypermethrin.

Lambda-cyhalothrin;Biodegradation;Penicilliumsp.;Degradation characteristics

1001-4829(2016)08-1879-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.022

2016-04-19

廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(桂農(nóng)科2014YD11)；廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(14-045-50-ST-08)

王彥輝(1984-)，男，河南開(kāi)封人，博士，副研究員，主要從事農(nóng)藥污染與生物修復(fù)工作，*為通訊作者，E-mail：dulily@gxu.edu.cn。

S482;Q938

A