沈雪峰，胡 芳，陳 勇，李穎慧，韓承疇

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究室，廣東 廣州 510642)

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牛筋草對百草枯抗性水平初探

沈雪峰，胡 芳，陳 勇*，李穎慧，韓承疇

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究室，廣東 廣州 510642)

為探討牛筋草Eleusineindica(L.) Gaertn對百草枯的抗性水平，測定了百草枯對抗性和敏感生物型牛筋草的抗性水平、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和抗性基因的擴(kuò)增。結(jié)果表明，百草枯對抗性和敏感生物型牛筋草地上部鮮重抑制中濃度(ED50)分別為0.1029和6.1120 kg/hm2，抗性和敏感生物型ED50的比值為59.48；經(jīng)1 kg/hm2百草枯處理牛筋草3 h后，抗性生物型葉綠素?zé)晒鈪?shù)逐漸恢復(fù)，敏感生物型逐漸降低，而0.1 μmol/L硝酸鹽+1 kg/hm2百草枯處理的抗性生物型未出現(xiàn)恢復(fù)現(xiàn)象。推測轉(zhuǎn)運(yùn)體參與了百草枯在抗性生物型牛筋草體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。經(jīng)特異性引物，抗性生物型獲得擴(kuò)增片段1021 bp，而敏感生物型未能獲得。經(jīng)BLAST比對，該EST片段的核苷酸序列與高粱假設(shè)蛋白的同源性為96 %，該蛋白序列來源于氨基酸陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，與玉米的氨基酸陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因高度相似片段為96 %。

牛筋草；百草枯；抗性水平；轉(zhuǎn)運(yùn)體；葉綠素?zé)晒?/p>

牛筋草(EleusineindicaL.)屬禾本科屬1年生草本植物，多生于較濕潤的農(nóng)田、果園或路旁，廣布世界各地，已被列為世界十大惡性雜草之一，危害非常嚴(yán)重[1-2]。百草枯(1,1-二甲基-4,4-二氯聯(lián)吡啶化合物，paraquat)屬于典型的光合系統(tǒng)I抑制劑類除草劑[3]，已被廣泛用于防除田間、果園和荒地等一年生或多年生雜草，目前我國已成為全球百草枯生產(chǎn)和使用的第一大國[4]。自1980年在臺灣省發(fā)現(xiàn)第一例抗百草枯的蘇門白酒草(Conyzasumatrensis)以來[5]，世界范圍內(nèi)抗百草枯的雜草生物型不斷出現(xiàn)[6]。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[2]，我國華南地區(qū)許多長期使用百草枯的果園，百草枯對牛筋草的防除效果已經(jīng)很差，給當(dāng)?shù)氐墓麍@管理帶來極大不便。2010年，在馬來西亞連續(xù)使用多年的百草枯對果園牛筋草的防除效果很不理想，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)其GR50是敏感性的3.6倍[1]。百草枯的抗性機(jī)制十分復(fù)雜，包括抑制轉(zhuǎn)運(yùn)、隔離到液胞、增強(qiáng)氧自由基清除酶的活性等。Szigeti[7]在擬南芥基因組中分離到一個類似大腸桿菌PotE轉(zhuǎn)運(yùn)體的同源基因AtPotE，能被百草枯誘導(dǎo)，其表達(dá)豐度在抗性植株中較敏感植物中的高，可能定位在液泡中。Jori et al.[8]等通過比較百草枯處理后抗性和敏感生物型加拿大飛蓬(ConyzacanadensisL. Cronq)mRNA表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)兩條僅在抗性生物型中表達(dá)的EST片段，分別與EmrE，氨基端陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(CAT4)的氨基酸同源性在98 %，表明轉(zhuǎn)運(yùn)體可能參與了細(xì)胞內(nèi)百草枯的運(yùn)輸。目前國內(nèi)尚未見有關(guān)百草枯抗性生物型牛筋草的研究報(bào)道。本研究旨在探索牛筋草對百草枯的抗藥性水平，明確抗藥性生物型和敏感生物型牛筋草受百草枯和轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑處理后，植株內(nèi)部葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，通過轉(zhuǎn)運(yùn)體特異性引物擴(kuò)增，研究抗性和敏感牛筋草中轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因表達(dá)，從而為延緩抗藥性雜草的發(fā)展、治理抗性雜草提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 藥劑 42 %的百草枯(paraquat)母液，湖北仙隆化工股份有限公司。

1.1.2 雜草種子 牛筋草(EleusineindicaL.)抗藥性生物型(R)和敏感生物型(S)，分別于2006年5月采自廣州市番禺區(qū)大崗鎮(zhèn)柑橘園(該區(qū)百草枯已連續(xù)使用20年)和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場荒地(從未使用過除草劑)。

1.1.3 主要儀器 3WP-2000型行走式噴霧塔，農(nóng)業(yè)部南京農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所研制生產(chǎn)；PAM-2500葉綠素?zé)晒鈨x，德國WALZ公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同牛筋草種群對百草枯敏感性水平測定 采用溫室盆栽法培養(yǎng)。將去殼的種子播種于盛有營養(yǎng)土的花盆(d=9 cm)中，每盆10粒，10次重復(fù)，置于30±2 ℃，光照強(qiáng)度為800 μE·m-2s-1，相對濕度為80 %的溫室中培養(yǎng)，定期澆水。4次重復(fù)。

待幼苗長至6～7葉期，采用生測噴霧塔進(jìn)行莖葉噴霧，測定R和S型牛筋草對百草枯的敏感性。噴頭孔徑0.3 mm，噴霧壓力0.3 MPa，霧滴直徑100 μm，噴頭流量90 mL·min-1。噴施劑量依次為0、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8 kg a.i. hm-2。以清水為對照，4次重復(fù)。噴藥7 d后，統(tǒng)計(jì)死亡率并稱取地上部鮮重。數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，以植株抑制率的幾率值(Y)和百草枯濃度的對數(shù)值(x)建立回歸方程，計(jì)算ED50。

1.2.2 抗性和敏感牛筋草葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 幼苗培養(yǎng)方式同1.2.1節(jié)。待植株長至分蘗期隨機(jī)分成2組，其中一組噴藥濃度為1 kg a.i. hm-2；另一組經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑(0.1 μmol·L-1KNO3)處理1 h后，也同樣噴施1 kg a.i. hm-2的百草枯，之后每隔1 h使用0.1 μmol·L-1的KNO3處理1次。分別于噴施百草枯后0、1、2、3、4、5、6、12、24和48 h分別測定R和S型牛筋草葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)[9]。各測定10株，每植株測10個葉片，每隔1 h記錄PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)值，重復(fù)5次。

1.2.3 抗性和敏感牛筋草抗性基因擴(kuò)增 利用Multalin軟件，對水稻、小麥、大麥、玉米等多種植物品系的20條CAT4核苷酸序列進(jìn)行比對，根據(jù)保守區(qū)域進(jìn)行兼并引物設(shè)計(jì)引物為F(5’-AAGGKRTTGCCTGGTTGA-3’)，R(5’-GGAGGKACATATCTRAG TA-3’)。PCR總反應(yīng)體系為50 μl，其中，包括DNA模板2 μl，5×PCR Buffer 5 μl，下游特異性PCR引物2 μl，上游特異性PCR引物2 μl，TaKaRa ExTaq?0.5 μl，Mg2+3 μl，ddH2O 35.5 μl。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1.5 min，33個循環(huán)；72 ℃后延伸7 min。利用含有EB的1 %的瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增結(jié)果，Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)觀察。

2 結(jié)果分析

2.1 抗性和敏感生物型牛筋草對百草枯的敏感性差異

由表1可知，百草枯對牛筋草R、S生物型存活率的抑制中濃度ED50值分別為6.1120和0.1029 kg/hm2，抗性與敏感生物型的ED50比值為59.48。該結(jié)果表明牛筋草抗性生物型對百草枯的敏感性明顯降低，抗藥程度高。

2.2 抗性和敏感生物型牛筋草葉片熒光參數(shù)變化

由圖1 a可知，經(jīng)1 kg/hm2百草枯莖葉處理后，R生物型牛筋草的Fv/Fm值呈單峰曲線，峰谷出現(xiàn)在藥后3 h，隨后呈現(xiàn)上升，趨于平穩(wěn)；而S生物型牛筋草的Fv/Fm值呈下降趨勢，且在百草枯處理48 h后，F(xiàn)v/Fm值急劇下降至0。經(jīng)硝酸鹽+百草枯處理后，R和S生物型牛筋的Fv/Fm值表現(xiàn)相似，均呈現(xiàn)下降趨勢(圖1 b)，說明硝酸鹽抑制了R生物型牛筋草活性。

表1 牛筋草抗性和敏感生物型對百草枯的敏感性差異

a：1 kg/hm2百草枯處理R和S生物型牛筋草；b：1 kg/hm2百草枯和0.1 μmol/L硝酸鹽處理R和S生物型牛筋草a: Resistant and susceptible biotypes of E. indica treated by 1 kg/hm2 paraquat; b: Resistant and susceptible biotypes of E. indica treated by 0.1 μmol/L nitrates and 1 kg/hm2 paraquat圖1 百草枯和硝酸鹽對R和S生物型牛筋草葉片F(xiàn)v/Fm值的影響Fig.1 The change trend of Fv/Fm value in resistant/susceptible E. indica after paraquat and nitrates treatment

2.3 抗性和敏感生物型牛筋草總DNA擴(kuò)增與序列分析

通過保守區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物，分別對R和S生物型牛筋草總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果從R生物型牛筋草中擴(kuò)增到1條1021 bp的核苷酸片段，在S生物型牛筋草中未得到該片段(圖2)。經(jīng)BLAST比對，顯示與高粱假設(shè)蛋白(Sorghumbicolorhypothetical protein)同源性為96 %，與玉米LOC100285193基因(ZeamaysLOC100285193)，全長cDNA克隆玉米mRNA(Zeamaysfull-length cDNA clone ZM_BFb0068I04 mRNA)同源性均為95 %，與短柄草LOC100846653基因(BrachypodiumdistachyonLOC100846653)同源性為94 %，而上述序列均與轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)。同時，對PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明，該序列部分片段與玉米、二穗短柄草、擬南芥酸陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體等基因片段同源。

3 結(jié)論與討論

百草枯的主要作用部位是植物葉綠體光系統(tǒng)PSⅠ的光合膜系統(tǒng)，其作用機(jī)理是與光系統(tǒng)PSⅠ中的電子受體競爭，捕獲電子傳遞鏈中的電子，抑制正常的電子傳遞，同時產(chǎn)生過氧化物和自由基，破壞質(zhì)膜、蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)而造成植物死亡[3, 10]。本研究結(jié)果證實(shí)，取自于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場荒地的S生物型及R生物型牛筋草的ED50值分別為0.1029和6.1120 kg/hm2已經(jīng)遠(yuǎn)高于百草枯的推薦劑量0.600 kg/hm2；與S生物型牛筋草相比，R生物型牛筋草的相對抗性水平達(dá)到59.48倍。這與Seng et al.[1]對馬來西亞R生物型牛筋草研究的結(jié)果相似。

(S1～S4: S生物型牛筋草，M: DL2000 DNA Marker，R1～R4: R生物型牛筋草)S1-S4: Susceptible biotypes, M: DL2000 DNA Marker, R1-R4: Resistant biotypes圖2 抗性和敏感生物型牛筋草DNA擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 DNA-blot analysis of paraquat-sensitive and -resistant E.indica individuals

近年來，F(xiàn)v/Fm反映了PSⅡ反應(yīng)中心的原初光能轉(zhuǎn)換效率[9]，被用來研究植物對逆境響應(yīng)，是光合作用光抑制的顯著特征，作為判斷是否發(fā)生光抑制的標(biāo)準(zhǔn)[11]。在脅迫條件下，F(xiàn)v/Fm值會顯著降低[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著百草枯處理時間的延長，S生物型牛筋草PSⅡ活性中心受損逐漸加重，F(xiàn)v/Fm呈快速下降趨勢，說明百草枯對S生物型牛筋草產(chǎn)生了不可逆的脅迫作用，植株受到嚴(yán)重的光抑制，光合系統(tǒng)嚴(yán)重受損，光合作用受阻，敏感牛筋草最終死亡，而R生物型牛筋草經(jīng)百草枯處理后，F(xiàn)v/Fm呈現(xiàn)單峰曲線，表現(xiàn)為先降低后升高，之后趨于平穩(wěn)，說明其光合系統(tǒng)受到影響較小，對光能的利用效率始終保持穩(wěn)定，葉片PSⅡ的潛在活性和原初光能轉(zhuǎn)化效率都很高，進(jìn)一步說明抗性牛筋草PSⅡ活性中心未受損，植株能夠正常地進(jìn)行電子傳遞及光合作用，說明葉綠體機(jī)能復(fù)活，而葉綠體機(jī)能活性恢復(fù)過程是由于百草枯被轉(zhuǎn)運(yùn)到代謝不活躍的細(xì)胞區(qū)間造成的[10, 13]。

前人[14]研究報(bào)道：用真核生物蛋白活性抑制劑放線菌酮(Cycloheximide)和百草枯同時處理加拿大萵苣百草枯抗性植株被破壞；而單獨(dú)使用放線菌酮并不能使植物致死。表明百草枯能夠進(jìn)入植株葉綠體中，并進(jìn)行瞬時的功能抑制，推測存在某類其活性能被放線菌酮抑制的百草枯誘導(dǎo)蛋白，其功能是攜帶百草枯并將其隔離而解毒。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.1 μmol/L硝酸鹽+1 kg/hm2百草枯處理后，R和S生物型牛筋的Fv/Fm值均呈現(xiàn)下降趨勢，說明硝酸鹽抑制了R生物型牛筋草活性。這表明硝酸鉀抑制了位于質(zhì)膜上ATPases的作用，使轉(zhuǎn)運(yùn)體失去了來自質(zhì)膜兩側(cè)的質(zhì)子濃度梯度提供的能量，無法完成百草枯的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，使抗性牛筋草失去功能活性恢復(fù)過程，表現(xiàn)出與敏感牛筋草相同的現(xiàn)象。

Su et al.[15]等在百草枯抗性植物中還檢測到一個與氨基端陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體CAT4同源的EST片段，它與定位于膜的H+-ATP酶亞基同源。選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制/恢復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，擬南芥氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)CAT4，參與百草枯和其它毒性化合物的脅迫應(yīng)答[16]，使用不同的轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑處理百草枯抗性萵苣也觀察到了同樣的現(xiàn)象[17]。本研究選用特異性引物分別對R和S生物型牛筋草進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，在R生物型牛筋草中擴(kuò)增得到氨基端陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體同源序列片段，且其EST片段的核苷酸序列與高粱假設(shè)蛋白同源性為96 %，該蛋白序列來源于氨基酸陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，與玉米的氨基酸陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因高度相似片段的相似性為96 %。

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(責(zé)任編輯 李山云)

Preliminary Study on Resistance Level ofEleusineindicato Paraquat

SHEN Xue-feng, HU Fang, CHEN Yong*, LI Ying-hui, HAN Cheng-chou

(Weed Research Laboratory, South China Agricultural University, Guangdong Guangzhou 510642, China)

To investigate the resistance level ofEleusineindicato paraquat, the susceptible level ofEleusineindicato paraquat, values ofFv/Fmand amplification of resistance genes was conducted. The results showed that the paraquat concentration causing 50 % inhibition of survival rate (ED50) in resistant (R) and susceptible (S) biotypes ofE.indicawas 0.1029 and 6.1120 kg/hm2, and the relative resistance index [ED50(R) / ED50(S)] was 59.48. The values ofFv/Fmwas recovered in R biotype, but decreased with time in S biotype 3 h after spraying paraquat. However, it wasn’t recovered in R biotype after treating with 0.1 μmol/L nitrate + 1 kg/hm2paraquat. It was speculated that the paraquat was transported in R biotype by transporter. Provided primers specific to the PCR template sequence, the DNA of 1021 bp gets from R biotype, but S biotype was not. The nucleotide sequence of EST fragments was 96 % homologous toSorghumbicolorhypothetical protein with BLAST. Protein sequence alignments was 96 % homologous toZeamaysgene of transporter revealed one amino acid position, where organic cation transporters.

Eleusineindica; Paraquat; Resistance level; Transporter; Chlorophyll fluorescence

1001-4829(2016)08-1875-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.021

2015-10-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31272054，31471788)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303031)

沈雪峰(1982-)，男，河南商丘人，講師，主要從事作物栽培與生理研究，E-mail: xuefengshen@126.com，*為通訊作者。

S451.1

A