任春梅，程兆榜，楊 柳，繆 倩，周益軍

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

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灰飛虱攜帶的水稻條紋病毒NS2和NS3基因的分子變異

任春梅，程兆榜*，楊 柳，繆 倩，周益軍

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

為揭示灰飛虱攜帶水稻條紋病毒(ricestripevirus, RSV)的NS2和NS3基因分子變異特征，采用單雌產(chǎn)卵法從江蘇、云南、山東、河北等地獲得20個灰飛虱攜帶的RSV分離物，RT-PCR擴增出NS2和NS3基因特異片段，并對擴增產(chǎn)物進行克隆測序，再結(jié)合Genbank中已報道的其他分離物序列，利用生物信息學軟件分析不同寄主、地區(qū)分離物的分子變異特點及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。序列測定表明，20個分離物NS2和NS3 2個基因核苷酸序列同源性分別為96.5 %～100 %(NS2)和95.4 %～100 %(NS3)，推導編碼的蛋白氨基酸序列同源性為97.0 %～100 %(NS2)和96.2 %～100 %(NS3)?；诤塑账嵝蛄袠?gòu)建的系統(tǒng)進化樹分析表明2個基因均可以明顯分為2組，其中一組均為中國云南水稻上的分離物，2組間遺傳距離分別為0.05711(NS2)和0.06081(NS3)，2基因的Z-test的檢測結(jié)果表明都處于強烈的負選擇壓下。從2基因氨基酸構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和變異熱點上分析，其氨基酸序列的分子變異首先與地緣相關(guān)，2基因均可以分成中國云南及云南以外的2個地理亞群；其次與寄主相關(guān)，可以劃分為灰飛虱和水稻2個寄主群。

水稻條紋病毒；NS2和NS3基因；分子變異；寄主群；地理亞群

植物病毒的群體遺傳結(jié)構(gòu)不僅可為我們追蹤病毒的起源、進化和流行途徑提供重要依據(jù)，同時其遺傳結(jié)構(gòu)及演化機制還直接影響著病毒病害的發(fā)生、發(fā)展和控制。病毒病的發(fā)生和流行是寄主、病毒、介體以及環(huán)境等各因子相互作用的結(jié)果，各因子相互作用、相互制約形成了一個變化的植物病毒動態(tài)體系。其中病原物的群體多樣性是環(huán)境適應力的重要指標，高遺傳多樣性的病原物具有相對強的生存能力和進化優(yōu)勢，能更快地適應新的寄主和生存環(huán)境[1]。在自然選擇下，有益變異得到積累，有害變異則被淘汰。由于寄主和病原物本身是由復雜的、動態(tài)結(jié)構(gòu)的個體組成的，隨著病原物群體結(jié)構(gòu)的時空變化，這種特定的寄主-病原物關(guān)系也隨之發(fā)生改變，因此，研究病原物的分子變異及群體遺傳結(jié)構(gòu)對認識病害的流行、有效選育和使用抗性品種乃至病害的控制都具有重要的理論和實踐意義。

水稻條紋病毒(Ricestripevirus，RSV)是纖細病毒屬(Tenuivirus)的典型成員之一，引起的水稻條紋葉枯病是水稻上一種重要的病毒病，該病最早在日本發(fā)生，后在朝鮮、烏克蘭和中國均有發(fā)生[2-3]，近年來在越南也有發(fā)現(xiàn)[4]。歷史上該病在各地區(qū)曾多次暴發(fā)流行，給水稻生產(chǎn)造成了嚴重損失[5-6]。病原的變異是其流行的主要原因之一，因此在已對RSV-cp和sp遺傳多樣性研究的基礎(chǔ)上[7-8]，進一步對RSV其他2個承擔著不同功能的基因(NS2和NS3)分子變異進行分析，明確與其他兩個基因分子變異的異同及其獨特的分子變異特征，將為RSV的起源進化與流行規(guī)律研究提供科學依據(jù)，從而達到控制病害的目的。

RSV是負義單鏈RNA(-ssRNA)病毒，其基因組由4條RNA組成，除RNA1采用負義編碼策略外，其余3條均采用雙義編碼策略，共編碼7個蛋白[9]。有研究表明RSV-NS2蛋白可參與病毒的胞間運動[10]，并與水稻的基因沉默抑制子3(SGS3)互作，證明其為RSV編碼的一個沉默抑制子[11]；Xiong等證實RSV-NS3蛋白是基因沉默抑制子而非致病性決定因子[12]。RSV中不同的基因承擔不同的功能，其所受的選擇壓也不相同，導致其變異的范圍和程度亦不相似，作為起沉默抑制作用的2個基因在病毒的流行進化中分子變異有何規(guī)律，其變異與RSV中其他功能基因的變異有何異同都是值得我們深入探討的科學問題。因此本研究從水稻條紋葉枯病田間流行危害中的重要寄主-灰飛虱出發(fā)，將其作為昆蟲病毒，分析其中承擔不同功能的2個基因(NS2和NS3)的分子變異特征，以揭示該病毒的群體遺傳結(jié)構(gòu)及其分子變異規(guī)律，為該病害的流行監(jiān)測和生態(tài)控制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒分離物：2003-2005采集來自云南大理、保山，河北唐海，山東濟寧，江蘇高郵、洪澤、丹陽、鹽都、靖江、海安、沛縣的秧田或稻田灰飛虱，采用單雌產(chǎn)卵法進行毒源純化得到21個純分離物(表1)，保存?zhèn)溆?。具體純化方法如下：灰飛虱飼養(yǎng)至成蟲，單頭雌蟲產(chǎn)卵3～4 d，Dot-ELISA檢測[13]，陽性蟲后代飼養(yǎng)2～4代后再同上法純化一次，所得純系擴繁后用于實驗。

表1 本研究中RSV分離物的來源、采集時間及序列登錄號

表2 進化樹構(gòu)建所引用的RSV分離物

續(xù)表2 Continued table 2

序號SN分離物Isolate來源及采集時間Source，collectionyearNS2登錄號AccessionnumberofNS2NS3登錄號AccessionnumberofNS342JSHZ03江蘇洪澤，2003AY597399AJ62031443JSHA03江蘇淮安，2003AY28485244JSDF01江蘇大豐，2001AY28493145JSSZ10江蘇蘇州，2010JQ927431JQ92742546HuZ10浙江湖州，2010JQ927427JQ92742147ZJ02浙江杭州，2002AY28484748ZJ01浙江杭州，2001AY28494149AHFX09安徽肥西，2009FN65079350AHMAS09安徽馬鞍山，2009FN65079651AHSX09安徽壽縣，2009FN65079852LN08遼寧，2008JQ927430JQ92742453LNDW02遼寧大洼，2002AF509500

主要試劑：提取RNA的Trizol試劑來自Invitrogen公司，用于cDNA合成的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin RNA來自MBI公司，Taqplus DNA聚合酶、dNTP等PCR試劑均購自上海申能博采有限公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：Eppendorf BioPhotometer Plus 核酸蛋白測定儀，艾本德(上海) 國際貿(mào)易有限公司；電泳儀和水平電泳槽，北京六一儀器廠；Bio-Rad MyCyclerTM PCR 儀，南京潤亞生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 灰飛虱總RNA提取 取帶毒灰飛虱10頭，冰浴條件下迅速徹底勻漿，然后用TRIZOL試劑盒按產(chǎn)品說明書提取灰飛虱總RNA。

1.2.2 RT-PCR 根據(jù)已報道的RSV日本T分離物RNA2、RNA3的基因序列，設(shè)計2對用于擴增RSV-NS2和RSV-NS3基因的寡聚核苷酸引物，并由上海英俊生物技術(shù)公司合成，引物序列如表3。

反轉(zhuǎn)錄程序如下：取總RNA 3 μl，3′端引物(10 pmol/L)1 μl，ddH2O 6 μl，70 ℃下變性5 min，冰浴1 min，再依次加入下列試劑，5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2 μl、dNTP 0.5 μl(10 mmol/L)、RNasin(40 U/μl)0.5 μl、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(20 U/μl)0.5 μl、ddH2O 1.5 μl。42 ℃水浴1 h，70 ℃滅活10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增在25 μl反應體系中進行，包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3 μl，5′端和3′端引物(10 pmol/μl)各1 μl、dNTP(10 mmol/L)0.5 μl、10×buffer 4 μl、ddH2O 15 μl、Taqplus DNA聚合酶(4 U/μl)0.5 μl。擴增條件：94 ℃變性2 min后，94 ℃變性1 min，53 ℃退火2 min，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后，72 ℃保溫10 min。

1.2.3 克隆及測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后用柱式膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司)回收，最后溶于30 μl 的溶解液中。回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接(參見pMD18-T試劑盒說明書)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細胞，堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及酶切鑒定篩選重組質(zhì)粒。每個分離物挑選2個陽性克隆進行測序，測序由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司采用雙脫氧核苷酸終止法在ABI 3730 DNA自動測序儀上進行。

表3 擴增RSV-NS2和NS3基因的特異引物

注：“GGATCCC”表示BamHⅠ酶切位點；“GTCGAC”表示SalⅠ酶切位點。

1.2.4 序列分析 在GeneBank中利用Blast搜索(網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) RSV已發(fā)表日本、韓國及全國各地分離物(表 2) 進行比較分析。序列同源性用DNASTAR 5.0 軟件完成。序列間相似性比對用Clustal W分析完成(Thompson et al., 1994)，采用Mega 4.0軟件中的鄰近法則(Neighbor-Ioining，NJ)(Swofford, 2002)，Kimura 2-參數(shù)模型(Kumar et al., 2001)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Distance計算遺傳距離，Pamilo-Bianchi-Li 估算基因的選擇壓。

2 結(jié)果與分析

2.1 NS2和NS3基因的擴增和序列分析

20個灰飛虱來源的RSV分離物RNA經(jīng)RT-PCR擴增后，均可得到長度為650 bp(NS2)和700 bp(NS3)左右的擴增片段，與預期目的片段大小相符。PCR產(chǎn)物克隆測序，結(jié)果表明20個RSV分離物的NS2基因均由600 nts組成，編碼199個氨基酸；NS3基因均由636 nts組成，編碼212個氨基酸(Genbank登錄號見表1)。應用DNASTAR軟件將本研究中的20個RSV分離物的NS2和NS3基因的核苷酸序列和推導編碼的蛋白氨基酸序列同源性進行比較分析，各分離物間核苷酸序列同源性為96.5 %～100 %(NS2)和95.4 %～100 %(NS3)，推導的氨基酸序列同源性為97.0 %～100 %(NS2)和96.2 %～100 %(NS3)。

2.2 基于NS2和NS3基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)水稻條紋葉枯病的發(fā)生及分布狀況選取已發(fā)表的包括日本、韓國及中國各地的RSV分離物(表 2)，以國家、地名首字母、采集年份命名，與本試驗中20個灰飛虱來源的RSV分離物一起依據(jù)NS2和NS3基因核苷酸序列利用Mega 4.0中的NJ法，Kimura 2-參數(shù)模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 1-A、B)。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，20個分離物的NS2和NS3基因都可以明顯分為2組，其中一組均為中國云南水稻上的RSV分離物，這與魏太云等[12]的研究結(jié)論基本相似，2組間遺傳距離分別為0.05711和0.06081(表4)，NS3的遺傳距離大于NS2。

就NS2而言，在組I中又可以分成IA和IB 2個亞組，IB組中為灰飛虱攜帶的云南2個分離物，IA組除CHN-YNYX03、CHN-YNDL01和CHN-YNDL03外包括中國其他地區(qū)、日本、韓國等地水稻上以及本實驗中灰飛虱攜帶的RSV分離物，2個亞組之間的遺傳距離為0.02918(表4)。NS3組I也可以分成IA和IB2個亞組，IB組中為日本水稻上的2個分離物，IA組除CHN-YNBS04、CHN-YNKM02外包括中國其他地區(qū)和韓國水稻上以及本實驗中灰飛虱攜帶的RSV分離物，2個亞組之間的遺傳距離為0.02918(表4)?？v觀2圖，組IA中都包括了日本、韓國與中國沿海及黃淮地區(qū)的水稻及灰飛虱上的分離物，這與國外學者Sakai 等[14]和 Jonson等[15]的研究結(jié)論基本相似，認為三地的灰飛虱存在遷飛的可能性，推測RSV可能為同一起源。進一步細分，2圖中星號部分均為灰飛虱來源的分離物，與水稻來源的分離物遺傳距離較大，說明其遺傳多樣性與寄主具有一定的相關(guān)性。

表4 NS2和NS3基因組內(nèi)和組間的遺傳距離

注：組型分配基于圖1的系統(tǒng)進化分析。

Note： Subtypes are designated based on the phylogenetic analyses of RSV in Fig 1.

表5 NS2和NS3基因的Z-test 檢測

注:dn和ds分別指發(fā)生非同義/同義替換的頻率，是衡量選擇壓的重要參數(shù)(dn>ds：正向選擇壓；dnds: positive selection; dn

利用Mega 4.0中的Pamilo-Bianchi-Li法估算RSV-NS2和NS3 基因的進化限制系數(shù)(表5)，由表可知Z-test為選擇壓的檢測方法之一，當P_Value<0.01時該模型顯著，可以接受對應的假說，2個基因的dn

分枝上的數(shù)值代表自展支持率，小于50 %的分枝去除，黑色加強線與分組“IA, IB, II”對應Numerical values at each node indicate the bootstrap support ( as a percentage ). Branches with a bootstrap support of less than 50 % are merged. The underlines are corresponding to subtype‘IA, IB, II’圖1 基于本研究20個及引用的RSV分離物NS2(A)和NS3(B)基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.1 Phylogenetic tree constructed from alignment of nucleotide sequences of the NS2(A) and NS3(B) genes of 20 RSV isolates from this study and Genbank

2.3 NS2和NS3基因氨基酸序列變異特征

以NS2和NS3基因氨基酸序列為基礎(chǔ)，采用鄰近結(jié)合法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，2個基因氨基酸都與各自核苷酸發(fā)育樹的分組基本相似，中國云南水稻上RSV分離物獨立成組，中國沿海和黃淮地區(qū)及日本、韓國等地的RSV分離物又歸為一組。

方框中橫向氨基酸序列對應左邊RSV分離物，方框上方數(shù)字表示氨基酸在序列中所處位置(圖3同)Aligned, abbreviated amino acid residues in the box correspond to the left-sided RSVs. Numbers above the box indicate the numerical order of the amino acid sequences of the nucleocapsid protein (as in Fig.3 )圖2 65個RSV分離物NS2基因氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed from alignment of amino acids sequences of the NS2

圖3 63個RSV分離物NS3基因氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed from alignment of amino acids sequences of the NS3 gene of 63 RSV isolates

NS2基因由199個氨基酸組成，序列上共有35處變異，變異較大的有7處(圖 2)。Ⅰ組中有2處變異，在第177位上來自本研究灰飛虱攜帶的8個分離物及1個韓國水稻上的分離物均具有親水性的蘇氨酸，在系統(tǒng)進化樹上聚在一小簇，而其他分離物均具有疏水性的丙氨酸，由此可見此變異與寄主具有一定的相關(guān)性；在185位上除韓國水稻上的分離物KR-GSJB07外其余所有韓國分離物及部分中國分離物在此位點為谷氨酸，而除中國云南水稻上的分離物CHN-YNLL04為中性的天冬酰胺外，其余分離物均為酸性的天冬氨酸。Ⅱ組中有5處變異，由圖2可見，此組均為中國云南水稻上的分離物，在氨基酸序列上較之Ⅰ組有較大變異，除處在第12位的CHN-YNBS07(R，精氨酸)、第181位的CHN-YNLQ04和CHN-YNBS07(A，丙氨酸)、第183位的CHN-YNDL08(F，苯丙氨酸)有變異外，其余該組分離物與Ⅰ組分離物在此5個位點上均有一致變異。由此可見，NS2氨基酸分子變異首先與寄主相關(guān)，從寄主角度可以劃分為灰飛虱和水稻2個寄主群；其次與地緣相關(guān)，可以分成中國云南及云南以外的2個地理亞群。

NS3基因由212個氨基酸組成，序列上有41處變異，變異較大的有5處(圖 3)。Ⅰ組中有3處變異，分別為第93、97、175位的4個中國水稻、灰飛虱分離物及1個韓國水稻分離物的變異，其余分離物均為一致的氨基酸序列，為同義堿基置換。與此相反，Ⅱ組有5處變異，仍均為中國云南水稻上的分離物，除第93位的CHN-YNDL08和CHN-YNKM08(Y，酪氨酸)外，5個位點具一致的變異，分別由Ⅰ組的天冬氨酸(D)、酪氨酸(Y)、蘇氨酸(T)、精氨酸(R)和谷氨酸(E)變?yōu)楣劝彼?E)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)、賴氨酸(K)和甘氨酸(G)。由以上分析可知，NS3氨基酸分子變異除中國云南水稻上的分離物具一致變異這一特征外，其余分離物的變異無明顯的規(guī)律性可循。因此從功能上分析，其分子變異與地域相關(guān)。

3 討 論

RSV屬于RNA病毒，這種病毒由于其依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)或復制酶缺乏校正功能，從而導致RNA基因組復制過程中易發(fā)生錯配，據(jù)估計RNA病毒的突變率約為每個復制循環(huán)10-4個核苷酸[16]。因RNA復制酶的這一特性，許多RNA病毒呈現(xiàn)豐富的遺傳多樣性，以至于用“準種(quasispecies)”來描述RNA病毒的特征，即單個病毒分離物不是由單個序列組成而是由一種優(yōu)勢序列和一些低頻率與優(yōu)勢序列差異微小的序列群組成[17]。病毒的重要生物學特性如適應性和寄主范圍可能與準種變異水平有關(guān)，Schneider等[18]利用TMV、CMV和CCMV這3種具有共同進化聯(lián)系的病毒侵染同種寄主植物后分析其準種變異水平，發(fā)現(xiàn)準種變異水平與其寄主范圍相對應，寄主范圍最廣的CMV準種變異水平最高，其高度的多樣性可以使其較易適應新的選擇壓力進入新的生境，造成更大的危害。本研究分析了灰飛虱攜帶的20個RSV分離物與水稻上分離物的NS2和NS3基因的分子變異特征及系統(tǒng)進化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)2個基因的遺傳結(jié)構(gòu)均與地緣和寄主(水稻和灰飛虱)相關(guān)，結(jié)合灰飛虱攜帶RSV的cp和sp基因的研究結(jié)果，進一步暗示了RSV可能符合病毒準種的遺傳結(jié)構(gòu)特征。

這一結(jié)果與魏太云等[19-20]的研究結(jié)果基本一致，認為RSV自然種群遺傳結(jié)構(gòu)符合準種結(jié)構(gòu)特征分布，各基因遺傳多樣性值上略有差異，與之編碼的功能蛋白在植物寄主及介體昆蟲互作過程中所受的負選擇壓力有關(guān)。植物病毒的進化機制研究表明奠基者效應、選擇(正、負)、互補為植物病毒種群遺傳結(jié)構(gòu)的主要變異機制[21]，其中負選擇主要是在維持病毒與寄主植物或介體昆蟲的有效互作中起作用，本研究對RSV-NS2和NS3基因的進化限制系數(shù)進行測定，選擇Z-test作為選擇壓的檢測方法，結(jié)果2個基因的dn

基于2基因核苷酸和氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹都顯示了中國云南水稻上RSV分離物獨立成組，并且在分子變異熱點的分析上云南獨立組的氨基酸變異規(guī)律也較為一致，表明RSV-NS2和NS3的在遺傳進化中出現(xiàn)了一定的地理隔離，這也是病毒變異的主要動力之一，究其原因可能與云南獨特的生態(tài)環(huán)境和豐富的生物多樣性相關(guān)，云南大部分是山區(qū)，地理隔離比較明顯，不同地區(qū)特別是高山相隔地區(qū)間的灰飛虱很難相互交配，于是造成了其所處地區(qū)獨立的遺傳結(jié)構(gòu)，故RSV在與植物寄主長期的互作關(guān)系中形成了具有云南特色的組群。但同時發(fā)現(xiàn)灰飛虱攜帶的云南地區(qū)的RSV分離物與云南大部分水稻上分離物處于不同的組群，說明云南地區(qū)的RSV種群遺傳結(jié)構(gòu)比較復雜，這與云南地區(qū)稻作栽培歷史悠久、水稻品種多、各地栽培制度和品種布局各異，加上生境變化異常、地理氣候多變等因素有關(guān)。另外中國沿海及黃淮地區(qū)與日本、韓國等地灰飛虱和水稻上分離物位于同一組群，說明三地RSV存在著一定的交流，側(cè)面驗證了灰飛虱遠距離遷飛的可能性。早在1774年Hirao等[22]就發(fā)現(xiàn)我國東海上存在著灰飛虱，并且這些灰飛虱隨著每年夏季的東南風遠距離遷飛到日本的西南地區(qū)；2011年日本學者酒井淳一對日本九州和中國東部地區(qū)RSV的N、NCP、IR3和IR4系統(tǒng)發(fā)育樹與氨基酸變異熱點分析結(jié)果表明日本九州RSV遺傳結(jié)構(gòu)與中國東部地區(qū)的相似，推測其可能是同一起源；韓國地區(qū)RSV暴發(fā)時間與日本及我國江、浙、滬一帶的暴發(fā)時間也相當吻合[23]，預測三地RSV具有共同的起源，從病害流行的時間和地點看，我國的RSV更可能起源于日本。

本研究結(jié)果還顯示同一地理種群的灰飛虱攜帶的RSV分離物與水稻上分離物處于不同的亞組群，表明其分子變異還與寄主相關(guān)。有研究表明植物蟲傳病毒的種群遺傳多樣性在很大程度上受需要維持病毒與介體昆蟲間特異性互作所限制[24]，RSV既是植物病毒又是昆蟲病毒，在水稻和灰飛虱2種不同類型的寄主中，由RNA2和3編碼的NS2和NS3蛋白在病毒傳播過程中功能不盡相同，因此推測它的遺傳多樣性的分布至少在功能的角度(氨基酸序列)必然與寄主相關(guān)，本實驗的結(jié)果也驗證了這一點。另核苷酸序列的變異多數(shù)為無義突變，2基因的變異都較小，說明其爆發(fā)流行中的決定因素并不在于RSV變異，而主要取決于與病原本身無關(guān)的介體或環(huán)境等因素，因此若要深入地研究病毒的災變規(guī)律，還需系統(tǒng)地調(diào)查病毒病害和介體昆蟲的發(fā)生規(guī)律以及發(fā)生地的種植結(jié)構(gòu)和地理氣候等因素。本室多年來的研究(結(jié)果另文發(fā)表)顯示2000年以來在以江蘇為中心的中國沿海地區(qū)RSV的爆發(fā)流行可能除了品種這一基本要素外，主要是由環(huán)境因素引起的，在這一階段的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中出現(xiàn)了適應灰飛虱發(fā)生和RSV傳播的有利因素從而導致了RSV的流行，其中灰飛虱帶毒率與病情嚴重度呈不同程度的相關(guān)，表明其為該病害流行的一個關(guān)鍵因子。因此在水稻條紋葉枯病的控制方面，應從環(huán)境因素考慮找到反映病害流行的自然關(guān)鍵因子，明確病害流行的自然成因，從而采取適當?shù)膽獙Υ胧瞬攀强刂破湮：Φ母尽?/p>

[1]祝 雯, 詹家綏. 植物病原物的群體遺傳學[J]. 遺傳, 2012,34(2):157-166.

[2]Toriyama S. Rice stripe virus[M]. CMI/AAB. Scotland: Descriptions of Plant Viruses, 2000: 375.

[3]Kisimoto R, Yamada Y. Present Status of Controlling Rice Stripe Virus[A]. In: Hadidi A, Khetarpal R K, Koganezawa H. Plant Virus Disease Control[C]. St. Paul. Minnesota: APS Press, 1991:470-481.

[4]Ren C M, Cheng Z B, Miao Q, et al. First report of rice stripe virus in Vietnam[J]. Plant Disease, 2013, 97(8): 1123.

[5]Hibino H. Biology and Epidemiology of rice viruses[J]. Annual Review of Phytopathology, 1996, 34: 249-274.

[6]周益軍, 程兆榜, 熊如意, 等. 水稻條紋葉枯病[M]. 南京:江蘇科技出版社, 2010:2-3.

[7]程兆榜, 任春梅, 周益軍, 等. 灰飛虱來源的水稻條紋病毒外殼蛋白基因遺傳多樣性[J]. 植物病理學報, 2012,42(6):585-593.

[8]任春梅, 程兆榜, 季英華, 等. 灰飛虱來源的水稻條紋病毒病害特異性蛋白基因遺傳多樣性[J]. 華北農(nóng)學報, 2010, 25(6):1-6.

[9]周益軍, 李 碩, 程兆榜, 等. 中國水稻條紋葉枯病研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報, 2012, 28(5):1007 -1015.

[10]Takahashi M, Goto C, Matsuda I, et al. Expression of rice stripe virus 22.8 k protein in insect cells[J]. Ann Phytopathol Soc Jpn, 1999,65(3): 337.

[11]Du Z, Xiao D, Wu J, et al. p2 of rice stripe virus(RSV) interacts with OsSGS3 and is a silencing suppressor[J]. Mol Plant Pathol, 2011, 12(8): 808-814.

[12]Xiong R Y, Wu J X, Zhou Y J, et al. Characterization and subcellular localization of an RNA silencing suppressor encoded by Rice stripe Tenuivirus[J].Virology, 2009, 387(1): 29-40.

[13]周益軍, 劉海建, 王貴珍, 等. 灰飛虱攜帶的水稻條紋病毒免疫檢測[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2004(1):50-51.

[14]Sakai J, Onuki M, Matsukura K, et al. Rice stripe virus population in Kyushu district is closely related to that of eastern China in a phylogenetic analysis[J]. Kyushu Pl. Prot. Res.,2011,57:7-13(in Japanese).

[15]Jonson G M, Choi H S, Kim J S, et al. Complete genome sequence of the RNAs 3 and 4 segments of Rice stripe virus isolates in Korea and their phylogenetic relationships with Japan and China isolates[J]. Plant Pathol J, 25:142-150.

[16]Roossinck M J. Mechanisms of plant virus evolution[J]. Annual Review of Phytopathology, 1997, 35(1): 191-209.

[17]Saenz P, Quiot L, Quiot J B, et al. Pathogenicity determinants in the complex virus population of a Plum pox virus isolate[J]. Mol Plant Microbe Interact, 2001, 14(3): 278-287.

[18]Schneider W L, Roossinck M J. Evolutionarily related Sindbis-like plant viruses maintain different levels of population diversity in a common host[J]. Journal of Virology, 2000, 74(7): 3130-3134.

[19]Wei T Y, Yang J G, Liao F L, et al. Genetic diversity and population structure of rice stripe virus in China[J]. Journal of General Virology, 2009, 90: 1025-1034.

[20]魏太云,林含新,吳祖建,等. 水稻條紋病毒NS2 基因遺傳多樣性分析[J]. 中國生物化學與分子生物學報,2003,19(5):600-605.

[21]Garcia-arenal F, Fraile A, Malpica J M. Variability and genetic structure of plant virus populations[J]. Ann Rev Phytopathol, 2001, 39:157-186.

[22]Hirao J, Ito K. Observation on rice planthoppers collected over the East China sea in June and July[J]. Japanese Journal of Applied entomology and Zoology, 1974, 24(1): 121.

[23]Lee S C. Rice stripe disease in Korea[A]. In: The virus disease of rice plant[M]. Baltimore:John Hopkins Press. 1969: 67-73.

[24]Sanz A I, Fraile A, Gallego J M, et al. Genetic variability of natural populations of cotton leaf curl geminivirus, a single-stranded DNA virus[J]. Journal of Molecular Evolution, 1999, 49(5): 672-681.

(責任編輯 李山云)

Molecular Variality ofNS2 andNS3 Genes from Rice Stripe Virus inLaodelphaxstriatellus

REN Chun-mei, CHENG Zhao-bang*, YANG Liu, MIAO Qian, ZHOU Yi-jun

(Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu Nanjing 210014, China)

In order to reveal the molecular variation characteristics ofNS2 andNS3 genes from rice stripe virus (RSV) in the small brown planthopper (SBPH,LaodelphaxstriatellusFallén), we collected twenty SBPH isofemale lines with RSV from Jiangsu, Yunnan, Shandong, Hebei province, China. The specific fragments ofNS2 andNS3 genes were amplified by RT-PCR, then were cloned and sequenced. Bioinformatics software was used to analyze the molecular variation characteristics and phylogenetic relationship of RSV isolates from different hosts and regions combining with other isolates sequences reported in Genbank. Sequence determination showed that the identities ofNS2 andNS3 genes nucleotide and amino acid sequences among the 20 isolates ranged from 96.5 % to 100 % (NS2) and 95.4 % to 100 % (NS3), 97.0 % to 100 % (NS2) and 96.2 % to 100 % (NS3). The analysis of phylogenetic tree constructed on nucleotide sequence showed that two genes were obviously divided into two groups, one group included all the rice isolates of Yunnan in China, genetic distance between the two groups were 0.05711 (NS2) and 0.06081 (NS3), the results of Z-test showed that the two genes were under the pressure of strong negative selection. Analysis of phylogenetic tree and variation hotspot constructed onNS2 andNS3 amino acid sequences, molecular variation of RSV was strongly associated with its geographical origin, two genes could be grouped into two geographical populations, i.e. Yunnan in China and the restswithout Yunnan in China; secondly associated with its host origin, two genes could be grouped into SBPH and rice populations.

Rice stripe virus;NS2 andNS3 genes; Molecular valiality; Hosts colony; Geographical colony

1001-4829(2016)08-1854-10

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.018

2015-10-09

國家自然科學基金(31201506)；國家公益性(農(nóng)業(yè))行業(yè)專項(201003031)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目[CX(13)5026]

任春梅(1981-)，女，副研究員，主要從事植物病毒方面的研究，E-mail:renjie_rcm@126.com,*為通訊作者: E-mail: onlyone8501@126.com。

S432.45

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