牛 蓓，徐 鶯，宋 君，郭曉恒，符 佳，鄒 亮，陳 放*，高孝錦，郭 靜

(1.成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析檢測(cè)中心，四川 成都 610066)

?

烏桕硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶基因的克隆及表達(dá)

牛 蓓1，徐 鶯2，宋 君3，郭曉恒1，符 佳1，鄒 亮1，陳 放2*，高孝錦1，郭 靜1

(1.成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析檢測(cè)中心，四川 成都 610066)

硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶是植物脂肪酸合成代謝的關(guān)鍵酶，直接調(diào)節(jié)膜脂和貯脂中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例。本研究通過RT-PCR及RACE技術(shù), 克隆烏桕硬脂酰-酰基載體蛋白脫飽和酶(SsSAD)的cDNA全長(zhǎng)序列。結(jié)果顯示，該序列包含1個(gè)1191 bp的完整的開放閱讀框(GenBank登錄號(hào)為EF079655)，編碼396個(gè)氨基酸，含33個(gè)氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)移肽。其成熟肽含有363個(gè)氨基酸，推測(cè)其分子量為41.5 kDa，等電點(diǎn)為5.42。同源性分析及同源建模數(shù)據(jù)顯示SsSAD和其它物種的SAD有較高的同源性，含有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建原核表達(dá)載體pMAL-SsSAD，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。

烏桕；硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶；克?。簧镄畔W(xué)分析；原核表達(dá)

近年來，全球能源緊張，導(dǎo)致生物柴油倍受重視。早期英法美各國(guó)以油料農(nóng)作物為主，進(jìn)行生物柴油的開發(fā)[1-3]，但這會(huì)占用過多的耕地面積。木本植物具有能量密度高，一次性種植多年收益的特點(diǎn)[4]。因而，各國(guó)研究者開始對(duì)本土油料樹種資源進(jìn)行篩選，力求尋找到種子中富含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸的樹種加以開發(fā)利用[5]。烏桕為我國(guó)四大油料樹種之一，其種子含油量高達(dá)41 %～47 %[6-7]，其中飽和脂肪酸含量約為40 %，不飽和脂肪酸含量約占60 %[8]，脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度主要集中在C17～C20，與普通生物柴油主要成分的碳鏈長(zhǎng)度類似[9]，因此開展烏桕生物質(zhì)能的研究，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

植物硬脂酰-?；d體蛋白(ACP)脫飽和酶(SAD)是一種脂肪酸合成代謝的關(guān)鍵酶。它催化硬脂酰-ACP脫飽和，在第9～10碳原子之間脫氫形成一個(gè)雙鍵，產(chǎn)生油酰-ACP，是植物典型不飽和脂肪酸生物合成途徑的第一步脫飽和酶，可直接調(diào)節(jié)膜脂和貯脂中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例[10]，參與植物衰老調(diào)控、化學(xué)防御等生理過程[7,10]。近年來，該酶的分子機(jī)理及應(yīng)用引起了人們的廣泛重視。除了從蓖麻、水稻、擬南芥、油菜、玉米、菠菜等植物[9]中陸續(xù)分離到SAD基因外，轉(zhuǎn)基因研究數(shù)據(jù)顯示SAD基因的RNA干擾[11]和核酶處理[12]，都能改變轉(zhuǎn)基因作物中的飽和與不飽和C16及 C18脂肪酸的含量。

因此，本研究通過RT-PCR及RACE技術(shù), 從烏桕中克隆出硬脂酰-酰基載體蛋白脫飽和酶(SsSAD)的cDNA全長(zhǎng)序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。構(gòu)建原核表達(dá)載體pMAL-SsSAD，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，在不同時(shí)間、不同IPTG濃度和不同溫度條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，得到目的蛋白。為今后進(jìn)一步深入研究烏桕SAD基因的表達(dá)情況、功能，以及基因調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 烏桕種子采于四川洪雅縣。立即凍存于液氮中，而后放于-80 ℃的冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌JM109菌株為四川大學(xué)資源與開發(fā)實(shí)驗(yàn)室保存。測(cè)序和亞克隆載體pMD18-T (TaKaRa, Dalian, China)。原核表達(dá)載體pMAL-c2E (Biolab, USA)。大腸桿菌DH5α表達(dá)菌株。ExTaq酶、反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、各種限制性內(nèi)切酶都購(gòu)于TaKaRa。VentR DNA聚合酶購(gòu)自BioLabs。小量膠回收試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自上海華舜公司。IPTG、瓊脂糖、瓊脂粉、Tris、SDS購(gòu)于Amersham。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取 采用張容等人[13]的方法對(duì)總RNA進(jìn)行提取。提出的RNA先經(jīng)DNase37 ℃保溫30 min，除去DNA，再參照植物RNA提取試劑盒使用手冊(cè)(華舜)純化?；厥盏腞NA經(jīng)過純度和濃度檢測(cè)后，存放-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 烏桕硬脂酰-ACP脫飽和酶基因的克隆 保守區(qū)片段、5′端和3′端RECE片段[14]克隆：通過BLAST對(duì)比，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物91和92(表1)。用純化的RNA為模板，以oligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增得到烏桕硬脂酰-ACP脫飽和酶基因cDNA保守片段。對(duì)擴(kuò)增片段跑膠、回收并測(cè)序比對(duì)驗(yàn)證其正確性。根據(jù)保守片段的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)5個(gè)特異引物(931，932，951，952和953)以及2個(gè)通用引物AP1和AP2(表1)。通過5′-RACE和3′-RACE的方法，分別擴(kuò)增得到SsSAD基因的5′端和3′端片段。所有反應(yīng)程序均為：95 ℃ 5 min ；35個(gè)循環(huán)(94 ℃ 40 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min),72 ℃延伸8 min，4 ℃保溫。所得的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，并回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI的Blastn 進(jìn)行比對(duì)分析，驗(yàn)證克隆片段是否屬于SAD基因。

表1 基因克隆及表達(dá)所用引物序列

全長(zhǎng)cDNA片段和閱讀框的克?。焊鶕?jù)拼接片段設(shè)計(jì)引物9c1和9c2、9ORF1和9ORF2，采用高保真VentR DNA聚合酶分別克隆SsSAD基因的cDNA全長(zhǎng)和閱讀框序列。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；35個(gè)循環(huán)(94 ℃ 40 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min), 72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。所得的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，并回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序。所得序列在NCBI的Blastn 進(jìn)行比對(duì)分析，驗(yàn)證克隆片段是否屬于SAD基因。

1.2.3 硬脂酰-ACP脫飽和酶基因生物信息學(xué)分析 使用的生物軟件：DNAMAN6.0、Clustalx 1.8、TreeView、 Primer Primer5.0、Vector NIT 7.0，DNA star，COOT，PyMOL, MEGA6.0。使用的網(wǎng)上的數(shù)據(jù)庫(kù)和在線分析：

Blast: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi；

ORF finder: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html；

Compute pI/Mw: http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html；

綜上可知，隨著日中有“金雞”說法的出現(xiàn)與流傳，自宋以后，學(xué)者們又試圖從如鏡像、折射的角度；或從陰陽(yáng)互藏、陰陽(yáng)交感的理論，來推測(cè)日中為何會(huì)有“雞”。但由前引北宋董逌的《跋月宮圖》中駁斥當(dāng)時(shí)人“知日中為烏，而不知為雞”之語(yǔ)，以及以上各家的解釋亦可發(fā)現(xiàn)：宋代以后的人們，對(duì)于此說可能已多有質(zhì)疑。

TMHMM: http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/；

Protparam: http://web.expasy.org/protparam/；

CD Search: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi；

Swiss-model: http://swissmodel.expasy.org/；

ChloroP: http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/；

SOPMA：https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html。

外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE檢測(cè)[15]：挑取含重組質(zhì)粒的DH5α單菌落接種于含Amp(100 mg/L)的LB中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按5 %的比例轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)30 min左右，至菌液的OD600達(dá)到0.6。將菌液分成13份。一份不加IPTG，10 000 r/min離心1 min，收集菌體保存于-20 ℃；其余12份按表2所列進(jìn)行誘導(dǎo)，分別于1、2、3、5 h，取出相應(yīng)的1 mL的菌液，10 000 r/min離心1 min，收集菌體保存于-20 ℃。同時(shí)做pMAL-c2E空載的DH5α菌對(duì)照。 以pMAL-SsSAD重組不加IPTG誘導(dǎo)的菌體和pMAL-c2E空載菌作為本底表達(dá)對(duì)照，將各處理收獲的菌體進(jìn)行SDS-PAGE(12 %)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬脂酰-ACP脫飽和酶基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

根據(jù)其他物種在GenBank中登錄的硬脂酰-ACP脫飽和酶基因的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以烏桕種子cDNA為模板，擴(kuò)增出長(zhǎng)約473 bp的片段(圖1-1)。將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastn比對(duì)，其與蓖麻 (X56508), 麻瘋樹(DQ084491)和擬南芥 (AF395441.1)有很高的同源性, 分別為94 %, 92 %和84 %,因此初步推測(cè)其為烏桕的硬脂酰-ACP脫飽和酶基因的保守區(qū)片段。根據(jù)該保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異引物，通過巢式PCR擴(kuò)增到約658 bp 3′端片段(圖1-2)，又采用TdT末端加尾和巢式PCR的方法擴(kuò)增得到約656 bp 5′端片段(圖1-3)。采用軟件Vecter NTI suite 7.0的ContigExpress軟件對(duì)三段序列進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)cDNA。用NCBI中的ORF finder對(duì)序列分析發(fā)現(xiàn),全長(zhǎng)cDNA包含一個(gè)完整的開放閱讀框1191 bp，編碼396個(gè)氨基酸.根據(jù)拼接序列,設(shè)計(jì)引物9ORF1和9ORF2、9c1和9c2，得到烏桕的硬脂酰-ACP脫飽和酶基因閱讀框和全長(zhǎng)cDNA(圖1-4和圖1-5)。GenBank登錄號(hào)為EF079655。

表2 SsSAD基因原核誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間、濃度和溫度條件優(yōu)化

注：誘導(dǎo)溫度優(yōu)化時(shí)，加入IPTG終濃度為1 mM，誘導(dǎo)時(shí)間為2 h；誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化時(shí)，加入IPTG終濃度為1 mM, 溫度為37 ℃；IPTG濃度梯度優(yōu)化時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間為2 h，溫度為37 ℃。

1:SsSAD基因中間cDNA片段；2: SsSAD基因3′端cDNA片段；3: SsSAD基因5′端cDNA片段(箭頭處); 4: SsSAD基因ORF；5: SsSAD基因全長(zhǎng)(箭頭處)1: The middle fragments; 2: The 3′fragments of SsSAD gene; 3: 5′fragments of SsSAD gene (arrow); 4: ORF of SsSAD gene; 5:The full-length cDNA of SsSAD (arrow)圖1 烏桕的SsSAD基因片段、ORF和全長(zhǎng)cDNA的克隆Fig.1 Amplification of fragments, ORF and the full-length cDNA of SsSAD gene

1-SAD:Sapium sebiferum SAD (ABN13874);2-SAD: Olea europaeafruit SAD (AAB67840) ;3-SAD:Ricinus communis SAD (CAA39859); 4-SAD:Jatropha curcas SAD(AAY86086); 5-SAD:Helianthus annuus SAD (AAB65144); 6-SAD:Sesamum indicum SAD (BAA07681);7-SAD:Glycinemax SAD (AAX86050); 8-SAD:Gossypium hirsutum SAD(CAB75356);9-SAD:Carthamus tinctorius SAD (AAA33021); 10-SAD:Oryza sativa SAD(NP001045215); 11-SAD: Brassica napus SAD (CAA52786.1);12-SAD:Arabidopsis thaliana (AtSAD) (AAK85232.1);葉綠體轉(zhuǎn)移肽, 2. Π型酶保守區(qū)；1.a chloroplast transit peptide，2. conservative district of Π enzyme圖2 SsSAD基因推測(cè)的氨基酸序列與其他植物SADs的同源比對(duì)Fig.2 Amino acid sequence alignment of Sapium sebiferum SsSAD and other plant SADs

2.2 烏桕的SsSAD的氨基酸序列分析

利用在線蛋白質(zhì)分析軟件ChloroP和Compute pI/Mw進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白前端含一個(gè)33個(gè)氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)移肽(圖2)。其成熟肽的分子量為41.5 kDa，等電點(diǎn)為5.42。其中，含中性疏水性氨基酸 43.7 %，中性親水性氨基酸 27.8 %，酸性氨基酸 14.1 %，堿性氨基酸 14.4 % 。TMHMM-2.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白沒跨膜結(jié)構(gòu)，位于膜外。高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，α螺旋是SsSAD成熟肽的主要結(jié)構(gòu)元件，其含量占50.28 %，此外，無規(guī)則卷曲占28.45 %，β片層占12.28 %，β折疊占9.12 %。同源性比對(duì)結(jié)果顯示，烏桕SsSAD全長(zhǎng)氨基酸序列和其他物種有較高的同源性(76.24 %～92.57 %)，具有1個(gè)高度保守的基序(圖2)。

圖3 13種植物的SAD的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic N-J tree analysis of SADs from 13 plants

1: SsSAD和RcSAD成熟肽氨基酸的比對(duì)； 2:SsSAD蛋白預(yù)測(cè)的3D結(jié)構(gòu)；3: SsSAD和RcSAD活性中心的對(duì)比,淺灰色為SsSAD的活性中心，深灰色為RcSAD的活性中心1: Amino acid squences comparison between mature SsSAD and RcSAD; 2：The predicted 3D protein structure of mature SsSAD；3:Comparison in active domains from SsSAD and RcSAD；Light gray: Active domains from SsSAD; Deep gray: Active domains from RcSAD圖4 SsSAD成熟肽的空間結(jié)構(gòu)Fig.4 The spatial structure of mature SsSAD

采用MEGA6.0 對(duì)13種植物的SAD進(jìn)行N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，圖3顯示烏桕的SAD與大戟科的麻瘋樹、蓖麻、油桐和木油桐的SAD在同一個(gè)分枝，親緣關(guān)系很近。

氨基酸序列比對(duì)顯示烏桕SsSAD成熟肽的氨基酸與蓖麻的硬脂酰-ACP脫飽和酶成熟肽RcSAD具有較高的相似性，這兩條多肽在酶活性中心的4個(gè)α-螺旋上，氨基酸幾乎完全一致(圖4-1)。通過同源建模預(yù)測(cè)烏桕硬脂酰-ACP脫飽和酶的3D結(jié)構(gòu)(圖4-2)。將烏桕SsSAD成熟肽與蓖麻的RcSAD成熟肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行重疊，結(jié)果顯示這2個(gè)蛋白在活性中心的6個(gè)氨基酸完全一致，其余部分幾乎完全重合(圖4-3)。

2.3 烏桕的SsSAD的原核表達(dá)

為進(jìn)一步研究SsSAD基因的表達(dá)情況，將切去葉綠體轉(zhuǎn)移肽的SsSAD基因ORF序列與pMAL載體重組，構(gòu)建了原核表達(dá)的pMAL-SsSAD重組質(zhì)粒，并將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了SDS-PAGE電泳檢測(cè)。通過對(duì)蛋白質(zhì)電泳圖分析，pMAL-SsSAD重組質(zhì)粒在IPTG誘導(dǎo)作用下，出現(xiàn)了一條新的蛋白質(zhì)條帶，分子量約為81 kDa，扣除載體上約40 kDa的malE麥芽糖結(jié)合蛋白，即得到一個(gè)約為41 kDa的蛋白質(zhì)，這與SsSAD蛋白理論分子量相符。此外，又對(duì)轉(zhuǎn)化子做了溫度梯度、誘導(dǎo)時(shí)間梯度和IPTG濃度梯度的誘導(dǎo)，優(yōu)化誘導(dǎo)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)菌體在不同溫度梯度下，用相同IPTG濃度(1 mM)下誘導(dǎo)2 h，發(fā)現(xiàn)在37 ℃的時(shí)候，表達(dá)產(chǎn)物最高(圖5)。這說明37 ℃是菌體表達(dá)產(chǎn)物的最適溫度；在37 ℃、1 mM IPTG濃度誘導(dǎo)下，目的蛋白隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增多(圖6)；而在37 ℃下，用不同濃度梯度的IPTG誘導(dǎo)2 h后，目的蛋白表達(dá)量基本一致，說明IPTG濃度的變化對(duì)pMAL-SsSAD重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)沒有明顯的影響(圖7)。

1：空載誘導(dǎo)對(duì)照; 2：蛋白質(zhì)分子量Marker; 3：未誘導(dǎo)重組對(duì)照; 4：37 ℃誘導(dǎo); 5：32 ℃誘導(dǎo); 6：28 ℃誘導(dǎo);7：24° ℃誘導(dǎo); 箭頭所指條帶為目的蛋白1:Empty vector induced by IPTG as control1; 2:Protein marker; 3:No induced recombinant plasmid as control2; 4:Induced in 37 ℃; 5:Induced in 32 ℃; 6: Induced in 28 ℃; 7 :Induced in 24 ℃; Arrow stripe for target protein 圖5 溫度梯度對(duì)SsSAD基因的原核表達(dá)影響Fig.5 Effects of temperature gradient on prokaryotic expression of SsSAD

1：蛋白質(zhì)分子量Marker; 2.空載誘導(dǎo)對(duì)照; 3. 未誘導(dǎo)的重組對(duì)照; 4:誘導(dǎo)5 h; 5:誘導(dǎo)3 h; 6:誘導(dǎo)2 h; 7: 誘導(dǎo)1 h; 箭頭所指條帶為目的蛋白1:Protein marker; 2: Empty vector induced by IPTG as control1; 3: No induced recombinant plasmid as control2; 4: Induced in 5 h; 5: Induced in 3 h; 6: Induced in 2 h; 7: Induced in1 h; Arrow stripe for target protein 圖6 時(shí)間梯度對(duì)SsSAD基因的原核表達(dá)影響Fig.6 Effect of time gradient on prokaryotic expression of SsSAD

1:2 mM IPTG誘導(dǎo); 2:1.5 mM IPTG誘導(dǎo); 3:1 mM IPTG誘導(dǎo); 4: 0.5 mM IPTG誘導(dǎo); 5:空載誘導(dǎo)對(duì)照; 6:蛋白質(zhì)分子量Marker; 7:未誘導(dǎo)重組對(duì)照; 箭頭所指條帶為目的蛋白1: Induced by 2 mM IPTG; 2: Induced by 1.5 mM IPTG; 3:Induced by1 mM IPTG; 4: Induced by 0.5 mM IPTG; 5: Empty vector induced by IPTG as control1; 6:Protein marker; 7: No induced recombinant plasmid as control2; Arrow stripe for target protein圖7 IPTG梯度對(duì)SsSAD基因的原核表達(dá)影響Fig.7 Effect of IPTG gradient on prokaryotic expression of SsSAD

3 討論與結(jié)論

Lindqvist Y.[16]于1996年報(bào)道蓖麻的硬脂酰-ACP脫飽和酶的晶體結(jié)構(gòu)，這就為預(yù)測(cè)同家族的SAD蛋白結(jié)構(gòu)提供了一個(gè)平臺(tái)。通過蓖麻RcSAD成熟肽和烏桕SsSAD成熟肽的比對(duì),采用同源建模的方法得到烏桕硬脂酰-ACP脫飽和酶的結(jié)構(gòu)。其具有11個(gè)α-螺旋，包含的氨基酸分別為：α1(36～51)、α2(75～88)、α3a(91～106)、α3b(108～118)、α4(130～158)、α5(161～176)、α6(184～213)、α7(215～245)、α8(249～262)、α9(278～290)、α10(293～309)、α11(317～341)(圖4-1)。這些螺旋中的9個(gè)α-螺旋(α3～α11)形成一個(gè)反向平行的α-螺旋束，其中α3、α4、α6和α7形成的一個(gè)四螺旋束結(jié)構(gòu)[16]。該結(jié)構(gòu)位于SsSAD的保守區(qū)，并含有著一個(gè)由兩個(gè)鐵原子組成的二鐵中心[17]。圖4-2和圖4-3結(jié)構(gòu)中深灰色的球代表Fe原子。Fe原子的6個(gè)配基即是四螺旋束的6個(gè)氨基酸的側(cè)鏈或其基團(tuán)，其中一個(gè)鐵原子的配基是E196、H232，另一個(gè)鐵原子的配基是E105、H146，而E143、E229是兩個(gè)鐵原子的橋連配基[16-17]。將蓖麻RcSAD和烏桕SsSAD蛋白結(jié)構(gòu)重疊，比較二者在結(jié)構(gòu)上的差異。圖4-3顯示這2個(gè)蛋白在活性中心的6個(gè)氨基酸完全一致，其余部分幾乎完全重合。兩鐵原子之間均通過一個(gè)氧原子相連，形成非常對(duì)稱的Fe-O-Fe二鐵氧簇，二鐵中心及部分四螺旋束的氨基酸側(cè)鏈或基團(tuán)形成酶活性中心[17-18]。從結(jié)構(gòu)推測(cè)兩者的功能也十分相近, 特異性的底物硬脂酰 -ACP 分子通過與位于二聚體分子表面的凹槽內(nèi)部的酶活性中心結(jié)合，進(jìn)行脂肪酸碳鏈第9～10碳原子的氧化還原反應(yīng)[9,18]。

為下一步蛋白的活性鑒定提供一定結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，構(gòu)建pMAL-c2E-大腸桿菌DH5α的原核表達(dá)體系來誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。成功獲得分子量約為 41.5 kDa 的蛋白質(zhì)，推測(cè)該蛋白可能是烏桕SsSAD 天然二聚體的寡聚單體形態(tài)。

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(責(zé)任編輯 陳 虹)

Cloning and Expression of Stearoyl-acyl Carrier Protein Desaturase Gene fromSapiumsebiferum

NIU Bei1, XU Ying2, SONG Jun3, GUO Xiao-heng1, FU Jia1, ZHOU Liang1, CHEN Fang2*, GAO Xiao-jin1, GUO Jing1

(1.School of Medical, Chengdu University, Sichuan Chengdu 610106,China; 2.College of Life Science, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610064,China; 3.Analysis and Test Center of Sichuan Academy of Agriculture Science, Sichuan Chengdu 610066,China)

Stearoyl-acyl carrier protein (stearoyl-ACP) desaturase catalyzes the first desaturation step in seed oil biosynthesis, converting stearoyl-ACP to oleoyl-ACP. It plays a key role in determining the ratio of saturated fatty acids to unsaturated fatty acids in membrane lipids and store lipids form plants. In this study, cDNA sequence ofSsSADgene was cloned by RT-PCR and RACE technology. The result showed that a full-lengthSsSADgene contained an 1191 bp open reading frame (ORF) encoding 396 amino acid residues (GenBank accession number: EF079655), which had a chloroplast transit peptide of 33 amino acids. The mature peptide contained 363 amino acids, and the calculated molecular weight and isoelectric point of the mature protein were predicted to be 41.5 kDa and 5.42, respectively. The amino acid sequence having a conserved region had a much higher match with other stearoyl-acyl carrier protein desaturases (SADs) by homology modeling analysis. The recombinant plasmid pMAL-SsSAD was constructed and expressed inE.coliDH5α, and its best induction conditions were optimized.

Sapiumsebiferum; Stearoyl-acyl carrier protein desaturase; Cloning; Bioinformatics analysis; Prokaryotic expression

1001-4829(2016)08-1806-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.009

2016-01-12

四川省教育廳項(xiàng)目“油料樹種烏桕的FAD2基因表達(dá)調(diào)控研究”(12ZB178); 成都大學(xué)自然科學(xué)青年基金“大戟科藥用植物活性物質(zhì)篩選”(2010XJZ29); 成都大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃孵化培育項(xiàng)目“烏桕硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶基因的克隆和表達(dá)分析”

牛 蓓，女，四川成都人，博士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail: niubeiucd@126.com,*為通訊作者。

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