段亞飛, 張 喆, 李吉濤, 李 健, 劉 萍

( 1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071 )

脊尾白蝦血細(xì)胞ESTs的生物信息學(xué)與微衛(wèi)星序列特征分析

段亞飛1, 張 喆1, 李吉濤2, 3, 李 健2, 3, 劉 萍2, 3

( 1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071 )

對(duì)前期測(cè)序得到的脊尾白蝦血細(xì)胞2853條EST序列進(jìn)行了生物信息學(xué)和微衛(wèi)星序列特征分析。EST序列拼接得到1053條Unigenes，包括329條Contigs和724條Singlets。BLAST分析表明，593 (56.3%)條Uingenes與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因具有相似性。KEGG代謝途徑分析表明，181條Unigenes映射到120條代謝途徑。通過(guò)EST-SSR分析，共得到416條微衛(wèi)星序列，檢出率為14.58%。其中，兩堿基重復(fù)序列374條，占89.90%，AG重復(fù)類(lèi)型最多；三堿基35條，占8.41%，AAT重復(fù)類(lèi)型最多；四堿基7條，占1.68%，AAGT重復(fù)類(lèi)型最多。本研究可為脊尾白蝦功能基因資源挖掘及分子標(biāo)記篩選提供有效數(shù)據(jù)。

脊尾白蝦；血細(xì)胞；EST；生物信息學(xué)；微衛(wèi)星

脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)是我國(guó)黃、渤海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)，具有繁殖能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快和環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。近年來(lái)，脊尾白蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，其遺傳育種研究日益受到重視。脊尾白蝦基因信息和分子遺傳標(biāo)記的發(fā)掘，可以為其功能基因篩選、遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及標(biāo)記輔助育種等奠定基礎(chǔ)。

表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)是指從特定組織來(lái)源的cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行單向測(cè)序而得到的部分cDNA序列，代表了生物體特定組織在某一時(shí)期的表達(dá)基因[3]。表達(dá)序列標(biāo)簽分析可以用于新基因發(fā)現(xiàn)、功能基因篩選、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和基因時(shí)空表達(dá)狀況分析等[3]。微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)是水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種重要的分子標(biāo)記，具有多態(tài)性高、共顯性、通用性好、數(shù)量豐富和在基因組上分布均勻等特點(diǎn)[4-5]。EST-SSR可以避免傳統(tǒng)方法構(gòu)建、篩選文庫(kù)的繁瑣步驟和人力物力的耗費(fèi)，廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物新基因的分離鑒定、比較基因組學(xué)、遺傳圖譜構(gòu)建和基因芯片制備等研究[6-7]。

近年來(lái)，許多甲殼動(dòng)物已獲得EST-SSRs標(biāo)記，如中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)[8]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[9]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[10]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[11]和擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)[12]等。而目前脊尾白蝦微衛(wèi)星標(biāo)記僅見(jiàn)通過(guò)構(gòu)建基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)篩選獲得[13]。本研究利用前期構(gòu)建的脊尾白蝦血細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，對(duì)測(cè)序獲得的EST序列進(jìn)行生物信息學(xué)和微衛(wèi)星序列特征分析，以期為脊尾白蝦功能基因資源挖掘及分子標(biāo)記篩選提供有效數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1脊尾白蝦血細(xì)胞EST序列測(cè)定和分析

利用前期構(gòu)建的脊尾白蝦血細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)[3]，對(duì)其進(jìn)行批量測(cè)序，引物為5′pTriPLEx2 (5′-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3′)。測(cè)得的EST序列，利用Cross-match軟件進(jìn)行引物序列、載體序列及低質(zhì)量序列(<100 bp)去除；利用Phrap軟件對(duì)高質(zhì)量ESTs進(jìn)行序列拼接，拼接結(jié)果為由Contigs和Singlets組成的Unigenes。

1.2 ESTs的相似性比對(duì)、分類(lèi)及代謝途徑分析

利用BLAST軟件對(duì)拼接到的Unigenes與NCBI核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)(E-value < 1e-5)。將所有的Unigenes與日本京都大學(xué)的《京都基因和基因組百科全書(shū)》(KEGG)的PATHWAY子數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較和代謝途徑分析，獲得脊尾白蝦血細(xì)胞的ESTs的部分代謝網(wǎng)絡(luò)信息。

1.3 ESTs的微衛(wèi)星序列特征分析

利用RepeatMasker軟件從拼接的Unigenes中查找微衛(wèi)星序列，最小重復(fù)參數(shù)設(shè)置為重復(fù)7次以上的兩堿基序列，重復(fù)5次以上的三堿基序列，重復(fù)5次以上的四堿基序列。單核苷酸重復(fù)序列未進(jìn)行篩選，因?yàn)橐话阏J(rèn)為其作為多態(tài)性標(biāo)記的意義不大[18]。

2 結(jié) 果

2.1 ESTs的生物信息學(xué)分析

2.1.1 ESTs序列分析

對(duì)脊尾白蝦血細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)批量測(cè)序獲得的EST序列，去除載體序列、引物序列和低質(zhì)量載體序列(<100 bp)后，共得到2853條高質(zhì)量EST序列，平均長(zhǎng)度為493 bp(表1)。利用Phrap軟件進(jìn)行序列拼接，共獲得1053條Unigenes，包括329條(31.24%)Contigs和724條(68.76%)Singlets。對(duì)Unigenes中的ESTs數(shù)量分析可知，Contigs由2～284條ESTs拼接而成，其中大部分是由2～5條ESTs拼接而成，10條Contigs是由多于50條的ESTs拼接而成，只有1條Contigs是由284條ESTs拼接而成(圖1)。

表1 脊尾白蝦血細(xì)胞ESTs基本信息

BLAST分析表明，593(56.3%)條Uingenes與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因具有相似性，22(2.1%)條Uingenes顯示為未知基因，438(41.6%)條Uingenes沒(méi)有任何相似性。ESTs相似比對(duì)的E-value分布表明，276(44.9%)條Uingenes具有高度相似性(E-value < 1e-100)，256(41.6%)條Uingenes具有中度相似性(1e-99

圖1 脊尾白蝦血細(xì)胞ESTs與其所拼接形成的Unigene之間的關(guān)系

圖2 脊尾白蝦血細(xì)胞ESTs相似比對(duì)的E-value分布 圖3 脊尾白蝦血細(xì)胞ESTs匹配的相似物種分布

2.1.2 ESTs的代謝途徑分析

脊尾白蝦血細(xì)胞ESTs的代謝途徑分析表明，共有181條Unigenes得到注釋?zhuān)嚓P(guān)酶類(lèi)參與120條代謝途徑，主要包括代謝、細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息的加工、遺傳信息的加工和人類(lèi)疾病5類(lèi)，其相關(guān)的基因序列分別占33.1%、21.6%、12.2%、16.0%和17.1%。其中，代謝途徑最多的類(lèi)別是氨基酸代謝(11%)，其次為傳染病(10%)，第三為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(9%)(表2)。

表2 脊尾白蝦血細(xì)胞ESTs的代謝途徑分析

2.2 ESTs的微衛(wèi)星序列分析

從血細(xì)胞2853條ESTs序列中，共篩選到微衛(wèi)星序列416個(gè)，占全部ESTs總數(shù)的14.58%?？紤]到堿基互補(bǔ)配對(duì)和計(jì)數(shù)拷貝數(shù)起始?jí)A基順序的差異，本研究將同類(lèi)重復(fù)兼并為一種重復(fù)類(lèi)型代表，如AAG代表六種重復(fù)類(lèi)型，分別為AAG、AGA、GAA、TTC、TCT和CTT。統(tǒng)計(jì)所有重復(fù)類(lèi)型，以?xún)蓧A基重復(fù)序列數(shù)量最多，為374條，占重復(fù)序列總數(shù)的89.90%；其次為三堿基，35個(gè)，占8.41%；再次是四堿基，7個(gè)，占1.68%(表3)。

表3 不同重復(fù)類(lèi)型的重復(fù)序列數(shù)目及其百分比

同類(lèi)型的SSR重復(fù)序列中，各重復(fù)拷貝類(lèi)別所占的比例也各不相同。在兩堿基重復(fù)類(lèi)型中，AG重復(fù)拷貝類(lèi)別最多，為355個(gè)，占94.92%；其次為AC和AT，分別為12(3.21%)和7(1.87%)；未發(fā)現(xiàn)GC重復(fù)拷貝類(lèi)別。三堿基重復(fù)類(lèi)型中，共有6種重復(fù)拷貝類(lèi)別，分別為AAT、AAG、ATC、ACT、AGC和AGG。其中，以AAT最多，為21個(gè)，占60%；其次為ACT，為5個(gè)，占14.29%；再次為AAG和ATC，這兩種重復(fù)拷貝類(lèi)別數(shù)量相同，為3個(gè)，占8.57%。四堿基重復(fù)類(lèi)型中，共有2種重復(fù)拷貝類(lèi)別，分別為AAGT和GCCG，其中以AAGT最多，為7個(gè)，占85.71%；其次為GCCG，為1個(gè)，占14.29%(表4)。

表4脊尾白蝦血細(xì)胞ESTs篩選到的微衛(wèi)星序列

重復(fù)類(lèi)型重復(fù)單元數(shù)量比例/%二堿基AT71.87AG35594.92AC123.21三堿基AAT2160.00AAG38.57ATC38.57ACT514.29AGC12.86AGG25.71四堿基AAGT685.71GCCG114.29

3 討 論

3.1 ESTs生物信息學(xué)分析

通過(guò)對(duì)前期測(cè)序得到的脊尾白蝦血細(xì)胞2853條ESTs進(jìn)行序列拼接，共得到1053條Uingenes。BLAST分析表明，41.6%的Uingenes與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因序列無(wú)相似性，與三疣梭子蟹[14]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[15]等的研究一致。此類(lèi)無(wú)相似性的ESTs可能為新基因序列，表明甲殼類(lèi)尚有大量基因未被發(fā)掘；又可能為已知基因，由于蝦類(lèi)與其他脊椎動(dòng)物的親緣關(guān)系太遠(yuǎn)，而無(wú)法通過(guò)BLAST比對(duì)確定其相似關(guān)系。此外，Xu等[14]認(rèn)為，ESTs是通過(guò)一次測(cè)序得到的序列，未必包含編碼區(qū)，可能是ESTs未能注釋的原因之一。因此，此類(lèi)未得到注釋的ESTs，有待進(jìn)一步的深入研究。

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了物種的基因與基因組、酶促反應(yīng)及其途徑和各種生化物質(zhì)的信息，在基因與基因組、代謝途徑與代謝網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)研究中具有重要作用[16]。KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)不僅能夠提供生化物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化所有可能的代謝途徑，還可以對(duì)催化各步反應(yīng)的酶進(jìn)行全面注解[16]。通過(guò)代謝途徑分析，本研究共有181條Unigenes(17.2%)獲得注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)酶類(lèi)參與120條代謝途徑。代謝途徑分析在多個(gè)水產(chǎn)物種中已有相關(guān)報(bào)道。Meng等[17]對(duì)蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)肌肉EST序列進(jìn)行KEGG代謝途徑分析，共有11.3%的Unigenes得到注釋?zhuān)婕?03個(gè)代謝途徑；其中以代謝方面的Unigenes比例最大，占30.5%，與本研究結(jié)果一致。

3.2 ESTs的微衛(wèi)星序列特征分析

本研究通過(guò)對(duì)脊尾白蝦血細(xì)胞ESTs進(jìn)行SSR篩選，共得到416條(14.58%)SSR序列，表明脊尾白蝦ESTs-SSR序列比例較高。研究表明，動(dòng)物的ESTs-SSR以?xún)蓧A基重復(fù)為主，大部分植物則以三堿基重復(fù)為主[18]。脊尾白蝦血細(xì)胞ESTs-SSR共發(fā)現(xiàn)3種堿基重復(fù)類(lèi)型，以?xún)蓧A基重復(fù)類(lèi)型最多，占89.90%；其次為三堿基重復(fù)類(lèi)型(8.41%)和四堿基重復(fù)類(lèi)型(1.68%)。本研究未發(fā)現(xiàn)五堿基和六堿基重復(fù)類(lèi)型，可能與所分析的ESTs序列的組織差異有關(guān)。

兩堿基重復(fù)類(lèi)型中，共發(fā)現(xiàn)3種重復(fù)拷貝類(lèi)別，其中以AG最多，其次是AC，與斑節(jié)對(duì)蝦[19]、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[20]和三疣梭子蟹[21]等一致。賈舒雯等[13]通過(guò)構(gòu)建脊尾白蝦微衛(wèi)星富集文庫(kù)對(duì)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦基因組微衛(wèi)星核心序列以AG重復(fù)最多，占88.94%；其次是AC重復(fù)，占5.03%。這與本研究?jī)蓧A基重復(fù)類(lèi)型結(jié)果(AG 94.92%，AC 3.21%)一致，由此說(shuō)明AG重復(fù)拷貝類(lèi)別在脊尾白蝦基因組中含量豐富。但本研究并未發(fā)現(xiàn)GC重復(fù)，而GC兩堿基重復(fù)在其他物種基因組中的含量均較少[22-23]。

三堿基重復(fù)類(lèi)型中，共發(fā)現(xiàn)6種重復(fù)拷貝類(lèi)別，其中以AAT最多，占60%。研究表明，中國(guó)明對(duì)蝦[18]和紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[24]中，以AAT重復(fù)最多。高煥等[18]通過(guò)分析中國(guó)明對(duì)蝦基因組微衛(wèi)星特征，發(fā)現(xiàn)三堿基重復(fù)類(lèi)型中以AAT重復(fù)最多，占50.34%。四堿基重復(fù)類(lèi)型中，共發(fā)現(xiàn)7種重復(fù)拷貝類(lèi)別，總體數(shù)量較少。而本研究中未發(fā)現(xiàn)五堿基和六堿基重復(fù)類(lèi)型，可能與所分析的ESTs序列相對(duì)較少、覆蓋面較小有關(guān)。

目前脊尾白蝦SSR的研究，主要是利用SSR核心序列進(jìn)行探針雜交或以核心重復(fù)序列為引物進(jìn)行PCR篩選，而從ESTs中篩選SSR序列的方法則更為簡(jiǎn)單，不僅能夠節(jié)省人力和物力，而且由于ESTs-SSR標(biāo)記位于基因編碼區(qū)中，因此具有高度的物種間轉(zhuǎn)移性[25]。本研究所篩選獲得的SSR序列，可以用于脊尾白蝦SSR標(biāo)記篩選，對(duì)脊尾白蝦遺傳圖譜、基因定位和遺傳多樣性分析等奠定基礎(chǔ)。

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BioinformaticsandMicrosatelliteSequencesAnalysisofESTSequenceinRidgeTailShrimpExopalaemoncarinicauda

DUAN Yafei1, ZHANG Zhe1, LI Jitao2, 3, LI Jian2, 3, LIU Ping2, 3

( 1. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 3. Function Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China )

The analysis of bioinformatics and microsatellite sequences characteristics of expressed sequence tag (EST) sequence were studied, basing on the hemocyte cDNA library of ridge tail shrimpExopalaemoncarinicaudaconstructed by our laboratory. The 1053 unique sequences were yielded from 2853 high quality ESTs, including 329 contigs and 724 singletons. BLAST analysis revealed 593 (56.3%) of the unique sequences as orthologs of genes from other organisms, 22 (2.1%) of which were hypothetical protein, and the remaining 438 (41.6%) had no homology to any sequences. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analysis indicated that 181 of the unique sequences mapped to 120 of metabolic pathways. A total of 416 (14.58%) of the microsatellite repeat sequences were found using EST-SSR analysis. In the 416 repeat sequences, most was dinucleotide with repeats of 374 (89.90%), followed by trinucleotide with repeats of 35 (8.41%), and the third tetranucleotide with repeats of 7 (1.68%). The most common repeat types were AG, AAT and AAGT repeat. The findings provide important information for screening the functional gene resource and molecular markers in ridge tail shrimp.

Exopalaemoncarinicauda; hemocyte; EST; bioinformatics ; microsatellite

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.05.018

S917

A

1003-1111(2016)05-0562-06

2015-11-03；

2015-12-30.

國(guó)家蝦產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-47)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31472275)；山東省泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才工程項(xiàng)目(LNJY2015002)；青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015ASKJ02).

段亞飛(1989—)，男，助理研究員,碩士；研究方向: 蝦類(lèi)免疫學(xué). E-mail: duanyafei89@163.com. 通訊作者：劉萍(1962—)，女，研究員；研究方向: 海水養(yǎng)殖生物種質(zhì)資源與遺傳育種. E-mail: liuping@ysfri.ac.cn.