陳建平，羅晨陽，鐘賽意，秦小明

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088）

菠蘿蛋白酶抗過敏效果的研究

陳建平，羅晨陽，鐘賽意，*秦小明

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088）

為了對(duì)菠蘿蛋白酶的抗過敏效果進(jìn)行研究，采用透明質(zhì)酸酶體外抑制試驗(yàn)考察菠蘿蛋白酶在水解狀態(tài)和未水解狀態(tài)下對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果，并運(yùn)用小鼠被動(dòng)過敏模型試驗(yàn)評(píng)價(jià)菠蘿蛋白酶的抗過敏效果。結(jié)果表明，菠蘿蛋白酶質(zhì)量濃度為0.6～3.6 mg/mL時(shí)，對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果呈正相關(guān)；繼續(xù)增大菠蘿蛋白酶質(zhì)量濃度，對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果反而下降。菠蘿蛋白酶經(jīng)水解后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菠蘿蛋白酶的水解度為12.3%時(shí)，對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率達(dá)到最大為53.5%，對(duì)此水解產(chǎn)物進(jìn)行超濾，發(fā)現(xiàn)其抑制效果主要由分子量在8～10 kDa的組分貢獻(xiàn)，此組分對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率達(dá)到最大59.6%。經(jīng)藍(lán)斑抑制試驗(yàn)表明，相比中、高劑量組，低劑量組的菠蘿蛋白酶對(duì)小鼠皮膚藍(lán)斑的抑制效果最好，抑制率為55.87%，是陽性藥物息斯敏的1.06倍。菠蘿蛋白酶具有良好的抗過敏效果，為其進(jìn)一步開發(fā)成為抗過敏劑應(yīng)用于臨床提供理論基礎(chǔ)。

菠蘿蛋白酶；透明質(zhì)酸酶；抗過敏

菠蘿蛋白酶（Bromelain）簡稱菠蘿酶，又稱鳳梨酵素，是一種從菠蘿植株中提取的植物蛋白酶[1]。研究表明，菠蘿蛋白酶不是單一的酶類，是具有不同分子量和不同結(jié)構(gòu)的復(fù)合酶[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，菠蘿蛋白酶具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、免疫刺激作用、預(yù)防心血管疾病等功效，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品加工等領(lǐng)域。此外，國外已經(jīng)把菠蘿蛋白酶作為一種治療過敏的藥物進(jìn)行研制生產(chǎn)，其抗過敏效果與對(duì)炎癥的治療效果有密切的關(guān)系[4]。然而，國內(nèi)對(duì)于菠蘿蛋白酶抗過敏效果的研究卻未見報(bào)道。

目前，常見的抗過敏研究方法有透明質(zhì)酸酶體外抑制試驗(yàn)[5-6]、肥大細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)[7]、被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)[8-9]和毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)[8]等。其中，透明質(zhì)酸酶體外抑制試驗(yàn)是一種簡單有效的測定方法，已經(jīng)被日本、韓國等國作為大量篩選抗過敏物質(zhì)的一種手段；而被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)的發(fā)展，則大大促進(jìn)了抗過敏藥物的研制。采用透明質(zhì)酸酶體外抑制試驗(yàn)和小鼠被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)對(duì)菠蘿蛋白酶的抗過敏效果進(jìn)行研究，以期為開發(fā)抗過敏劑提供數(shù)據(jù)參考和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿蛋白酶粉末，湛江市徐聞縣提供；透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸酶和胃蛋白酶，分析純，Sigma公司提供；對(duì)二甲氨基苯甲醛、乙酰丙酮和伊文思藍(lán)，上海紫一試劑廠提供；息斯敏，分析純，市售；甲醛，分析純，國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司提供；P-DAB顯色劑由0.8 g對(duì)二甲氨基苯甲醛、15 mL濃鹽酸（36%）和無水乙醇配成。

1.2 儀器與設(shè)備

L6型分光光度計(jì)，上海儀田精密儀器有限公司產(chǎn)品；HH-W420型恒溫水浴鍋，常州諾基儀器有限公司產(chǎn)品；JS6型pH計(jì)，深圳安科儀器制造廠產(chǎn)品；WD-9417型酶標(biāo)儀，杭州惠爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；SF150型制冰機(jī)，上海儀田儀器設(shè)備制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 不同質(zhì)量濃度菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果

稱取一定量的菠蘿蛋白酶粉末，配成質(zhì)量濃度分別為0.6，0.9，1.2，1.8，2.4，3.6，4.8，7.2 mg/mL的菠蘿蛋白酶溶液。將試驗(yàn)分成A，B，C，D 4組，其中A組和B組分別加入菠蘿蛋白酶溶液，C組和D組分別加入蒸餾水。然后，向A組和C組分別加入0.5 mL透明質(zhì)酸酶（500 U/mL），B組和D組分別加入0.5 mL醋酸緩沖液（pH值5.6）。將上述4組分別放在37℃的恒溫水浴鍋中保溫20 min，取出后每組分別加入0.1 mL CaCl2，在37℃恒溫水浴鍋中保溫20 min。取出后A組和C組加入0.5 mL透明質(zhì)酸鉀溶液，B組和D組加入0.5 mL醋酸溶液（pH值5.6），在37℃恒溫水浴鍋中保溫40 min。取出后在室溫下放置10 min，然后每組各加入0.5 mL蒸餾水、0.1 mL NaOH（5 mol/L）和0.5 mL乙酰丙酮。先經(jīng)沸水浴15 min后取出，然后再經(jīng)冰水浴15 min后取出，在室溫放置10 min后，每組各加入1 mL P-DAB試劑，經(jīng)充分振蕩后加入無水乙醇至8 mL，在室溫下放置 30 min后，于波長 530 nm處測定吸光度（Elson-Morgan法）[10]。

透明質(zhì)酸酶抑制率計(jì)算公式：

式中：A——（透明質(zhì)酸酶、樣品、透明質(zhì)酸鉀）溶液的OD值；

B——（醋酸緩沖液、樣品、醋酸緩沖液）溶液的OD值；

C——（透明質(zhì)酸酶、蒸餾水、透明質(zhì)酸鉀）溶液的OD值；

D——（醋酸緩沖液、蒸餾水、醋酸緩沖液）溶液的OD值。

1.4 不同水解時(shí)間下菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果

首先，將菠蘿蛋白酶進(jìn)行模擬胃液的水解處理，測定在不同時(shí)間下菠蘿蛋白酶的水解度，并把水解產(chǎn)物作為樣品測定其對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果；然后，對(duì)具有最佳抑制效果的水解產(chǎn)物采用超濾裝置進(jìn)行超濾，測定最佳水解度條件下不同分子量的分解產(chǎn)物對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率。

1.4.1 不同水解時(shí)間下菠蘿蛋白酶的水解度測定

稱取一定量的菠蘿蛋白酶粉末，加蒸餾水進(jìn)行溶解，配成質(zhì)量濃度為2 g/L的菠蘿蛋白酶溶液，添加鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1.5；加入1 mL胃蛋白酶，在37℃恒溫水浴鍋里進(jìn)行模擬水解反應(yīng)；在10～90 min內(nèi)每隔10 min取樣（置于冰水中終止反應(yīng))測定其水解度，在90～150 min內(nèi)每隔30 min取樣（置于冰水中終止反應(yīng)）測定其水解度。

1.4.2 在不同水解時(shí)間下菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果測定

稱取一定量的菠蘿蛋白酶粉末，加蒸餾水進(jìn)行溶解，配成質(zhì)量濃度為3.6 g/L的菠蘿蛋白酶溶液，添加鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1.5；加入1 mL胃蛋白酶，在37℃恒溫水浴鍋里進(jìn)行模擬水解反應(yīng)；在10～90 min內(nèi)每隔10 min取樣（置于冰水中終止反應(yīng)）；在90～150 min內(nèi)每隔30 min取樣（置于冰水中終止反應(yīng)），然后對(duì)上述樣品進(jìn)行透明質(zhì)酸酶抑制試驗(yàn)的測定。

1.4.3 在最佳水解度下菠蘿蛋白酶經(jīng)分子膜超濾后其對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果測定

稱取一定量的菠蘿蛋白酶粉末，加蒸餾水進(jìn)行溶解，配成質(zhì)量濃度為3.6 g/L的菠蘿蛋白酶溶液，添加鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1.5；加入1 mL胃蛋白酶，置于37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)60 min后取樣，置于冰水中終止反應(yīng)；將樣品分別經(jīng)過3，5，8，10 kDa的分子膜進(jìn)行超濾后，取出濾液測定其對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果。

1.5 小鼠被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)

1.5.1 抗血清的制備

取健康昆明小鼠8只，體重18～22 g，磨碎天花粉3.75 mg溶于1.5 mL氫氧化鋁溶液中，制成懸浮液，并注射于小鼠2只后腳掌，每只腳掌注射0.05 mL，共0.1 mL，使小鼠致敏。繼續(xù)正常喂養(yǎng)15 d后，眼球取血，靜置0.5 h后，離心取上清液，制成抗血清。

1.5.2 小鼠被動(dòng)皮膚過敏模型的建立[11]

取健康昆明小鼠50只，體重18～22 g，隨機(jī)分為高劑量組（1 g/kg菠蘿蛋白酶）、中劑量組（0.48 g/kg菠蘿蛋白酶）、低劑量組（0.24 g/kg菠蘿蛋白酶）、陽性對(duì)照（0.01 g/kg息斯敏組）和空白對(duì)照組（等體積的蒸餾水）；每組10只試驗(yàn)小鼠，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d；7 d后，按1.5.1取制備的抗血清，按1∶5（V/V）加生理鹽水稀釋。取稀釋后的抗血清腹腔注射，每腹壁間隔0.2 cm注射2個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.03 mL，然后繼續(xù)灌胃給藥2 d，在最后一次給藥48 h后進(jìn)行尾靜脈注射天花粉（天花粉利用1%的伊文思藍(lán)-生理鹽水進(jìn)行稀釋），注射0.2 mL（2.5 mg天花粉）；進(jìn)行抗原攻擊；30 min后眼球取血放置于4℃保存；脫臼處死，翻轉(zhuǎn)腹部皮膚，并剪下藍(lán)斑部分，稱取0.5 g剪碎，浸泡在 5 mL丙酮-生理鹽水中（配比為7∶5），浸泡48 h后取出離心，取上清液于波長610 nm處測定吸光度，計(jì)算抑制率，同時(shí)做組間比較，評(píng)價(jià)藥物的抗過敏效果。

酶活計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與討論

2.1 不同質(zhì)量濃度菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果

將菠蘿蛋白酶粉末溶解于蒸餾水中配成不同質(zhì)量濃度的菠蘿蛋白酶溶液，測定其對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果。

不同質(zhì)量濃度菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率的影響見表1。

表1 不同質(zhì)量濃度菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率的影響

由表1可知，在菠蘿蛋白酶質(zhì)量濃度為0.6～3.6 mg/mL內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的升高，菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率呈逐漸升高趨勢。當(dāng)菠蘿蛋白酶質(zhì)量濃度達(dá)到3.6 mg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)到最大為39.70%。隨后繼續(xù)增大菠蘿蛋白酶的質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率呈下降趨勢，可能的原因是菠蘿蛋白酶質(zhì)量濃度在3.6 mg/mL時(shí)其在水溶液中的溶解度已經(jīng)達(dá)到飽和，繼續(xù)添加菠蘿蛋白酶，其在水溶液中的溶解度比較低。

2.2 菠蘿蛋白酶的水解度測定

菠蘿蛋白酶在不同水解時(shí)間內(nèi)的水解度見表2。

表2 菠蘿蛋白酶在不同水解時(shí)間內(nèi)的水解度

在0～70 min內(nèi)，菠蘿蛋白酶的水解度隨著水解時(shí)間的增加而增加；隨后繼續(xù)增加水解時(shí)間，菠蘿蛋白酶水解度沒有明顯的提高，基本維持在動(dòng)態(tài)水平狀態(tài)。

2.3 菠蘿蛋白酶在不同水解條件下對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果

菠蘿蛋白酶在模擬胃液的條件下進(jìn)行消化水解，在10～90 min內(nèi)每隔10 min取樣，在90～150 min內(nèi)每隔30 min取樣，然后測定其對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果。

菠蘿蛋白酶在不同水解時(shí)間下對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率的影響見圖1。

圖1 菠蘿蛋白酶在不同水解時(shí)間下對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率的影響

由圖1可知，在0～60 min內(nèi)，菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率隨著水解時(shí)間的延長而增大，當(dāng)模擬消化60 min時(shí)達(dá)到最大抑制率為56.5%；隨后延長水解時(shí)間，其抑制率呈下降趨勢，經(jīng)過100 min模擬消化后其抑制率的變化趨于平緩。

2.4 菠蘿蛋白酶的水解度與其對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率之間的關(guān)系

菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率的影響及其與水解度的關(guān)系見圖2。

圖2 菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率的影響及其與水解度的關(guān)系

由圖2可知，在0～60 min內(nèi)，菠蘿蛋白酶的水解度越高，其對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率就越大。結(jié)果表明，菠蘿蛋白酶的水解度與菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率呈正相關(guān)。當(dāng)模擬消化水解達(dá)到60 min時(shí)，菠蘿蛋白酶的水解度達(dá)到11.1%，此時(shí)的菠蘿蛋白酶對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率達(dá)到最高為53.5%。

2.5 菠蘿蛋白酶不同分子量水解產(chǎn)物對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果

將具有最高透明質(zhì)酸酶抑制活性的菠蘿蛋白酶水解產(chǎn)物經(jīng)過3，5，8，10 kDa分子膜進(jìn)行超濾，對(duì)不同分子量的濾液進(jìn)行透明質(zhì)酸酶抑制試驗(yàn)。

不同分子量的菠蘿蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率的影響見圖3。

圖3 不同分子量的菠蘿蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率的影響

由圖3可知，分子量在8～10 kDa的濾液對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率最高為59.6%。

2.6 小鼠被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)

不同劑量菠蘿蛋白酶對(duì)藍(lán)斑抑制率的影響見表3。

表3 不同劑量菠蘿蛋白酶對(duì)藍(lán)斑抑制率的影響

由表3可知，低劑量組、中劑量組和高劑量組的菠蘿蛋白酶對(duì)小鼠皮膚藍(lán)斑均表現(xiàn)出一定的抑制效果。有趣的是，隨著菠蘿蛋白酶給藥劑量的增大，其對(duì)小鼠皮膚藍(lán)斑的抑制率就越低。造成這種現(xiàn)象的原因可能是高劑量組的菠蘿蛋白酶在血液中水溶性低，從而導(dǎo)致其抑制效果要弱于低劑量組的菠蘿蛋白酶。而且，低劑量組的菠蘿蛋白酶對(duì)小鼠皮膚藍(lán)斑的抑制率（55.87%）比陽性對(duì)照息斯敏的抑制率（52.55%）高1.06倍，表明菠蘿蛋白酶對(duì)小鼠皮膚通透性的抑制效果要優(yōu)于陽性對(duì)照藥物息斯敏。菠蘿蛋白酶對(duì)小鼠皮膚藍(lán)斑的抑制率越高，其對(duì)小鼠皮膚通透性的抑制效果就越好，越有利于減輕身體局部免疫反應(yīng)，從而達(dá)到抗過敏的效果。綜上所述，在一定的劑量范圍內(nèi)，菠蘿蛋白酶具有較好的抗過敏效果。

3 結(jié)論

運(yùn)用體外透明質(zhì)酸酶的抑制試驗(yàn)和小鼠皮膚藍(lán)斑抑制試驗(yàn)來評(píng)價(jià)菠蘿蛋白酶的抗過敏效果，得到的結(jié)論如下：

（1） 在0.6～3.6 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，未水解的菠蘿蛋白酶質(zhì)量濃度與其對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果呈正相關(guān)；而菠蘿蛋白酶經(jīng)模擬胃液水解60 min后，對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率最大為56.8%，相比未水解的菠蘿蛋白酶，水解后的菠蘿蛋白酶表現(xiàn)出更高的抑制活性。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分子膜過濾發(fā)現(xiàn)，其抑制活性主要是由分子量在8～10 kDa內(nèi)的分解產(chǎn)物來貢獻(xiàn)，這部分的分解產(chǎn)物對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率達(dá)到59.60%。綜上所述，不論菠蘿蛋白酶是否水解，其均表現(xiàn)出對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制效果，表明其具有一定的抗過敏效果。

（2）不同劑量的菠蘿蛋白酶對(duì)小鼠皮膚藍(lán)斑均有一定的抑制效果，通過體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了菠蘿蛋白酶具有一定的抗過敏效果。

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Study on the Anti-allergy Activity of Bromelain

CHEN Jianping，LUO Chenyang，ZHONG Saiyi，*QIN Xiaoming （College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）

In this paper，the anti-allergy activity of bromelain is investigated.The inhibition effect of the bromelain in the hydrolysis and non hydrolytic conditions on the hyaluronidase is investigated using the hyaluronidase inhibition assay in vitro.The anti-allergy activity of bromelain is further evaluated by the passive allergic mouse model in vivo.The results show that in the range of 0.6～3.6 mg/mL，the concentration of bromelain and its inhibitiory effect on hyaluronidase is positive correlation.Further increasing the bromelain concentration resulted in the decrease in its inhibitory effect on hyaluronidase.After hydrolysis of bromelain，we found that when the degree of hydrolysis is 12.3%，inhibition rate of hyaluronidase reached to the maximum of 53.5%.After this hydrolysate is further treated by ultrafitration，the group of molecular weight between 8～10 kDa contributed to the mainly inhibitory effect on hyaluronidase and its inhibition rate reached to the maximum of 59.6%.The results of blue plaque inhibition assay show that compared with the middle and high dose group，the low dose group exhibited the best inhibitory effect on blue plaque，and the inhibition rate reached to 55.87%，which is 1.06 times of the positive drug astemizole.In conclusion，the bromelain possessed good anti-allergy activity，and this study is expected to provide the theoretical basis for its further development of antiallergic agent in clinical application.

bromelain；hyaluronidase；anti-allergy

Q550

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.029

1671-9646（2016）11b-0001-04

2016-09-05

廣東省高校重大科研項(xiàng)目培育計(jì)劃（GDOU2013050214）；廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目（2016A030310332）。

陳建平（1986—），男，博士，講師，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)的生物活性。

*通訊作者：秦小明（1964—），男，博士，教授，研究方向?yàn)楹Ｑ笊镔Y源高值化利用。