梁 策，高 慧，張 騰

(1.華北理工大學(xué)，河北唐山 063000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，河北承德 067000)

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論著·基礎(chǔ)研究

中藥補腎調(diào)沖方對卵巢早衰大鼠性激素水平的影響

梁 策1，高 慧2△，張 騰1

(1.華北理工大學(xué)，河北唐山 063000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，河北承德 067000)

目的 研究中藥補腎調(diào)沖方對雷公藤多苷片(GTW)所致卵巢早衰(POF)雌性大鼠性激素水平和卵巢中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)/γ-干擾素(IFN-γ) mRNA表達的影響。方法 將42只SD雌性大鼠，分為空白組，模型組，結(jié)合雌激素組(對照組)，中藥補腎調(diào)沖方高、中、低劑量組。運用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清中雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、抗苗勒管激素(AMH)水平；RT-PCR法檢測卵巢組織中TNF-α/IFN-γ mRNA的表達水平。結(jié)果 模型組E2、AMH水平顯著低于空白組(P<0.05)；中藥補腎調(diào)沖方各給藥組和對照組E2、AMH水平均高于模型組(P<0.01)；其中中藥補腎調(diào)沖方中、高劑量組和對照組E2、AMH水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組FSH水平顯著高于空白組(P<0.05)；中藥補腎調(diào)沖方各給藥組和對照組FSH水平均低于模型組(P<0.01)；其中中藥補腎調(diào)沖方中、高劑量組和對照組FSH水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組TNF-α、IFN-γ mRNA水平高于空白組(P<0.05)；中藥補腎調(diào)沖方各給藥組和對照組TNF-α、IFN-γ mRNA水平均低于模型組(P<0.01)；其中補腎調(diào)沖方中、高劑量組TNF-α、IFN-γ mRNA水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 中藥補腎調(diào)沖方對卵巢具有調(diào)節(jié)作用，可以預(yù)防卵巢早衰的發(fā)生。

補腎調(diào)沖方；卵巢早衰；性激素；腫瘤壞死因子-α；γ-干擾素

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指正常發(fā)育的婦女在40歲以前因某種原因引起卵巢功能衰竭,具有高促性腺激素及低雌激素特征,卵巢組織呈圍絕經(jīng)期或老年婦女絕經(jīng)后改變[1]。有文獻報道，POF發(fā)生率約1%～3%,閉經(jīng)患者中約2%～10%發(fā)生POF，并且呈現(xiàn)逐年上升趨勢[2-3]。西醫(yī)主要采用激素替代療法、促排卵等方法進行治療，療效明顯，但不良反應(yīng)多，易復(fù)發(fā)。中醫(yī)藥主要采用補腎填精、調(diào)理沖任的治法辨證施治，改善卵巢功能，促進卵巢功能的恢復(fù)，臨床上取得了良好的效果。本課題通過檢測大鼠性激素水平的變化及卵巢中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)/γ-干擾素(IFN-γ) mRNA的表達，探討中藥補腎調(diào)沖方對大鼠PDF的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠，12周齡，體質(zhì)量250～270 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2014-0004。自由飲水，室溫25 ℃左右，濕度60%～70%，自然光照，通風(fēng)良好。納入標(biāo)準(zhǔn)：購入動物后適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，連續(xù)10 d行陰道涂片檢查，選取動情周期正常大鼠為受試動物。

1.2 藥品 雷公藤多苷片：10 mg×100片/瓶，遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，生產(chǎn)批號20140301，國藥準(zhǔn)字Z42021212。結(jié)合雌激素片：0.625 mg/片，新疆新資源生物制藥有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號20130905，國藥準(zhǔn)字H20090172。補腎調(diào)沖方：中藥飲片均由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供。菟絲子15 g，黃精15 g，熟地15 g，肉蓯蓉10 g，巴戟天10 g，當(dāng)歸10 g，川芎6 g，紫石英15 g，五味子6 g。水煎并濃縮，相當(dāng)于每毫升2.5 g生藥，4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 TNF-α/IFN-γ 引物購自美國Invitrogen公司；2*Bench TopTMTaq Master Mix購自美國Biomiga公司；RT-PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。大鼠E2、FSH、AMH ELISA試劑盒購自上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 Multiskan MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo Electron公司；iCycler PCR儀購自美國Bio-Rad公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自北京六一儀器廠；紫外線透射反射分析儀(ZF型)購自上海嘉鵬科技有限公司。

1.5 方法 將42只SD雌性大鼠分為空白組，模型組，結(jié)合雌激素組(對照組)，中藥補腎調(diào)沖方高、中、低劑量組，每組7只?？瞻捉M正常喂養(yǎng)。模型組用雷公藤多苷片75 mg/kg灌胃，每日1次，連續(xù)造模14 d，造模后用生理鹽水2 mL/kg灌胃，每日1次，共36 d，合計50 d。根據(jù)中藥補腎調(diào)沖方臨床常用劑量以及每公斤體質(zhì)量用藥量的人鼠比例換算[4]，高、中、低劑量組于造模前分別以24、12、6 g/kg灌胃，每日1次，共36 d；之后用雷公藤多苷片75 mg/kg灌胃，每日1次，連續(xù)造模14 d，合計50 d。對照組以0.075 mg/kg灌胃，每日1次。方法同中藥補腎調(diào)沖方組。

1.5.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定性激素水平 大鼠血清性激素[雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、抗苗勒管激素(AMH)]檢測，按照ELISA試劑盒說明書操作進行。

1.5.2 RT-PCR法檢測大鼠卵巢組織中TNF-α/IFN-γ mRNA表達 取大鼠新鮮的卵巢組100 mg，采用Trizol一步法提取總RNA。紫外線分光光度計測定總RNA純度，以A 260/280比值為基礎(chǔ)，介于1.9～2.1之間，純度良好。并計算RNA濃度。取2 μg總RNA模板量進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：42 ℃，孵育3 min；加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的Mix，42 ℃孵育15 min；95 ℃孵育3 min后低溫保存?zhèn)溆?。PCR擴增反應(yīng)體系為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s；各引物不同的退火溫度見表1，退火時間30 s；72 ℃延伸1 min；10 ℃保存。94 ℃變性開始循環(huán)，共30次。取10 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，UVP分析系統(tǒng)拍照，用Quantity One軟件定量分析，以目的條帶和β-actin條帶的吸光度比值作為mRNA的表達水平。

表1 不同目的基因的引物序列、退火溫度、產(chǎn)物大小

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清性激素(E2、FSH、AMH)水平表達 模型組E2、AMH水平顯著低于空白組(P<0.05)；中藥補腎調(diào)沖方各給藥組和對照組E2、AMH水平均高于模型組(P<0.01)；其中中藥補腎調(diào)沖方中、高劑量組和對照組E2、AMH水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組FSH水平顯著高于空白組(P<0.05)；中藥補腎調(diào)沖方各給藥組和對照組FSH水平均低于模型組(P<0.01)；其中中藥補腎調(diào)沖方中、高劑量組和對照組FSH水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清E2、FSH、AMH水平比較

*：P<0.01，與模型組比較；△：P<0.05，與空白組比較。

表3 各組大鼠TNF-α/IFN-γ mRNA的表達

*：P<0.01，與模型組比較；△：P<0.05，與空白組比較。

2.2 各組大鼠卵巢TNF-α、IFN-γmRNA的表達 模型組TNF-α、IFN-γmRNA水平高于空白組(P<0.05)；中藥補腎調(diào)沖方各給藥組和對照組TNF-α、IFN-γmRNA水平均低于模型組(P<0.01)；其中補腎調(diào)沖方中、高劑量組TNF-α、IFN-γmRNA水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3，圖1、2。

M：marker；A：空白組；B：模型組；C：補腎調(diào)沖方低劑量組；D：補腎調(diào)沖方中劑量組；E：補腎調(diào)沖方高劑量組；F：對照組。

圖1 大鼠卵巢TNF-αmRNA的表達

M：marker；A：空白組；B：模型組；C：補腎調(diào)沖方低劑量組；D：補腎調(diào)沖方中劑量組；E：補腎調(diào)沖方高劑量組；F：對照組。

圖2 大鼠卵巢IFN-γmRNA的表達

3 討 論

AMH為二聚體糖蛋白，又稱苗勒管抑制物質(zhì)，是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族成員之一[5]。Meduri等[6]認為AMH最先在POF患者的早竇狀卵泡表達呈下降趨勢，隨著原始卵泡的耗竭，生長卵泡期的卵泡數(shù)減少，分泌入血清中的AMH降低，表明AMH為早期評價卵巢儲備降低的理想指標(biāo)。張莉莉等[7]指出INHB和E2是在FSH的刺激下由竇狀卵泡分泌的，同時通過性腺軸的反饋抑制FSH的分泌。卵泡池的耗竭導(dǎo)致血清INHB、E2的下降和FSH的升高。這3個指標(biāo)的變化是相互依賴而非獨立的，它們的變化發(fā)生得較晚。徐琳等[8]發(fā)現(xiàn)在人類衰老的過程中，血清AMH的降低比FSH的升高能更早地反映出卵巢功能的衰竭，AMH被用來作為一種評價生殖細胞儲備的血清學(xué)標(biāo)記。

TNF-α存在于卵巢的顆粒細胞、泡膜黃體細胞、巨噬細胞內(nèi)[9]，其功能與細胞的增殖和凋亡有關(guān)[10]。TNF-α的表達升高能誘導(dǎo)早期卵泡的凋亡，促進卵巢顆粒細胞的凋亡[11]。由于卵巢損傷嚴重及凋亡造成卵泡閉鎖，排卵障礙，內(nèi)分泌紊亂，因此出現(xiàn)雌激素分泌減少，形成惡性循環(huán)，加速了卵巢衰老[12]。

IFN-γ是一種小分子調(diào)節(jié)肽，與多種自身免疫性疾病相關(guān)，在機體的免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)中起著重要的作用[13]。莊笑梅等[14]研究表明，IFN-γ為多功能的細胞調(diào)節(jié)因子，對生殖系統(tǒng)的調(diào)控的主要作用在卵巢上。Russell[15]認為卵泡閉鎖是由IFN-γ啟動的一系列細胞因子引起的。當(dāng)機體免疫異常時，表達和分泌的IFN-γ數(shù)量增加，短暫的升高是排卵的關(guān)鍵，如果水平過高超過正常生理濃度則會抑制排卵，導(dǎo)致不孕。

本研究發(fā)現(xiàn)，補腎調(diào)沖方各給藥組和對照組E2、AMH的水平均高于模型組；補腎調(diào)沖方中、高劑量組和對照組E2、AMH、FSH水平與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。 補腎調(diào)沖方各給藥組和對照組TNF-α、IFN-γmRNA水平均低于模型組，補腎調(diào)沖方中、高劑量組TNF-α、IFN-γmRNA水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。上述實驗表明，補腎調(diào)沖方高、中劑量能夠調(diào)節(jié)卵巢組織中E2、FSH、AMH激素的水平；通過維持性激素水平的穩(wěn)定，來調(diào)節(jié)TNF-α、IFN-γ含量表達的平衡，保證卵巢細胞的正常凋亡，這可能是其能夠預(yù)防卵巢早衰發(fā)生的機制之一。因此，補腎調(diào)沖方具有能夠預(yù)防POF的作用，為更好地應(yīng)用于臨床提供了一定的依據(jù)。

[1]賀文婧,馬麗亞.卵巢早衰的中西醫(yī)病因研究[J].吉林中醫(yī)藥,2010,30(10):847-849.

[2]楊業(yè)洲.卵巢早衰[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2004:102-108.

[3]張蕾,曲秀芬.卵巢早衰的中醫(yī)藥治療研究進展[J].中醫(yī)藥信息,2009,26(2):10-12.

[4]苗明三.實驗動物和動物實驗技術(shù)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,1997:145.

[5]孫夕平.四二烏杞方對卵巢早衰模型大鼠血清抗苗勒管激素的影響[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué),2014:19.

[6]MeduriG,MassinN,GuibouedencheJ,etal.Mullerianinhibitingsubstanceinhumansnomallevelsfrominfancytoadulthood[J].JClinEndocrinolMetal,1996,81(2):571-576.

[7]張莉莉,張學(xué)紅.抗苗勒管激素與卵巢功能[J].中國婦幼健康研究,2006,17(6):507-510.

[8]徐琳,任莉,韓雪松,等.AMH、FSH、E2在卵巢早衰診斷中的價值[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2011,19(3):96-98.

[9]高慧,楊涓,夏天，等.補腎調(diào)沖方對卵巢早衰大鼠卵巢相關(guān)細胞因子TNF-α、IFN-γ蛋白和基因表達的影響(續(xù))[J].國醫(yī)論壇,2008,23(3):32-40.

[10]HotamisligilGS,SpiegelmanBM.Tumornecrosisfactoralphaakeycomponentoftheobesity-diabeteslink[J].Diabetes,1994,43(11):1271-1278.

[11]莊笑梅,姜恩魁,馮俐.TNF-α對雌性大鼠生殖軸調(diào)控作用的研究[J].錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,24(4):5-9.

[12]丁原全,劉鵬,馬乾章.補腎復(fù)方對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢TNF-α的影響[J].中華保健醫(yī)學(xué)雜志,2010,12(4):291-293.

[13]謝江燕,何畏,趙儷梅,等.卵巢早衰患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的變化及干擾素-γ、轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達[J].華西醫(yī)學(xué),2013,28(3):377-379.

[14]莊笑梅,岳立群.細胞因子對女性生殖軸調(diào)控作用研究現(xiàn)狀[J].錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2002,23(5):60-63.

[15]RussellP.Theclinicpathologicalfeaturesprematurdovarianrailure[J].VerhDtschGesPathol,1997(81):197.

Effects of Bushen Tiaochong Recipe on sex hormone level and ovarian TNF-α/IFN-γ expression in rats with premature ovarian failure*

LiangCe1，GaoHui2△，ZhangTeng1

(1.NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China;2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,AffiliatedHospital,ChengdeMedicalCollege,Chengde,Hebei067000,China)

Objective To study the effect of Bushen Tiaochong Recipe on the change of sex hormones and ovarian TNF-α/IFN-γ mRNA expression in th female rats with premature ovarian failure(POF) induced by triptergium wilfordii(GTW).Methods Forty-two female SD rats were randomly divided into the blank group,model group,conjugated estrogen group(control group),Bushen Tiaochong Recipe prevention low,middle and high dosage group.Serum estradiol(E2),follicle-stimulating hormone(FSH) and anti-müllerian hormone(AMH) were detected by using the enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Expression levels of TNF alpha,IFN-gamma mRNA in rats ovarian were detected by the RT-PCR method.Results The levels of E2 and AMH in the model group were significantly lower than those in the blank group(P<0.05);The levels of E2 and AMH in the various Bushen Tiaochong Recipe medication groups and control group were higher than those in the model group(P<0.01);in which the levels of E2 and AMH had no statistical difference between the Bushen Tiaochong Recipe middle and high dose groups and control group with the blank group(P>0.05).The FSH level in th model group was significantly higher than that in the blank group(P<0.05);the FSH level in the various Bushen Tiaochong Recipe medication groups and control group was lower than that in the model group(P<0.01);in which the FSH level had no statistical difference between the Bushen Tiaochong Recipe middle and high dose groups and control group with the blank group (P>0.05).The TNF alpha,IFN-gamma mRNA levels in the model group were higher than those in the blank group(P<0.05);the TNF alpha and IFN-gamma mRNA levels in the various Bushen Tiaochong Recipe medication groups and the control group were lower than those in the model group (P<0.01);in which the TNF alpha and IFN gamma mRNA levelsn had no statistical difference between the Bushen Tiaochong Recipe middle and high dose groups with the blank group(P>0.05).Conclusion Bushen Tiaochong Recipe has some regulation effect on rats ovarian,which can prevent the POF occurrence.

Bushen Tiaochong Recipe;premature ovarian failure;sex hormone;TNF alpha;IFN-gamma

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.31.006

河北省省級重大醫(yī)學(xué)科研項目(zyzd2013018)；河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才培養(yǎng)項目(2014571024)；國家中醫(yī)藥管理局高慧全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項目(2015048157)。

梁策(1988-)，碩士，主要從事中醫(yī)婦科方面的研究?！?/p>

，E-mail:gaohuihbcd@163.com。

R711.75

A

1671-8348(2016)31-4337-03

2016-02-20

2016-06-08)