鄒林洪，胡 丹，張琳林△，彭 春，戴紅衛(wèi)

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院口腔科，重慶 402160； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，重慶 400015)

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論著·基礎(chǔ)研究

OPG/RANKL/RANK調(diào)節(jié)系統(tǒng)與大鼠慢性牙周炎發(fā)展的相關(guān)性分析

鄒林洪1，胡 丹1，張琳林1△，彭 春1，戴紅衛(wèi)2

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院口腔科，重慶 402160； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，重慶 400015)

目的 研究骨保護(hù)素(OPG)/細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)/細(xì)胞核因子κB受體活化因子(RANK)調(diào)節(jié)系統(tǒng)與大鼠慢性牙周炎之間的關(guān)系。方法 選取48只雄性SD大鼠，采用結(jié)扎絲方法建立大鼠慢性牙周炎模型進(jìn)行研究，對比觀察OPG、RANKL的免疫組化檢測結(jié)果以及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。結(jié)果 在第56天時(shí)破骨細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值，實(shí)驗(yàn)組從第7天開始RANKL蛋白平均光密度值高于對照組(P<0.05)；從第14天開始實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表面OPG的平均光密度值低于對照組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組RANKL/OPG比值也發(fā)生了明顯改變。結(jié)論 OPG、RANKL和RANK參與了大鼠慢性牙周炎的牙槽骨吸收活動，RANKL與OPG比例的失調(diào)在慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

牙周炎；骨保護(hù)素；細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體；細(xì)胞核因子κB受體活化因子

牙周病是口腔中一種極為常見的疾病，該疾病在我國人群中的發(fā)病率高達(dá)70.0%[1]。慢性牙周炎也是導(dǎo)致患者牙齒松動和缺失的最主要原因，對患者的咀嚼功能產(chǎn)生不利影響，對患者的生活質(zhì)量以及生命健康造成了嚴(yán)重的威脅。因此，慢性牙周炎是目前牙周病研究的熱點(diǎn)。有研究指出，OPG/RANKL/RANK調(diào)節(jié)系統(tǒng)與牙周炎的發(fā)病有著密切的關(guān)系[2-3]。為了進(jìn)一步探討研究骨保護(hù)素(OPG)/細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)/細(xì)胞核因子κB受體活化因子(RANK)調(diào)節(jié)系統(tǒng)與慢性牙周炎之間的關(guān)系，本研究建立了大鼠慢性牙周炎模型進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取48只7周齡雄性SD大鼠(購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)，體質(zhì)量為(150±10)g，將大鼠平均分為8組，每組6只，進(jìn)行自身對照。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠慢性牙周炎模型 采用結(jié)扎絲方法建立大鼠慢性牙周炎模型，具體過程如下：在大鼠左側(cè)上頜第一磨牙的齦緣下用0.25 mm正畸絲結(jié)扎作為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)不作處理作為對照組；分別在建立模型的第7、14、21、28、35、42、49、56天以10%水合氯醛按照3 mL/kg的比例對大鼠進(jìn)行麻醉，以4%多聚甲醛灌注內(nèi)固定，取雙側(cè)第一磨牙及其周圍牙槽骨組織，隨后常規(guī)制作組織切片。

1.2.2 HE染色 (1)10.0%乙二胺四乙酸(EDTA)將雙側(cè)標(biāo)本4 ℃脫鈣45～60 d，以針剌無阻力感為完成脫鈣標(biāo)準(zhǔn)，隨后進(jìn)行脫水、石蠟包埋；(2)平行于牙體長軸將標(biāo)本以5 mm厚度做頰、舌向切片，出現(xiàn)第一磨牙頰側(cè)牙根時(shí)開始收集組織切片；(3)每個(gè)標(biāo)本選取1張切片，進(jìn)行常規(guī)脫蠟水化操作，常規(guī)染色，顯微鏡下觀察牙周組織情況。

1.2.3 TRAP染色破骨細(xì)胞計(jì)數(shù) 每個(gè)標(biāo)本選取3張切片隨后按照抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒具體步驟進(jìn)行操作。在顯微鏡下計(jì)數(shù)牙根周圍牙槽骨表面的陽性染色破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)，重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 OPG、RANKL免疫組化檢測 采用SABC免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，將石蠟切片進(jìn)行脫蠟水化，經(jīng)內(nèi)源性過氧化酶阻斷，利用5%的牛血清清蛋白BSA進(jìn)行封閉，隨后分別加入稀釋的一抗，進(jìn)行2 h的溫室孵育后加入二抗以及DAB顯色液進(jìn)行顯色；使用蘇木精進(jìn)行復(fù)染，并常規(guī)脫水，封片后觀察。陽性強(qiáng)度用平均光密度值表示。染色條件一致，拍照曝光由一個(gè)人完成，每個(gè)標(biāo)本選用一張切片，在400倍高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野，求平均值作為陽性細(xì)胞平均光密度值。平均光密度值=累積光密度/ 測量面積。

1.3 觀察指標(biāo) 對比觀察破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以及OPG、RANKL、RANK的表達(dá)結(jié)果，計(jì)算RANKL/OPG比值。

2 結(jié) 果

2.1 動物模型以及HE染色結(jié)果 肉眼見28～56d時(shí)大鼠左側(cè)上頜第一磨牙牙齦紅腫，軟垢和牙結(jié)石堆積，探診極易出血，探及牙周袋深。 組織學(xué)觀察牙齦組織有大量炎癥細(xì)胞浸潤，牙周膠原纖維排列紊亂，暴露的牙根表面和牙槽骨上有大量吸收陷窩，隨著時(shí)間延長，各種表現(xiàn)程度越重，表明慢性牙周炎模型建立成功。對照組未見明顯的牙齦紅腫，探診不易出血，HE染色未見明顯的炎癥細(xì)胞，膠原纖維排列規(guī)則。

2.2 破骨細(xì)胞計(jì)數(shù) 陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核大于2個(gè)，胞質(zhì)呈酒紅色，形狀不規(guī)則。對照組偶見顏色較淺的陽性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)可見深染TRAP陽性染色破骨細(xì)胞，分布在牙槽骨中。通過對比觀察，實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞數(shù)量和對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨后隨著時(shí)間延長破骨細(xì)胞數(shù)量開始升高，在第56天時(shí)破骨細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值，見圖1、表1。

表1 慢性牙周炎模型破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)對比，個(gè))

a:P<0.05,與對照組比較。

2.3 免疫組化檢測 通過對比觀察可以發(fā)現(xiàn)：對照組大鼠牙周組織具有適量的RANKL蛋白淡黃色顆粒表達(dá)，但在實(shí)驗(yàn)組中炎癥明顯的區(qū)域RANKL蛋白褐色顆粒的表達(dá)量明顯增加；對照組大鼠牙槽骨中具有適量的OPG棕黃色顆粒彌漫性弱陽性表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)組中慢性牙周炎明顯的區(qū)域，OPG淡黃色顆粒的表達(dá)相對較少。實(shí)驗(yàn)組從第7天開始RANKL蛋白平均光密度值高于對照組(P<0.05)；從第14天開始實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表面OPG的平均光密度值低于對照組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組RANKL/OPG比值第7天時(shí)開始升高，到第56天達(dá)到峰值，對照組RANKL/OPG比值一直比較平穩(wěn)，未見明顯升高或降低，見表2。

表2 OPG、RANKL免疫組化染色平均光密度值

a:P<0.05,與對照組比較。

A：實(shí)驗(yàn)組第7天;B:實(shí)驗(yàn)組第56天。

圖1 破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色(×200)

3 討 論

OPG是一種可溶性分泌蛋白，主要由成骨細(xì)胞分泌。OPG主要的生物學(xué)行為是作用于破骨細(xì)胞的分化末期，抑制破骨細(xì)胞生成，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，并阻斷破骨細(xì)胞的病理性增生、活化[4]。RANKL是破骨細(xì)胞分化因子，是一種骨保護(hù)素配體，能刺激破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收，能夠通過和破骨前體細(xì)胞膜上的RANK結(jié)合來促進(jìn)破骨細(xì)胞分化抑制其凋亡[5]。RANK是一種縮氨酸，由成骨細(xì)胞及活性T細(xì)胞分泌產(chǎn)生，目前被認(rèn)為是已知的RANKL惟一的受體，主要與RANKL的C 端結(jié)合產(chǎn)生信號，進(jìn)而啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6]。OPG可以與RANKL競爭結(jié)合RANK，從而阻斷RANKL和RANK的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的成熟和分化，導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)量減少，達(dá)到減少骨吸收，增加骨量的作用[7]。

OPG、RANKL、RANK調(diào)節(jié)系統(tǒng)能調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)和骨的動態(tài)平衡，是各種通路誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化成熟最終因子[8]。成骨細(xì)胞受到刺激之后膜表面表達(dá)的RANKL，能夠識別破骨細(xì)胞前體細(xì)胞并和其膜上的RANK結(jié)合，刺激其分化成熟并產(chǎn)生破骨細(xì)胞，起到骨吸收的作用[9]。此外，成骨細(xì)胞也可以通過OPG的表達(dá)來抑制RANKL和RANK的作用機(jī)制[10]。OPG還可以和RANKL-RANK結(jié)合體再次結(jié)合來形成三聚體，起到直接抑制RANKL-RANK的作用[11]。有研究表明，去除小鼠的OPG 基因會引起破骨細(xì)胞數(shù)量增多導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松[12]。對去除RANK基因片段的小鼠進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，小鼠會出現(xiàn)由于缺乏破骨細(xì)胞而形成骨質(zhì)硬化。

近年來有專家認(rèn)為RANKL/RANK/OPG 系統(tǒng)可能是聯(lián)系骨代謝與免疫系統(tǒng)之間的橋梁，由免疫系統(tǒng)炎性反應(yīng)導(dǎo)致的骨吸收[13]。有研究表明激活的T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致了牙周炎癥組織中RANKL的mRNA高表達(dá)，同時(shí)OPG的mRNA水平相應(yīng)下降[14]。因而可以通過選擇性的調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)來對OPG/RANKL進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而對牙槽骨的局部微環(huán)境進(jìn)行調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠慢性牙周炎活動明顯的每個(gè)觀察點(diǎn)，RANKL在成骨細(xì)胞及其基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)更明顯，與對照組相比其水平明顯增加；而OPG水平在成骨細(xì)胞及其基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)水平有所減少，與對照組相比其水平明顯減少。所以，OPG/RANKL/RANK調(diào)節(jié)系統(tǒng)確實(shí)在慢性牙周炎活動中發(fā)揮了極為重要的作用。

OPG以及RANKL在牙槽骨中的表達(dá)受到多種因素的調(diào)節(jié)和影響，本研究發(fā)現(xiàn)RANKL的水平升高，OPG的水平降低，RANKL/OPG比值在實(shí)驗(yàn)組比對照組大，實(shí)驗(yàn)組RANKL/OPG比值從第7天開始一直持續(xù)升高，到第56天達(dá)到峰值，而對照組RANKL/ OPG比值一直比較平穩(wěn)，未見明顯升高或降低。因此可以推斷RANKL和OPG及二者比值的變化反映了牙周吸收情況，OPG和RANKL過多或過少對骨代謝均產(chǎn)生不利影響，需要RANKL與OPG維持一定的比例才能達(dá)到牙周骨代謝的平衡。牙周局部微環(huán)境RANKL/OPG 比例的失調(diào)導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)組破骨活動活躍，牙槽骨組織發(fā)生了過量吸收，因此可以得知，在對照組中，RANKL、OPG 之間比例正常，對照組牙周組織未發(fā)生明顯的吸收和增長，處于平衡狀態(tài)。RANKL/OPG比值的改變在慢性牙周炎的發(fā)展中起著重要的作用；RANKL/OPG比值與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟密切相關(guān)，在牙周組織破壞的發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)揮了重要的作用，最終影響牙槽骨的骨密度和骨強(qiáng)度。RANKL/OPG 比值可以作為衡量慢性牙周炎牙槽骨吸收嚴(yán)重程度的客觀指標(biāo)之一，牙槽骨的吸收嚴(yán)重程度與牙周局部RANKL、OPG比例失調(diào)呈正相關(guān)。

綜上所述， OPG、RANKL和RANK調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與了大鼠慢性牙周炎牙槽骨的吸收活動，RANKL和OPG是慢性牙周炎的重要調(diào)節(jié)因子，其中RANKL/OPG比例的失調(diào)在慢性牙周炎中起著重要的作用。通過改變牙周炎患者牙周組織中的OPG、RANKL含量，使OPG含量表達(dá)增加，減少RANKL含量，改善牙周局部RANKL 與OPG 之間的比例來達(dá)到抑制骨吸收、促進(jìn)新骨生成的作用，使預(yù)防慢性牙周炎牙槽骨吸收的發(fā)生成為可能。

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Analysis on correlation between OPG/RANKL/RANK regulation system and chronic periodontitis progress*

ZouLinhong1,HuDan1,ZhangLinlin1△,PengChun1,DaiHongwei2

(1.DepartmentofStomatology,AffiliatedYongchuanHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China;2.DepartmentofOrthodontics,AffiliatedStomatologyHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400015,China)

Objective To investigate the relationship between OPG/RANKL/RANK regulation system and periodontitis.Methods Forty-eight male SD rats were selected to establish the rat periodontitis model by adopting the ligature wire method.The detection results of OPG and RANKL by the immunohistochemical method and and the results of osteoclasts count were comparatively observed.Results The number of osteoclasts on 56 d reached the peak value.The average optical density value of RANKL protein from 7 d in the experimental group was higher than that in the control group(P<0.05);the average optical density value of cellular surface OPG from 14 d in the experimental group was lower than that in the control group(P<0.05);the RANKL/OPG ratio in the experimental group also had significant change.Conclusion OPG,RANKL and RANK are involved in the absorption activity of alveolar bone in rat chronic periodontitis.The imbalance of RANKL and OPG ratio plays an important role in the development of chronic periodontitis.

periodontitis;osteoprotegerin;RANKL;RANK

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.31.005

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院課題(YJQN20120025)。

鄒林洪(1982-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事口腔醫(yī)學(xué)相關(guān)研究?！?/p>

，E-mail:zhanglinlin71@163.com。

R781.4+2

A

1671-8348(2016)31-4334-03

2016-02-21

2016-06-09)