趙納杰，王聚信，李曉雙，高香紅，于 海，劉清華,張 明，于樹娜，蔣吉英△

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院2013級2班,山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,山東濰坊 261053)

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論著·基礎(chǔ)研究

N-乙酰-L-色氨酸對新生鼠腦缺血缺氧紋狀體損傷的保護(hù)作用

趙納杰1，王聚信2，李曉雙2，高香紅2，于 海2，劉清華2,張 明2，于樹娜2，蔣吉英2△

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院2013級2班,山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,山東濰坊 261053)

目的 探討N-乙酰-L-色氨酸(L-NAT)對新生鼠腦缺血缺氧紋狀體損傷的保護(hù)作用。 方法 用出生第7天的SD大鼠制備新生鼠腦缺血缺氧模型，HE染色觀察紋狀體的形態(tài)學(xué)變化；免疫熒光染色觀察Caspase3、Bcl-2和Bax的表達(dá)情況。結(jié)果 與Sham組相比，HIE組紋狀體中神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，且數(shù)量明顯減少，Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)升高；HIE +L-NAT組紋狀體細(xì)胞的損傷程度減輕，Bax、Caspase-3表達(dá)下降，Bcl-2的表達(dá)進(jìn)一步升高。結(jié)論 L-NAT可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)減輕紋狀體細(xì)胞的損傷程度，從而保護(hù)新生鼠腦缺血缺氧損傷。

缺血缺氧損傷；L-乙酰-N-色氨酸；紋狀體；細(xì)胞凋亡；大鼠

新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemicencephalopathy，HIE)是各種圍生期因素引起的缺氧和血流量減少或停止導(dǎo)致的新生兒腦損傷,在我國的發(fā)病率為2‰～4‰，其中1‰～2‰出現(xiàn)腦癱、癲癇、智力低下等程度不等的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，其高發(fā)病率和高致殘率使其成為目前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點。紋狀體是缺氧敏感區(qū)[1-3]，以往的研究表明，NK1受體拮抗劑N-乙酰-L-色氨酸(L-NAT)對新生鼠腦缺血缺氧后的海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用[4]。本實驗探討L-NAT對缺血缺氧損傷紋狀體的保護(hù)作用，以期為L-NAT的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的分組及動物模型的制備 將出生第7天的新生沙土鼠18只分成假手術(shù)組(Sham)、缺血缺氧損傷組(HIE)、缺血缺氧損傷加L-NAT組(HIE +L-NAT)，每組6只。經(jīng)乙醚吸入麻醉后，頸部常規(guī)消毒，頸正中切口，分離右側(cè)頸總動脈，電凝結(jié)扎；置于37 ℃的缺氧容器中，通入92%氮氣和8%氧氣，流量2 L/min，持續(xù)3 h。HIE+L-NAT組分別在造模前和缺氧后30 min腹腔注射L-NAT 5 mg/kg；HIE組腹腔注射同等劑量的生理鹽水；Sham組只分離右側(cè)頸總動脈，不做結(jié)扎也不做缺氧處理。

1.2 取材與切片 各組分別于術(shù)后12 h處死動物，4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦組織，置4%多聚甲醛固定24～48 h后，冠狀取材，進(jìn)行常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片(厚5 μm)。

1.3 HE染色 各組切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察紋狀體的形態(tài)學(xué)變化。

1.4 免疫熒光染色 各組切片常規(guī)脫蠟、水化；0.3%H2O2孵育15 min，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶的活性；多克隆抗體Caspase-3(1∶200，Cell Signaling)、Bcl-2(1∶200，Santa Cruz)、Bax(1∶50，Santa Cruz)4 ℃孵育過夜；FITC-conjugated Donkeny anti-Rabbit IgG(1∶200，Jackson Immunoresearch)37 ℃孵育30 min。以PBS代替一抗作陰性對照。熒光顯微鏡(激發(fā)光波長為490～495 nm)觀察。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)變化 HE結(jié)果顯示，Sham組紋狀體神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，數(shù)量多，分布均勻，神經(jīng)細(xì)胞排列較緊密；HIE組細(xì)胞排列紊亂、疏松、形態(tài)不規(guī)則，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少；L-NAT干預(yù)后細(xì)胞損傷程度明顯減輕(圖1)。

2.2 Bcl-2和Bax表達(dá)的改變 免疫熒光染色顯示，Sham組紋狀體中偶見Bcl-2和Bax表達(dá)；HIE組損傷側(cè)紋狀體內(nèi)Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多；L-NAT干預(yù)后Bcl-2陽性細(xì)胞較HIE組增加，而Bax陽性細(xì)胞數(shù)量減少(圖2、3)。

2.3 Cacpase-3表達(dá)的改變 免疫熒光顯示，Sham組紋狀體中Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量很少；HIE組損傷側(cè)殼核處Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多；L-NAT干預(yù)后陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖4)。

A：Sham組；B：HIE組；C：HIE+L-MAT組。

圖1 紋狀體細(xì)胞HE染色結(jié)果(×400)

A：Sham組；B：HIE組；C：HIE+L-MAT組。

圖2 各組Bcl-2的表達(dá)(×200)

A：Sham組；B：HIE組；C：HIE+L-MAT組。

圖3 各組Bax的表達(dá)(×200)

A：Sham組；B：HIE組；C：HIE+L-MAT組。

圖4 各組Cacpase-3的表達(dá)(×200)

3 討 論

HIE是由于窒息而導(dǎo)致腦部出現(xiàn)缺血缺氧損傷，可引起新生兒死亡或永久性神經(jīng)功能缺陷及遺留并發(fā)癥，如腦性癱瘓、智力低下、癲癇等，是新生兒的常見病、多發(fā)病。雖然目前國內(nèi)外研究已取得很大進(jìn)步，但至今無很好的治療方法[5]。因此，探討新的治療方案非常有意義。

腦缺血缺氧損傷的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究表明，缺血缺氧損傷后神經(jīng)細(xì)胞的死亡主要表現(xiàn)為缺血中心區(qū)的細(xì)胞壞死和缺血周邊區(qū)的細(xì)胞凋亡。與壞死相比，細(xì)胞凋亡是一種主動的、可控的自殺方式。因此，尋求減輕細(xì)胞凋亡的方法，對于缺血缺氧損傷的治療具有重要意義。細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和調(diào)控過程十分復(fù)雜，在眾多的凋亡調(diào)控基因中，Caspase-3、Bcl-2和Bax在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用備受關(guān)注[6-7]。在細(xì)胞凋亡過程中，凋亡信號經(jīng)過復(fù)雜的信號通路，最終是通過Caspases蛋白的激活而實現(xiàn)的。Caspases是導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中居于中心地位。其中，Caspase-3是細(xì)胞凋亡起關(guān)鍵作用，是線粒體途徑細(xì)胞凋亡、死亡受體途徑細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑細(xì)胞凋亡的的效應(yīng)分子，可啟動細(xì)胞凋亡[8-9]。近年來的一系列研究也證實了Caspase-3在腦缺血缺氧損傷中的作用。有研究表明，腦缺血后缺血半暗區(qū)的活化型Caspase-3的表達(dá)增加，并且Caspase-3活性的變化的時序性與DNA片段化的改變一致[10]，Caspase-3的抑制劑[11]或Caspase-3基因敲除[12]等均可減輕腦缺血缺氧引起的損傷。上述結(jié)果說明，Caspase-3參與了腦缺血缺氧損傷，可作為缺血缺氧損傷后細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧側(cè)紋狀體神經(jīng)細(xì)胞中活化型Caspase-3的表達(dá)明顯增多，提示Caspase-3參與了新生鼠腦缺血缺氧損失的發(fā)生。

活化的Caspase-3是如何引起細(xì)胞凋亡？目前的研究發(fā)現(xiàn)，活化的Caspase-3可以裂解Bcl-2蛋白，使其失去抗凋亡活性，并且裂解的Bcl-2片段又可以進(jìn)一步促進(jìn)Caspase-3的活化，從而形成Caspase級聯(lián)正反饋環(huán)路。Bax是Bcl-2蛋白家族的促凋亡蛋白，通過形成Bax-Bax同源二聚體和Bcl-2-Bax異源二聚體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此，Bcl-2/Bax的比例是啟動細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”[13-15]。

SP是由11個氨基酸組成的多肽，屬于速激肽家族。有研究表明，SP使心肌對缺血再灌注損傷的耐受力下降，干擾SP/NK-1系統(tǒng)的作用可減輕心肌的缺血再灌注損傷[16]。另有研究表明，SP/NK1在心、肝、胰腺、肺、小腸等器官的缺血再灌注損傷中的作用[17-21]。近年來，SP/NK1受體系統(tǒng)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的改變成為關(guān)注的熱點，大量實驗研究表明，抑制SP的釋放或SP的拮抗劑可使腦水腫減輕，并改善神經(jīng)功能評分[22-24]，NK1受體的拮抗劑或基因敲除NK1受體均可緩解SP對神經(jīng)細(xì)胞的損傷[25]。SP與NK-1受體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，在癲癇持續(xù)狀態(tài)和局灶缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡中起重要作用[26]。NK1受體拮抗劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可緩解神經(jīng)細(xì)胞的損傷，減輕腦水腫，減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)海馬神經(jīng)元[4,27-29]。上述結(jié)果提示，NK1的拮抗劑L-NAT有可能對新生鼠腦缺血缺氧紋狀體的損傷有保護(hù)作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧損傷后，Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)明顯增多；L-NAT可抑制Caspase-3活化，減少Bax的表達(dá)，并進(jìn)一步提高Bcl-2的表達(dá)。提示L-NAT可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來減少紋狀體神經(jīng)元凋亡，減輕HIE損傷。

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Protective effect of N-acetyl-L-tryptophan on striatal injury of neonatal rat hypoxic ischemic encephalopathy*

ZhaoNajie1,WangJuxin2,LiXiaoshuang2,GaoXianghong2,YuHai2，LiuQinghua2,ZhangMing2,YuShuna2,JiangJiying2△

(1.Class2,Grade2013,DepartmentofPharmacy，WeifangMedicalCollege，Weifang,Shandong261053,China;2.TeachingandResearchingSectionofAnatomy，WeifangMedicalCollege，Weifang,Shandong261053，China)

Objective To investigate the protective effects of N-acetyl-L-tryptophan (L-NAT) on neonatal rat striatal injury hypoxic-ischemic encephalopathy(HIE).Methods The HIE rat model was established with SD neonatal rats on 7 d.The morphological change of striatum was evaluated by HE staining and the expression levels of Caspase3,Bcl-2 and Bax were observed by immunofluorescence staining.Results Compared with the sham group,the expression of Caspase-3,Bcl-2 and Bax in the HIE group was increased,while the neurons in striatum were arranged in disorder,moreover the number was significantly decreased;the injury degree of striatal neurons in the HIE+L-NAT group was alleviated,Caspase-3 and Bax expression was decreased and Bcl-2 expression was further increased.Conclusion L-NAT protects neonatal rat hypoxic-ischemic cerebral injury possibly by regulating Bcl-2 family protein expression to alleviate the injury degree of striatal neurons.

hypoxic-ischemic injury；N-acetyl-L-tryptophan；striatum;apoptosis；rats

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.31.004

山東省自然科學(xué)基金資助項目(ZR2010HM006,ZR2014HL020,ZR2014HL021)；山東省教育廳資助項目(J11LF14)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃資助項目(2014WS0464)；濰坊醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新研究基金資助項目(K1301001)；濰坊醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金資助項目(KX20150091)；濰坊醫(yī)學(xué)院青年創(chuàng)新基金資助項目(K1302035)。

趙納杰(1995-)，本科,主要從事腦缺血缺氧損傷研究?！?/p>

，E-mail:jiangjiying2002@163.com。

R743.3

A

1671-8348(2016)31-4331-03

2016-02-24

2016-06-12)