邊 云 田風(fēng)勝 張 倩 石 驍 劉瑞雪

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復(fù)榮通脈膠囊對糖尿病大鼠血清ADMA水平及胸主動脈eNOS、NF-κB表達(dá)的影響

邊 云 田風(fēng)勝*張 倩 石 驍 劉瑞雪

目的：觀察復(fù)榮通脈膠囊對糖尿病(DM)大鼠血清非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)水平、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討其防治DM大血管病變的作用機(jī)制。方法：60只Wistar大鼠先分為空白對照組(n=10)和造模組(n=50)，后者復(fù)制DM模型后，再分為DM組(n=9)、復(fù)榮通脈低劑量組(n=10)、復(fù)榮通脈中劑量組(n=9)和復(fù)榮通脈高劑量組(n=9)，低、中、高劑量組分別給予0.7、1.4、2.8g/kg體重復(fù)榮通脈膠囊灌胃，其余兩組給予等量純凈水灌胃。8周后，從胸主動脈采血檢測ADMA水平；留取胸主動脈制備病理切片，SP法免疫組化染色觀察胸主動脈eNOS和NF-κB陽性染色面積及強(qiáng)度。結(jié)果：與空白對照組比較，DM組及復(fù)榮通脈低、中、高劑量組血清ADMA水平及組織NF-κB表達(dá)明顯增加(P<0.01),組織eNOS表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與DM組比較，復(fù)榮通脈低、中、高劑量組血清ADMA水平及組織NF-κB表達(dá)明顯降低(P<0.01)，組織eNOS表達(dá)明顯升高(P<0.01)；中、高劑量組ADMA、NF-κB的降低和eNOS的升高更明顯(P<0.05)。結(jié)論：復(fù)榮通脈膠囊通過降低DM大鼠血清ADMA水平，上調(diào)胸主動脈eNOS和下調(diào)NF-κB的表達(dá)，對大血管病變發(fā)揮保護(hù)作用。

復(fù)榮通脈膠囊；糖尿病大鼠；非對稱性二甲基精氨酸；內(nèi)皮型一氧化氮合酶；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是由胰島素分泌不足或功能缺陷引起的，以慢性高血糖為主、合并脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂為特征的臨床綜合征。DM血管病變作為DM慢性并發(fā)癥之一，是DM致殘致死的最主要原因。DM大血管病變的病理基礎(chǔ)為動脈粥樣硬化(Arteriosclerosis，AS)，而內(nèi)皮細(xì)胞受損和內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙啟動AS，并貫穿于AS發(fā)生發(fā)展的整個過程中。復(fù)榮通脈膠囊是與本院自制中藥制成的復(fù)方制劑(冀藥制字Z20070041)，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)功效，開發(fā)之初主要用于治療DM性周圍血管病變及周圍神經(jīng)病變，之后發(fā)現(xiàn)其對DM大血管病變亦療效顯著，且能預(yù)防血栓形成。但其作用機(jī)制不甚明了。本研究通過DM大鼠模型觀察復(fù)榮通脈膠囊對其血清非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)水平和胸主動脈內(nèi)皮型一氧化合酶(eNOS)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響，探討其保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，從而防治大血管病變的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級健康雄性Wistar大鼠(體重 200g±30g)60 只，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[動物合格證號：1405034，單位許可證號：SCXK(冀)2013-1-003]。分籠(每籠4只)飼養(yǎng)，自由飲水，室溫22℃-26℃。濕度45%-65%，每日12h光照維持，晝夜循環(huán)。

1.1.2 實驗藥物：復(fù)榮通脈膠囊，主要由水蛭、地龍、全蝎、黃芪、當(dāng)歸、玄參、葛根、穿山龍、首烏藤、川牛膝、甘草等組成，由河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥制劑室監(jiān)制生產(chǎn)，每粒0.5g，批準(zhǔn)文號：冀藥制字Z20070041，生產(chǎn)批號：140310。實驗時按比例加入純凈水制成混懸液。

1.1.3 實驗試劑和儀器：鏈脲佐菌素(STZ)、檸檬酸鈉為美國sigma公司產(chǎn)品；ADMA ELISA試劑盒，eNOS、NF-κB免疫組化試劑盒由石家莊市淼森科技有限公司提供；德國羅氏公司血糖儀(羅康全活力型)；日本日立公司7600-010型全自動生化分析儀；日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11光學(xué)顯微鏡及其照相裝置；病理組織漂烘處理儀；病理圖文分析系統(tǒng)；日本HM-200電子天平和德國Eppendorf-5430離心機(jī)；德國萊卡RM2015石蠟切片機(jī)；日本三洋MDF-382E型超低溫冰箱和江蘇太倉醫(yī)用儀器廠DSHZ-300型恒溫水浴箱；美國Media Cybernetics 公司多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及復(fù)制DM模型：60只實驗Wistar大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照完全隨機(jī)原則分為空白對照組(n=10)和DM造模組(n=50)，造模組大鼠禁食12h后按文獻(xiàn)[1，2]方法(略作改進(jìn))，一次性腹腔注射1% STZ 60mg/kg(臨用前將STZ粉溶于0.1mmol/L、pH4.2無菌檸檬酸鈉緩沖液)；空白對照組腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。72h后尾靜脈取血測血糖(BG)，BG≥16.7mmol/L確定為DM模型大鼠。本次造模有3只大鼠BG未達(dá)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并死亡3只，共造模成功44只。平穩(wěn)一周后進(jìn)行下述實驗。

1.2.2 藥物干預(yù)：44只成模大鼠按照數(shù)據(jù)表法抽取40只平分DM組、復(fù)榮通脈低劑量組、復(fù)榮通脈中劑量組和復(fù)榮通脈高劑量組，每組10只。另4只用作其它實驗。參考文獻(xiàn)方法，按人體-大鼠體表面積比值表換算出實驗大鼠等效劑量[1]，每天新鮮配制藥液(準(zhǔn)確稱取實驗所需藥粉溶于純凈水中)。復(fù)榮通脈中劑量組給予1.4g/kg體重灌胃、復(fù)榮通脈低劑量組給予0.7g/kg體重灌胃、復(fù)榮通脈高劑量組給予2.8g/kg體重灌胃，容積10ml/kg，每日一次，連續(xù)8周?？瞻讓φ战M和DM組每日給予等量純凈水灌胃。期間大鼠自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，每天更換墊料，清理實驗室。

1.2.3 BG和血清ADMA水平測定：連續(xù)灌胃8周后，各組大鼠隔夜禁食12h(飲水不限)，空腹稱重，以3%戊巴比妥鈉(80mg/kg)[2]腹腔注射麻醉，尾尖采血，用羅氏血糖儀檢測BG水平；之后，迅速常規(guī)方法開胸、分離胸主動脈，從胸主動脈采血2ml，按試劑盒說明書采用ELLSA檢測血清ADMA水平。

1.2.4 組織eNOS、NF-κB水平測定：分離各組大鼠胸主動脈1-2cm，置于4%多聚甲醛中固定，洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(5μm)，采用免疫組化SP法染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。應(yīng)用彩色病理圖文分析系統(tǒng)計算病理組織切片中eNOS、NF-κB陽性染色面積與視窗面積的百分比(%)。細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色、棕褐色顆粒為陽性組織。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠存活情況及BG水平

復(fù)榮通脈治療8周后，DM組死亡1只(可能為腹部注射STZ繼發(fā)感染所致)；復(fù)榮通脈中劑量組死亡1只，可能死于酮癥酸中毒或高滲綜合征；復(fù)榮通脈高劑量組逃逸1只。治療前，DM組及復(fù)榮通脈低、中、高劑量組BG水平明顯高于空白對照組(P<0.01)，且四組間無明顯差異(P>0.05)。治療8周后，DM組和復(fù)榮通脈低、中、高劑量組BG水平雖較治療前降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。DM組及復(fù)榮通脈低、中、高劑量組BG水平仍然明顯高于空白對照組(P<0.01)，但四組間仍無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠治療前后BG比較±s)

注：與空白對照組比較，1)P<0.01

2.2 各組血清ADMA水平比較

治療8周后，與空白對照組比較，DM組血清ADMA水平明顯升高(P<0.05)；與DM組比較，復(fù)榮通脈低、中、高劑量組血清ADMA降低，復(fù)榮通脈中、高劑量組血清 ADMA水平降低更明顯(P<0.05)，且中、高劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 見表2 。

表2 各組大鼠治療8周后血清ADMA水平比較±s)

注：與空白對照組比較，1)P<0.05;與DM組比較，2)P<0.05；與復(fù)榮通脈低劑量組比較,3)P<0.05

2.3 各組胸主動脈eNOS表達(dá)水平比較

免疫組化染色結(jié)果顯示，胸主動脈內(nèi)皮SP染色eNOS陽性細(xì)胞胞膜呈棕、黃色?？瞻讓φ战MeNOS陽性染色面積較大，DM組顯著減少(P<0.01)，復(fù)榮通脈低、中、高劑量灌胃治療8周后胸主動脈eNOS陽性面積較DM組增加(P<0.01)；尤其中、高劑量治療組陽性面積更大于低劑量組(P<0.05)；且中、高劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但仍小于空白對照組(P<0.05)。見圖1、表3。

2.4 各組胸主動脈NF-κB表達(dá)水平比較

免疫組化染色結(jié)果顯示，胸主動脈內(nèi)膜SP染色NF-κB陽性細(xì)胞核呈棕、褐色?？瞻讓φ战MNF-κB陽性面積較小，DM組面積較大(P<0.01)，復(fù)榮通脈低、中、高劑量灌胃治療8周后大鼠胸主動脈NF-κB陽性面積明顯較DM組明顯減少(P<0.01)，其中、高劑量組更少于低劑量組(P<0.05)；且中、高劑量組間無明顯差異(P>0.05)；但仍多于空白對照組(P<0.05)。見圖2、表3。

[本文圖1、圖2見封2]

3 討 論

有研究在4 845例DM患者中發(fā)現(xiàn)大血管病變率達(dá)38.3%[3]。AS是DM血管病變的病理基礎(chǔ)，貫穿血管病變始終。高血糖可加速AS進(jìn)程，導(dǎo)致全身多處大血管受累，發(fā)生彌漫性管腔狹窄及多發(fā)不穩(wěn)定斑塊，引起多種DM性心腦血管疾病，如冠心病、腦卒中及腎動脈硬化、下肢動脈硬化、壞疽等，是造成DM患者致殘和死亡的主要原因[4]。

表3 各組大鼠胸主動脈eNOS、NF-κB表達(dá)水平比較

注：與空白對照組比較，1)P<0.01; 與DM組比較,2)P<0.01;與復(fù)榮通脈低劑量組比較,3)P<0.05

NO作為人體內(nèi)的血管舒張因子，不僅能夠舒張血管、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長，還能抑制白細(xì)胞趨化、黏附和血小板聚集，同時抑制平滑肌細(xì)胞增殖[5]，具有抗AS作用。高血糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激觸發(fā)的線粒體呼吸鏈傳遞效應(yīng)以及血管內(nèi)皮細(xì)胞來原ADMA均可使體內(nèi)反應(yīng)性氧產(chǎn)物(Reactive Oxygen Species,ROS)增多[6,7]，引起eNOS表達(dá)下調(diào)及NO的生物利用度降低，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[8，9]。ADMA是L-精氨酸類似物，具有競爭性抑制eNOS活性部位和降低eNOS活性、調(diào)節(jié)NO合成的作用[10]。而且，體內(nèi)ADMA水平升高導(dǎo)致NOS失偶聯(lián)產(chǎn)生的過多自由基又會使ADMA進(jìn)一步升高，從而損傷血管內(nèi)皮，造成血管病變[11]。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的二聚體核轉(zhuǎn)錄因子，主要參與包括免疫和炎性細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)多種參與及加速AS基因的表達(dá)，包括細(xì)胞因子、細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)、NOS、血管緊張素II(AngII)等，在DM血管病變中發(fā)揮作用。徐雪晶等[12，13]的實驗發(fā)現(xiàn)，ADMA也可能通過以下NF-κB途徑介導(dǎo)AS：(1)增強(qiáng)氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)表達(dá)，促使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞；(2)升高iNOS的表達(dá)水平，促進(jìn)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。從而不斷加速DM血管病變的發(fā)生發(fā)展。

本研究中，DM大鼠胸主動脈ADMA水平及NF-κB表達(dá)明顯升高，eNOS表達(dá)明顯降低，表明ADMA、NF-κB、eNOS在DM大血管并發(fā)癥中起重要作用。不同劑量復(fù)榮通脈膠囊均可降低血清ADMA水平，同時抑制NF-κB、促進(jìn)eNOS在大鼠胸主動脈的表達(dá)，尤以中、高劑量組效果更好，且中、高劑量組間無差異。提示復(fù)榮通脈膠囊可改善血管內(nèi)皮功能紊亂，對DM大血管病變具有一定治療作用，推薦臨床使用以中劑量為宜。

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本文第一作者簡介：

邊 云(1987-)，女，漢族，碩士，住院醫(yī)師，主要從事糖尿病的中西醫(yī)結(jié)合臨床研究

1 徐淑云,卞如濂, 陳 修. 藥理實驗方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社, 2005：202-204.

2 徐淑云,卞如濂,陳 修,藥理實驗方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社, 2005:1 846-1 849.

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Influence of Furongtongmai Capsule on the Expression of eNOS and ADMA, NF-κB in Thoracic Aorta Tissue of Diabetic Rats

BIAN Yun, TIAN Feng-sheng*,ZHANG Qian,SHI Xiao,LIU Rui-xue

Department of Endocrinology,Affiliated CangZhou Traditional-western Combination Medical Hospital of Hebei Medical University, Cangzhou 061001，China;*Corresponding author

Objective: To observe the effect of traditional chinese medicine compound preparations -Furongtongmai capsule on the expression of eNOS, ADMA and NF-κB on thoracic aorta tissue of diabetic rats, and the protective effects of Furongtongmai capsule on the diabetes vascular lesions were examined in this study. Method: 60 Wistar rats were randomly divided into two groups: normal control group (NC,n=10), build modle group (n=50). After diabetes mellitus(DM) rats were made,40 of diabetes rats were randomly divided into DM group(n=9), Fu rong tong mai capsules low dosage group(FRL)(n=10), Fu rong tong mai capsules middle dosage group(FRM)(n=9), Fu rong tong mai capsules high dosage group(FRH)(n=9). FRM was given the 1.4 g/(kg body weight) to fill the stomach,FRL was given 0.7 g/kg body weight, FRH was given 2.8 g/(kg body weight) , the rest of the two groups of daily to give the same dose of purified water. 8 weeks later, 2 mL blood was taken from thoracic aortic for serum ADMA betection. The expression of eNOS and NF-κB on thoracic aortic tissue were examined with immunohistochemical staining.The positive area and integrated optical density (IOD) was measured by colour image analytic system. Results: Compared with NC group,DM group and FRL,FRM,FRH groups retinal capillary expression of ADMA and NF-κB significantly increased (P<0.01)，the expression of eNOS decreased(P<0.01). Compared with DM group, FRL,FRM,FRH groups retinal capillary expression of ADMA and NF-κB significantly increased (P<0.01)，the expression of eNOS increased(P<0.01). Compared with FRL group, FRM and FRH group expression of ADMA and NF-κB significantly increased (P<0.05)， eNOS increased(P<0.05).Conclusion: Furongtongmai capsule can reduce serum ADMA level. Beside it can inhibit the NF-κB and promote the expression of eNOS in thoracic aorta in rats.Furongtongmai capsule plays a protective role on blood vessels. So it has a certain therapeutic effect on diabetic vascular lesions.

Furongtongmai capsule; Diabetic rats; ADMA; eNOS; NF-κB

河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌三科，滄州 061001；*

本文2016-08-20收到，2016-09-31修回

R587.1；R285.5

A

1005-1740(2016)04-0011-04