夏尊恩 周 泉 李 艷

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脫氫表雄酮對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管舒張功能的影響*

夏尊恩 周 泉 李 艷#

目的：分析脫氫表雄酮(DHEA)對(duì)CD40L刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)水平及ET-1 mRNA和內(nèi)皮源性NO合酶(eNOS)mRNA表達(dá)水平的影響，探討DHEA對(duì)血管舒張的作用。方法：原代培養(yǎng)HUVECs，給予CD40L(1μg/m1)刺激(CD40L刺激組)和不同濃度DHEA(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L，分別為低、中、高濃度DHEA組)干預(yù)，以不作干預(yù)的培養(yǎng)細(xì)胞為空白對(duì)照組。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)HUVECs的ET-1、eNOS mRNA表達(dá)，采用ELISA和硝酸還原酶法分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO和ET-1濃度。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，CD40L刺激組ET-1 mRNA和ET-1濃度明顯增加，eNOS mRNA和NO水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與CD40L組比較，不同濃度DHEA組ET-1 mRNA和ET-1水平降低，eNOS mRNA和NO水平增加，以高濃度DHEA組變化最明顯(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：DHEA能通過抑制ET-1表達(dá)和促進(jìn)NO生成來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的舒張血管功能。

脫氫表雄酮；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；一氧化氮；內(nèi)皮素-1；舒張功能

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重危害人類健康的一種常見血管病，目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)是導(dǎo)致AS形成的重要因素[1]。血管內(nèi)皮不僅具有屏障功能，更重要的是它還具有內(nèi)分泌、信息傳遞、血小板調(diào)節(jié)和抗黏附等功能。正常狀態(tài)下，血管內(nèi)皮會(huì)分泌一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、內(nèi)皮源性NO合酶(Endothelial Nitric Oxide

Synthase，eNOS)、前列環(huán)素、白細(xì)胞介素6(IL-6)等血管活性因子，調(diào)節(jié)血管舒張、收縮、炎癥反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞增殖、血小板聚集、白細(xì)胞黏附等[2]。流行病學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料顯示脫氫表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)作為一種雄激素，對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用[3-5]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，雄激素可使男性冠心病患者肱動(dòng)脈擴(kuò)張，而這些血管擴(kuò)張作用主要依賴于血管內(nèi)皮舒張功能[6]。因此，本文通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)，觀察DHEA對(duì)其表達(dá)NO、ET-1、eNOS的作用，探討DHEA對(duì)血管內(nèi)皮舒張/收縮功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

內(nèi)皮細(xì)胞ECM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司；DHEA、1型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司(批號(hào)15596-028)；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑購(gòu)自立陶宛Fermentas公司(批號(hào)1175936)，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所(批號(hào)20120430)；ET-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Assay Designs Inc公司(批號(hào)K863502)。實(shí)驗(yàn)所用臍帶采自本院產(chǎn)科健康新生兒，產(chǎn)婦及家屬知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：無菌條件下取健康新生兒臍帶，采用膠原酶消化法從臍靜脈血管內(nèi)皮將內(nèi)皮細(xì)胞洗脫下來后進(jìn)行原代培養(yǎng)，待細(xì)胞融合長(zhǎng)滿形成單層細(xì)胞后，用0.25%胰蛋白酶消化及傳代培養(yǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞鑒定采用Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色，呈典型鋪路石樣排列。實(shí)驗(yàn)前24h將培養(yǎng)基改為無血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)選用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)共分為5組：(1)空白對(duì)照組(無干預(yù))；(2) CD40L刺激組[7](1μg/m1 CD40L與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)24h)；(3)低濃度DHEA(10-8mol/L)組；(4)中濃度DHEA(10-7mol/L)組；(5)高濃度DHEA(10-6mol/L)組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。3-5組先給予不同濃度的DHEA 干預(yù)1h，再加入1μg/ml CD40L與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)24h。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：用TRIzol試劑提取HUVECs總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。ET-1上游引物：5’-TAC TTC CCA CAA AGA CCA CA-3’，下游引物：5’-CGG ACA GAT GTT CTT GCT AA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為356bp。eNOS上游引物：5’-GAG TCC TCA CCG CCT TCT C-3’，下游引物：5’-AGG AAG CGC GTG GCA GTA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為664bp。GAPDH上游引物：5’-ACG GAT TTG GTC GTA TTG GG-3’，下游引物：5’-TCC TGG AAG ATG GTG ATG GG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為211bp。PCR條件為：94℃預(yù)變性2min，進(jìn)入循環(huán)，94℃變性60s，ET-1：54℃，GAPDH：56℃，eNOS：54℃，退火60s，72℃延伸60s的條件下循環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)定PCR產(chǎn)物條帶的光密度(A)值。以GAPDH作內(nèi)參照，ET-1和eNOS條帶的A值分別與GAPDH的A值的比值表示其相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 ET-1濃度測(cè)定：采用ELISA雙抗體夾心法。嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法操作，在酶標(biāo)儀450nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣品ET-1濃度。

1.2.4 NO濃度測(cè)定：采用硝酸還原酶法。分別取雙蒸水、標(biāo)準(zhǔn)品和各組培養(yǎng)細(xì)胞上清液各100μl，按照NO檢測(cè)試劑盒方法操作，在酶標(biāo)儀上測(cè)定550nm處A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品A值計(jì)算各組樣品NO含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 DHEA對(duì)ET-1 mRNA表達(dá)的影響

相對(duì)定量分析顯示，各組ET-1 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.18，P<0.01)。CD40L刺激組ET-1 mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增加(1.16±0.21 vs 0.23±0.05，t=10.63，P<0.01)；不同濃度DHEA組ET-1 mRNA表達(dá)均較CD40L刺激組下降，高濃度DHEA組下降最多(0.46±0.12，t=8.49，P<0.05)。見圖1。

2.2 DHEA對(duì)ET-1濃度的影響

各組ET-1濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.56，P<0.01)。與空白對(duì)照組比較，CD40L刺激組ET-1水平明顯上升(46.15±5.07μg/L vs 75.39±6.51μg/L，t=4.96，P<0.05)，不同濃度DHEA 組ET-1濃度均較CD40L刺激組下降，高濃度DHEA組下降最多(46.68±5.24μg/L，t=6.71，P<0.05)。見圖2。

注：與空白對(duì)照組比較，* P<0.01；與CD40L刺激組比較，

注：與空白對(duì)照組比較，* P<0.05；與CD40L刺激組比較，

2.3 DHEA對(duì)eNOS mRNA表達(dá)的影響

各組間eNOS mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.39，P<0.01)。與空白對(duì)照組比較，CD40L刺激組eNOS mRNA表達(dá)降低(0.20±0.05 vs 0.11±0.03，t=6.38，P<0.01)。與CD40L刺激組比較，不同濃度DHEA組eNOS mRNA表達(dá)顯著增加，相對(duì)定量值分別為0.21±0.06、0.33±0.09、0.52±0.11(t=7.02、8.54、10.36，P<0.05或P<0.01)。見圖3。

注：與空白對(duì)照組比較，* P<0.01；與CD40L刺激組比較，

2.4 DHEA對(duì)NO濃度的影響

各組NO濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.47，P<0.01)。與空白對(duì)照組比較，CD40L刺激組NO濃度明顯降低(18.22±3.43μmol/L vs 12.38±2.11μmol/L，t=7.12，P<0.05)。中、高濃度DHEA組NO較CD40L組明顯增加，濃度分別為15.21±2.38μmol/L和18.45±2.76μmol/L(t=5.23、6.87，P<0.05)。見圖4。

注：與空白對(duì)照組比較，* P<0.05；與CD40L刺激組比較，

3 討 論

在AS發(fā)生發(fā)展的早期階段，血管內(nèi)皮功能障礙發(fā)揮著重要作用，損傷的血管內(nèi)皮可能失去原有的生理功能，極易發(fā)生炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積、血栓形成，從而加速AS[8]。因此血管內(nèi)皮不僅是重要的血管屏障，而且是調(diào)節(jié)血管舒張功能和血管結(jié)構(gòu)的內(nèi)分泌器官。生理?xiàng)l件下，內(nèi)皮細(xì)胞在各種刺激下由eNOS催化左旋精氨酸的氧化反應(yīng)，生成并不斷釋放NO到周圍組織和細(xì)胞中，調(diào)節(jié)血管張力和血管擴(kuò)張；同時(shí)NO還具有抗凝、抗氧化、抗細(xì)胞黏附等作用，可阻止血小板聚集和白細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的黏附，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞舒張，從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用[9]。病理狀態(tài)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，其主要表現(xiàn)為NO減少。在炎性細(xì)胞因子作用下，eNOS活性減弱，NO合成量減少，會(huì)加重血管內(nèi)皮舒張/收縮障礙。

ET具有很強(qiáng)的促血管收縮作用，其3個(gè)亞型中ET-1對(duì)心血管系統(tǒng)起著重要的作用。ET-1主要由內(nèi)皮細(xì)胞在血管壁剪切力、壓力等物理因素以及腎上腺素、血管緊張素、血栓素等刺激下合成和分泌，用以調(diào)節(jié)局部血管張力，促進(jìn)血管收縮和炎癥反應(yīng)的形成，并能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激和激活血小板。而NO能抑制ET-1的合成，拮抗ET-1功能，維護(hù)血管內(nèi)皮的正常舒張活性。Alvarez等[10]研究證實(shí)ET-1可使冠狀動(dòng)脈強(qiáng)烈痙攣，具有心肌細(xì)胞毒性作用和致心律失常作用，ET-1活性的異常升高對(duì)于心肌缺血和心肌梗死的發(fā)生有重要意義。ET-1和NO的比例失調(diào)會(huì)導(dǎo)致冠脈管腔狹窄，加重心肌缺血缺氧，使冠心病更加惡化。因此，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，抑制冠脈收縮，增加冠脈血流量，已經(jīng)成為冠心病治療研究中的重要靶點(diǎn)。

DHEA是人體含量最高的一種內(nèi)源性雄激素，其對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制與其調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)。有報(bào)道[11]DHEA可以使離體兔主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈顯著擴(kuò)張，能通過抑制平滑肌細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)內(nèi)皮損傷后的血管重塑；并且DHEA還能通過G蛋白藕聯(lián)受體促進(jìn)血管內(nèi)皮NO的合成。Hayashi等[12]通過高脂飲食兔來研究DHEA對(duì)AS影響的作用機(jī)制，結(jié)果表明DHEA可通過轉(zhuǎn)化為雌激素并促進(jìn)NO生成而發(fā)揮抗AS作用。

炎性細(xì)胞因子CD40/CD40L是介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要介質(zhì)，其相互作用可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活炎性因子、黏附分子和趨化因子表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞黏附和血小板聚集，形成AS早期炎癥反應(yīng)并加速斑塊形成和不穩(wěn)定。我們之前的研究表明，DHEA能顯著抑制CD40和CD40L的表達(dá)[13]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了DHEA對(duì)CD40L誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞舒張功能的影響，結(jié)果顯示，DHEA不僅能抑制CD40L誘導(dǎo)的ET-1分泌及ET-1 mRNA的表達(dá)，還能促進(jìn)eNOS mRNA表達(dá)和來自于eNOS的NO含量的增加，因而能減少CD40L的促內(nèi)皮損傷作用，并激活eNOS促內(nèi)皮細(xì)胞釋放較多NO，減輕內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，對(duì)冠脈的損傷修復(fù)起到積極地保護(hù)作用。

綜上所述，DHEA能通過抑制ET-1表達(dá)，促進(jìn)eNOS和NO生成來保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的舒張功能。該結(jié)果為臨床應(yīng)用DHEA治療AS提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

夏尊恩(1981-)，男，漢族，醫(yī)學(xué)博士，主管技師，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化與炎癥機(jī)制研究

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Influence of Dehydroepiandrosterone on Diastolic Function in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

XIA Zun-en，ZHOU Quan，LI Yan#

Department of Clinical Laboratory, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China;#Corresponding author

Objective: To investigate effect of dehydroepiandrosterone (DHEA) on expression of NO, ET-1 and eNOS in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) and influence of DHEA on diastolic function in HUVECs.Method: HUVECs were incubated with 1μg/m1 CD40L for 24 hours with or without pretreated by different concentration of DHEA(10-8mol/L,10-7mol/L,10-6mol/L). ET-1 and eNOS mRNA expression were detected by RT-PCR. The levels of NO and ET-1 were measured by nitrate reduction test and ELISA. Results: Compared with control group, CD40L increased the mRNA expression of ET-1 and level of ET-1 in HUVECs(allP<0.01). Meanwhile, the eNOS mRNA expression and NO content in HUVECs in CD40L group were decreased(allP<0.01). DHEA with different concertration could down-regulate the ET-1 mRNA and ET-1 expression and promote the eNOS mRNA expression and NO content in HUVECs,espically the most obvious change was in 10-6mol/L DHEA group(P<0.05,P<0.01). Conclusion: DHEA could regulate vascular endothelial cells diastolic function by promoting NO generation and inhibiting ET-1 expression.

Dehydroepiandrosterone; Human umbilical vein endothelial cells; NO; ET-1; Diastolic function

國(guó)家自然科學(xué)基金(81101319)

武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430060；#

本文2016-09-02收到，2016-10-10修回

R392.11

A

1005-1740(2016)04-0007-05