張 琳 王秀英 吳歡聽 王海波 陳少魁 朱惠玲 劉玉蘭

(武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430023)

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甘氨酸對脂多糖刺激仔豬肝臟能量代謝及相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用

張 琳 王秀英 吳歡聽 王海波 陳少魁 朱惠玲 劉玉蘭*

(武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430023)

本試驗(yàn)旨在研究甘氨酸(Gly)對脂多糖(LPS)刺激斷奶仔豬肝臟能量代謝、能量代謝關(guān)鍵酶和相關(guān)調(diào)節(jié)因子mRNA表達(dá)的調(diào)控作用。選取24頭杜×長×大仔豬，分成4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)。4個(gè)組分別為：1)對照組(基礎(chǔ)飼糧)；2)LPS組(LPS+基礎(chǔ)飼糧)；3)1.0%Gly組(LPS+基礎(chǔ)飼糧+1.0%Gly)；4)2.0%Gly組(LPS+基礎(chǔ)飼糧+2.0%Gly)。試驗(yàn)第28天，試驗(yàn)組仔豬腹膜注射100 μg/kg BW的LPS，對照組注射等量的生理鹽水。試驗(yàn)豬于注射LPS或生理鹽水4 h后屠宰，取肝臟樣品待測。結(jié)果表明：1)與LPS組相比，1.0%Gly顯著提高了仔豬肝臟三磷酸腺苷(ATP)濃度和能荷(EC)水平(P<0.05)，顯著降低了一磷酸腺苷(AMP)/ATP值(P<0.05)，并有降低AMP濃度的趨勢(P<0.10)；2.0%Gly有降低AMP/ATP值的趨勢(P<0.10)。2)與LPS組相比，1.0%Gly顯著降低了仔豬肝臟己糖激酶2(Hexok2)和檸檬酸合成酶(CS)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)；2.0%Gly顯著降低了肝臟Hexok2和丙酮酸激酶(PK)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，并有降低肝臟CSmRNA表達(dá)量的趨勢(P<0.10)。3)與LPS組相比，1.0%Gly顯著提高了仔豬肝臟腺甘酸活化蛋白激酶α1(AMPKα1)的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。綜上所述，飼糧中添加Gly能夠改善LPS刺激引起的斷奶仔豬肝臟能量代謝紊亂，調(diào)控糖酵解和三羧酸循環(huán)等代謝途徑中相關(guān)酶的表達(dá)。

仔豬；脂多糖；甘氨酸；肝臟；能量代謝

肝臟是動(dòng)物機(jī)體重要的免疫器官，也是機(jī)體進(jìn)行物質(zhì)和能量代謝的重要場所。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜特有的結(jié)構(gòu)成分，能夠造成機(jī)體免疫應(yīng)激[1]。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物處于免疫應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，機(jī)體免疫細(xì)胞被激活并產(chǎn)生和釋放大量炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)，增加肝臟能量損耗，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷[2]。

甘氨酸(glycine,Gly)是所有氨基酸中結(jié)構(gòu)最簡單的氨基酸，也是一種機(jī)體自身能合成的非必需氨基酸，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。作為一種功能性氨基酸，Gly能夠抑制內(nèi)毒素造成的肝臟損傷[3]，保護(hù)肝細(xì)胞免受三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)衰竭的影響[4]。此外，Gly作為生糖氨基酸，可以經(jīng)過分解生成丙氨酸(alanine,Ala)，而Ala可進(jìn)一步進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為機(jī)體提供能量[5]。Gly也是合成谷胱甘肽(glutathiose,GSH)的前體物質(zhì)[5]，而還原型GSH可以參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝，使機(jī)體獲得高能量[6]。Wang等[7]報(bào)道，飼糧中添加0.5%、1.0%和2.0%的Gly提高了哺乳仔豬抗氧化應(yīng)激能力。仔豬飼糧中添加不多于2%的Gly，對其正常的生理功能和采食是安全且有益的[8]。但是，過多的Gly則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氨基酸平衡的破壞并產(chǎn)生毒性作用[9]。盡管Gly有很多重要的功能，但是關(guān)于Gly對仔豬肝臟能量代謝的影響還鮮有研究。因此，本試驗(yàn)通過給斷奶仔豬注射LPS建立免疫應(yīng)激模型[10]，選取1%和2% 2個(gè)濃度，研究Gly對LPS應(yīng)激仔豬肝臟能量代謝障礙有無緩解作用及Gly的適宜添加量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Gly：有效成分>99.5%，購于武漢阿米諾科技有限公司。Ala：有效成分>99.5%，購于武漢阿米諾科技有限公司。LPS：大腸桿菌血清型O55∶B5，購于Sigma公司，以100 μg/kg BW劑量注射。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

選擇24頭體況相近的(21±1)日齡斷奶仔豬[杜×長×大，平均體重(7.17±0.41) kg]，按體重相近原則隨機(jī)分配到4個(gè)組中，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬，試驗(yàn)期為28 d。4個(gè)組分別為：1)對照組(基礎(chǔ)飼糧)；2)LPS組(LPS+基礎(chǔ)飼糧)；3)1.0%Gly組(LPS+基礎(chǔ)飼糧+1.0%Gly)；4)2.0%Gly組(LPS+基礎(chǔ)飼糧+2.0%Gly)。用Ala對各組飼糧進(jìn)行等氮處理。試驗(yàn)第28天，試驗(yàn)組仔豬腹膜注射100 μg/kg BW的LPS，對照組注射等量的生理鹽水。飼養(yǎng)期間，豬舍溫度控制在25～28 ℃。豬欄面積1.20 m×1.10 m。粉料飼喂，仔豬自由采食和飲水。

1.3 試驗(yàn)飼糧

飼糧配制參照NRC(1998)仔豬的營養(yǎng)需要，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 肝臟樣品采集

仔豬腹膜注射LPS或生理鹽水4 h后，靜脈注射80 mg/kg BW的戊巴比妥鈉麻醉，屠宰，取肝臟樣品，立即投入液氮中凍存，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 肝臟相關(guān)能量指標(biāo)濃度的測定

肝臟中ATP、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)和一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)濃度使用高效液相色譜法進(jìn)行分析，參照Hou等[11]的方法?？傁佘账?total adenine nucleotide,TAN)濃度和能荷(energy charges,EC)的計(jì)算參照下述公式：

TAN=ATP+ADP+AMP；

EC=(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet：VA 12 000 IU，VB11.5 mg，VB63 mg，VB1218 μg，VD32 500 IU，VE 30 IU，VK33 mg，核黃素 riboflavin 4 mg，煙酸 nicotinic acid 40 mg，氯化膽堿 choline chloride 400 mg，葉酸 folic acid 700 μg，泛酸pantothenic acid 15 mg，生物素 biotin 100 μg，Mn 20 mg，Se 0.36 mg，Zn 80 mg，Cu 25 mg，F(xiàn)e 83 mg，I 0.48 mg。

2)消化能、賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸和蘇氨酸為計(jì)算值，其余為實(shí)測值。DE, Lys, Met, Trp and Thr were calculated values, and the others were measured values.

1.5.2 mRNA表達(dá)量測定

相關(guān)基因測定包括：己糖激酶2(hexokinase2,Hexok2)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,L-PFK)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,ICDH)、檸檬酸合成酶(citroyl synthetase,CS)、脂酰輔酶A氧化酶(acyl-coenzyme A oxidase,ACO)、肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1,L-CPT1)、腺甘酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,Sirt1)以及過氧化物酶體增殖物活化受體協(xié)同刺激因子1α(proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α,PGC1α)。肝臟總RNA提取、cDNA合成、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)參照Liu等[12]的方法。real-time PCR引物序列(表2)由寶生物工程(大連)有限公司合成。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因，目的基因的mRNA表達(dá)量計(jì)算采用Livak等[13]的2-ΔΔCT法。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和LSD多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。以P<0.05表示差異顯著，P<0.10表示具有顯著性趨勢。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 肝臟腺苷酸水平

由表3可知，與對照組相比，LPS刺激顯著降低了肝臟ATP、ADP和TAN濃度(P<0.05)。與LPS組相比，飼糧中添加1.0%Gly顯著提高了肝臟ATP濃度和EC水平(P<0.05)，顯著降低了AMP/ATP值(P<0.05)，并有降低AMP濃度的趨勢(P<0.10)；飼糧中添加2.0%Gly有降低肝臟AMP/ATP值的趨勢(P<0.10)，對其他指標(biāo)無顯著影響(P>0.05)。

表3 肝臟腺苷酸水平(鮮重基礎(chǔ))

P1：對照組vs. LPS組 Control group vs. LPS group；P2：LPS組vs. 1.0%Gly組 LPS group vs. 1.0% Gly group；P3：LPS組vs. 2.0%Gly組 LPS group vs. 2.0% Gly group。下表同 The same as below。

2.2 肝臟糖酵解、三羧酸循環(huán)和脂肪酸β-氧化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

由表4可知，與對照組相比，LPS刺激顯著提高了肝臟糖酵解中Hexok2和PK以及三羧酸循環(huán)中ICDHβ和CS的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，顯著降低了肝臟L-PFK的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，并有提高肝臟PDH的mRNA表達(dá)量的趨勢(P<0.10)。與LPS組相比，飼糧中添加1.0%Gly顯著降低了肝臟Hexok2和CS的mRNA表達(dá)量(P<0.05)；飼糧中添加2.0%Gly顯著降低了肝臟Hexok2和PK的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，并有降低肝臟CS的mRNA表達(dá)量的趨勢(P<0.10)。

表4 肝臟糖酵解、三羧酸循環(huán)和脂肪酸β-氧化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

2.3 肝臟能量代謝相關(guān)調(diào)節(jié)因子的mRNA表達(dá)

由表5可知，與對照組相比，LPS刺激顯著提高了肝臟AMPKα2和Sirt1的mRNA表達(dá)量(P<

0.05)。與LPS組相比，飼糧中添加1.0%Gly顯著提高了肝臟AMPKα1的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。

表5 肝臟能量代謝相關(guān)調(diào)節(jié)因子的mRNA表達(dá)

3 討 論

機(jī)體內(nèi)直接供能的物質(zhì)是ATP。ATP水解為ADP和正磷酸或水解為AMP和焦磷酸時(shí)，能釋放出大量的能量。TAN是ATP、ADP和AMP三者之和，其大小反映了線粒體生成高能磷酸化合物的能力、氧化呼吸的活性和細(xì)胞的能量儲(chǔ)備[14]。EC水平反映了細(xì)胞內(nèi)高能磷酸鍵在ATP、ADP和AMP之間的相互轉(zhuǎn)換，可有效評(píng)估能量儲(chǔ)備狀態(tài)[15]。AMP/ATP值受ATP的調(diào)控，應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，ATP產(chǎn)生減少或利用增加，可使細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP值升高，激活A(yù)MPK，進(jìn)而激發(fā)一系列反應(yīng)來恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)的能量平衡[14]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在LPS注射4 h后，肝臟ATP、ADP和TAN濃度顯著降低，表明LPS刺激抑制了肝臟線粒體能量代謝，ATP動(dòng)態(tài)平衡被打破。Kang等[15]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。飼糧中添加Gly顯著提高肝臟ATP濃度和EC水平，降低肝臟AMP濃度和AMP/ATP值。與我們的研究結(jié)果類似，周軍利等[16]在乳鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Gly處理可緩解心肌細(xì)胞ATP濃度下降，改善細(xì)胞能量狀況。以上結(jié)果及分析表明，Gly可緩解LPS刺激導(dǎo)致的能量代謝障礙，促進(jìn)能量生成。

糖酵解、三羧酸循環(huán)和脂肪酸β-氧化是機(jī)體中重要的能量代謝途徑。Hexok2、PFK和PK可催化糖酵解中主要的不可逆反應(yīng)，促使ATP和丙酮酸產(chǎn)生[17-19]。丙酮酸在PDH的作用下氧化脫羧，生成乙酰輔酶A，進(jìn)而進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)ATP[5]。CS是三羧酸循環(huán)第1步反應(yīng)的限速酶，能決定乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)的速率[20]。ICDH也是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，有3種形式，分別是ICDHα、ICDHβ和ICDHγ，其中ICDHβ和ICDHγ可以將細(xì)胞質(zhì)中的代謝中間產(chǎn)物運(yùn)往線粒體，進(jìn)行三羧酸循環(huán)[21]。另外，脂肪酸β-氧化同樣是機(jī)體產(chǎn)能的重要途徑，ACO和L-CPT1是該過程中的關(guān)鍵酶[5]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在LPS注射4 h后，糖酵解中Hexok2、PK、PDH以及三羧酸循環(huán)中ICDHβ和CS的mRNA表達(dá)量顯著提高。與本試驗(yàn)結(jié)果相似，Sun等[22]研究表明，注射LPS的生長豬背最長肌中Hexok和PK的活性升高。飼糧中添加Gly顯著降低了Hexok2、PK和CS的mRNA表達(dá)量。Moura等[23]研究表明，在幼鼠體內(nèi)注射Gly顯著抑制了腦紋狀體CS的活性。這可能是因?yàn)镚ly提高了ATP濃度，從而抑制了糖酵解和三羧酸循環(huán)限速酶的mRNA表達(dá)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Gly對脂肪酸β-氧化關(guān)鍵酶ACO和L-CPT1 mRNA表達(dá)量無顯著影響，原因可能是在LPS刺激早期，Gly主要是通過影響肝臟糖酵解和三羧酸循環(huán)來對能量代謝進(jìn)行調(diào)控，而對肝臟脂肪酸β-氧化無顯著影響。

AMPK和Sirt1是細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，在能量限制的狀態(tài)下可被激活，并通過磷酸化、去乙?；饔眉せ頟GC1α[14]。當(dāng)細(xì)胞中能量儲(chǔ)存減少時(shí)，AMP/ATP值升高，AMPK被激活，通過限制合成代謝和促進(jìn)分解代謝，增加ATP的生成來維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)[14]。Sirt1與能量代謝包括糖異生和脂質(zhì)累積等細(xì)胞生物學(xué)功能有著密切的關(guān)系[24]，它能夠降低脂肪酸氧化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)[25]。PGC1α是與能量代謝關(guān)系密切的轉(zhuǎn)錄輔助活化因子[26]，在葡萄糖和脂肪酸代謝等過程中起著重要作用[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS注射4 h后，仔豬肝臟AMPKα2和Sirt1的mRNA表達(dá)量顯著提高。而飼糧中添加Gly也提高了肝臟AMPKα1的mRNA表達(dá)量，說明Gly不能緩解LPS刺激對AMPK相關(guān)信號(hào)的影響。這可能是因?yàn)镚ly不是通過影響AMPK、Sirt1和PGC1α來影響肝臟能量代謝的。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加Gly能夠通過調(diào)節(jié)糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝途徑中Hexok2、PK和CS等相關(guān)酶的表達(dá)，改善LPS刺激導(dǎo)致的斷奶仔豬肝臟能量代謝紊亂。

② 飼糧中添加Gly對脂肪酸β-氧化無顯著影響。

③ Gly不是通過影響AMPK、Sirt1和PGC1α來影響肝臟能量代謝的。

④ 考慮到不同水平Gly對仔豬肝臟能量水平的影響以及經(jīng)濟(jì)因素，建議采用1%Gly添加量。

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*Corresponding author, professor, E-mail: yulanflower@126.com

(責(zé)任編輯 田艷明)

Regulatory Role of Glycine on Energy Metabolism and Its Related Genes’ Expression in Liver of Piglets after Lipopolysaccharide Challenge

ZHANG Lin WANG Xiuying WU Huanting WANG Haibo CHEN Shaokui ZHU Huiling LIU Yulan*

(HubeiKeyLaboratoryofAnimalNutritionandFeedScience,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan430023,China)

This experiment was conducted to investigate the effects of glycine (Gly) on energy metabolism and the mRNA expression of the key enzymes and the regulatory factors involving in energy metabolism in liver of piglets after lipopolysaccharide (LPS) challenge. Twenty four Duroc×Landrace×Yorkshire piglets were randomly assigned into 4 groups with 6 replicates each and 1 pig in each replicate. The four groups were: 1) control group (basal diet); 2) LPS group (LPS+basal diet); 3) 1.0% Gly group (LPS+basal diet+1.0% Gly); and 4) 2.0% Gly group (LPS+basal diet+2.0% Gly). On the 28thday, the piglets in experimental groups were injected intraperitoneally with 100 μg/kg BW LPS, and the piglets in the control group were injected with the same dose of physiological saline. All piglets were slaughtered at 4 h after LPS or saline injection, and the liver samples were collected for further analysis. The results showed as follows: 1) compared with LPS group, supplementation of 1.0% Gly significantly increased liver ATP concentration and energy charge (EC) level of pigs (P<0.05), significantly decreased the ratio of AMP to ATP (P<0.05), and had a tendency to decrease AMP concentration (P<0.10); supplementation of 2.0% Gly had a tendency to decrease the ratio of AMP to ATP (P<0.10). 2) Compared with LPS group, supplementation of 1.0% Gly significantly decreased the mRNA expression of liver hexokinase 2 (Hexok2) and citroyl synthetase (CS) (P<0.05). In addition, supplementation of 2.0% Gly significantly decreased the mRNA expression of liverHexok2 and pyruvate kinase (PK) (P<0.05), and had a tendency to decrease the mRNA expression of liverCS(P<0.10). 3) Compared with LPS group, supplementation of 1.0% Gly significantly increased the mRNA expression of hepatic AMP-activated protein kinase α1 (AMPKα1) (P<0.05). These results indicate that dietary supplementation of Gly can attenuate energy metabolism disorder caused by LPS stimulation in liver of weaning piglets, and regulates the gene expression of the key enzymes in glycolysis and tricarboxylic acid cycle.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(12)：4006-4013]

piglets; LPS; glycine; liver; energy metabolism

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.12.035

2016-06-02

湖北省教育廳優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(T201508)

張 琳(1991—)，女，湖北棗陽人，碩士研究生，從事豬的營養(yǎng)生理與機(jī)理調(diào)控的研究。E-mail: 2223102573@qq.com

*通信作者：劉玉蘭，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: yulanflower@126.com

S828

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1006-267X(2016)12-4006-08