張雷鳴 徐嬌 劉振鵬 任偉超 馬偉

(北安市第一人民醫(yī)院，北安，164000) (黑龍江中醫(yī)藥大學)

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人參黑斑病拮抗菌的篩選1)

張雷鳴 徐嬌 劉振鵬 任偉超 馬偉

(北安市第一人民醫(yī)院，北安，164000) (黑龍江中醫(yī)藥大學)

通過與人參黑斑病(AlternariapanaxWhetz)病原真菌對峙培養(yǎng)的方法，從由人參葉片分離得到的18種內(nèi)生真菌中，篩選出Ab2.2①、AY10-1①、AXY②3種人參黑斑病拮抗菌，其抑菌率分別為70.9%、75.6%、77.5%，2種毛殼屬(ChaetomiumKunze)真菌As①、As②的抑菌率分別為56.4%、62.4%。

人參；內(nèi)生真菌；生物防治；人參黑斑??；人參病害

Biocontrol fungi against ginseng black spot pathogen were selected from 18 stains of endophytic fungi isolated from ginseng leaves by using plate-confrontation method. Ab2.2①, AY10-1① and AXY② bacteriostasis rates were 70.9%, 75.6%, and 77.5% respectively, and the rates of theChaetomiumfungi As①, and As② were 56.4%, and 62.4%, respectively.

人參黑斑病屬于傳染較為嚴重的病害，發(fā)病率一般在30%左右，嚴重的可達70%以上，影響人參參根的產(chǎn)量以及種子的收獲，造成減產(chǎn)和參籽干癟，是我國東北及河北等地，流行性很高的一種病害。在參齡達到3年以上的參場，也均可受到較為嚴重的侵害[1]。對于人參黑斑病的微生物防治近年來研究者較多，以吉林農(nóng)業(yè)大學的研究者為眾。但目前的研究僅停留于試驗研究階段，未見微生物及微生物源農(nóng)藥在人參黑斑病實際生產(chǎn)中得以應用的報道。微生物的選擇來源于人參內(nèi)生菌、根際土壤微生物及其它微生物。李勇等[2]從人參根中分離內(nèi)生細菌，得到2株對于人參黑斑病有明顯抑制作用的菌種，且對人參菌核病和銹腐病同樣有明顯作用，可作為生防菌進一步研究。賈斌等[3]從人參等多種中藥材根莖葉中，分離對于人參黑斑病具有拮抗作用的內(nèi)生細菌，發(fā)現(xiàn)從人參根中的得到的拮抗菌株最多，其中的1株解淀粉芽孢桿菌細菌，對于人參黑斑病的抑菌率為80%，抑菌作用明顯。李鵬翔[4]采集人參種植區(qū)土樣，分離的113株菌種，其中的1株芽孢桿菌屬細菌對于人參黑斑病的抑菌效果良好。強薇等[5]從人參根際土壤分離出的1株放線菌和1株木霉菌，對于人參黑斑病有明顯的高拮抗活性，拮抗率分別為71.33%、71.76%。王玲[6]采用益生菌EM發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)物，施入?yún)⑻?，能夠?qū)θ藚⒑诎卟∵M行良好的防治，降低了其發(fā)病率以及病情指數(shù)。吳長寶等[7]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌菌懸液對于人參黑斑病有較好的抑菌效果，較其發(fā)酵液效果明顯，抑菌圈直徑為16 mm，抑菌率為68.75%。大量文獻表明，對于人參內(nèi)生真菌的分離部位多為參根以及根際土壤，對于人參黑斑病侵害較為嚴重的葉片部位的內(nèi)生真菌的分離，少有報道。因此，本試驗僅僅針對人參葉片部位分離的18種內(nèi)生真菌，對于人參黑斑病的拮抗作用進行篩選，以其得到較為理想的生物防治菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

致病菌：人參黑斑病病原真菌(AlternariapanaxWhetz)，由吉林農(nóng)業(yè)大學提供。

拮抗菌株：由人參葉片提取分離得到的18種人參內(nèi)生真菌。

1.2 拮抗菌株的篩選

將于-4 ℃ PDA斜面保存的人參黑斑病病原真菌活化，接種于9 cm的PDA平板，經(jīng)過分離純化，培養(yǎng)至菌落長滿整個平板。

將從人參葉片中分離得到的內(nèi)生真菌，接種于9 cm的PDA平板，不同的菌株生長速度不同，以每種菌株長滿平板為標準。

試驗組：采用對峙培養(yǎng)方法，9 cm的PDA平板，中心畫十字線，選取十字線中的一條，在距離中心2 cm處各選取一點，其中一點接種上述培養(yǎng)方式培養(yǎng)的人參黑斑病病原真菌，另外一點接種人參葉片內(nèi)生真菌。接種的人參黑斑病病原真菌和人參葉片內(nèi)生真菌均為用7 mm打孔器打孔得到的菌餅，帶菌面朝向PDA培養(yǎng)基接種。每種拮抗菌設置3個重復。每天觀察、測量人參黑斑病病原真菌生長半徑，直至對照組黑斑病病原菌長滿整個平板為止，根據(jù)抑菌率計算公式，計算抑菌率。抑菌率=((對照菌絲半徑-處理菌絲半徑)/(對照菌絲半徑-菌餅半徑))×100%。

對照組：只接種人參黑斑病病原真菌，設置3個重復，每天觀察、測量生長半徑，繪制對照組與試驗組中黑斑病病原菌的生長曲線。

每個試驗組和對照組所選的黑斑病病原真菌菌餅均為同質(zhì)同量，選取位置為長滿平板的黑斑病病原真菌菌落的邊緣。培養(yǎng)條件均為28 ℃，恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，分為初篩和復篩兩部分。

數(shù)據(jù)處理：通過Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，處理方法兩組間比較采用獨立樣本t檢驗法，設定P<0.05為顯著性水平，P<0.01為極顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的拮抗作用

經(jīng)抑菌試驗，由表1抑菌率可知，AXY②、AY10-1①、Ab2.2①、As②、As①這5種內(nèi)生真菌對黑斑病有較強的抑菌作用，其中，AXY②、AY10-1①、Ab2.2①內(nèi)生真菌的抑菌率達到70%以上，AXY②的抑菌率最高，為77.5%。As②、As①為毛殼屬真菌，該屬真菌，目前應用于生物防治研究上較為廣泛，有較高的生物防治研究價值和潛力。

表1 人參葉片內(nèi)生真菌對人參黑斑病病原真菌的拮抗作用(n=3，拮抗試驗第7天)

內(nèi)生真菌黑斑病病原真菌半徑/cm抑菌率/%Ab2.2①0.9770.9aAY10-1①0.8775.6bBY③1.2355.7cAY①2.0122.1dAXY②0.8377.5eB1.1①1.4349.3fB1.1②1.5444.1gB1.1③1.3354.0hB3.2①1.6041.3iAs①1.3056.4jAs②1.1562.4k對照組2.48

注：抑菌率中同列數(shù)據(jù)后字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 高抑菌率拮抗菌對黑斑病病原真菌生長的影響

由表1篩選出AXY②、AY10-1①、Ab2.2①、As②、As①，這5株拮抗效果較好的內(nèi)生真菌，進一步的對峙培養(yǎng)表明，這5株內(nèi)生真菌對黑病菌病原真菌有較好的抑制作用。其中Ab2.2①、AY10-1①、AXY②對黑斑病病原真菌的拮抗作用相當，無明顯差異，AY10-1①和AXY②的病原菌生長曲線幾乎重合。Ab2.2①、AY10-1①、AXY②三者的拮抗作用強于As①、As②。

2.2.1 內(nèi)生真菌Ab2.2①

黑斑病菌落起初的生長呈緩慢的上升趨勢，從第6天開始上升趨勢增高，到第8天菌落停止生長，呈平臺期。第8天時，Ab2.2①和黑斑病原菌菌落邊緣開始接觸，導致黑斑病病原菌停止生長，而Ab2.2①繼續(xù)生長，分布在黑斑病病原菌的菌落表面上，猜想其拮抗機制，在生長初期是Ab2.2①真菌本身分泌的拮抗物質(zhì)致使黑斑病的生長受到抑制，中期拮抗能力減弱，后期(生長平臺期)是由于真菌本身的拮抗物質(zhì)以及真菌對于病原菌的重寄生作用同時作用，產(chǎn)生拮抗作用。同時黑斑病病原真菌對于Ab2.2①的生長也有一定的拮抗作用，試驗組的Ab2.2①的生長速度低于Ab2.2①本身生長速度，且試驗組中Ab2.2①的拮抗面的菌落逐漸變薄，菌絲生長受到抑制變性。

2.2.2 內(nèi)生真菌AY10-1①

試驗組中黑斑病菌落生長初期在0～3 d緩慢增長，4～6 d處于平臺期，在第7天以后，菌落生長速度變快，生長曲線呈上升趨勢。試驗組中病原菌和拮抗菌菌落在生長過程中，二者之間一直存在一定的寬度，在二者停止生長時，此寬度為0.8 cm，猜想AY10-1①其拮抗機制為真菌本身產(chǎn)生的活性物質(zhì)，對于黑斑病的生長產(chǎn)生抑制作用。同時黑斑病病原真菌對于AY10-1①的生長也有較強的抑菌作用，二者屬于相互競爭、相互拮抗的關系。

2.2.3 內(nèi)生真菌AXY②

試驗組中黑斑病菌落生長整體呈上升趨勢，與AY10-1①的生長趨勢相似，曲線幾乎重合，拮抗作用相當，其平臺期在第6～7天，起穩(wěn)定抑菌作用的時間相對于AY10-1①較晚，持續(xù)時間較其短暫，且在第8天以后菌落生長呈明顯的上升趨勢，抑制作用減弱。但試驗組中黑斑病對于AXY②的抑制作用低于對AY10-1①的作用，AXY②與黑斑病的接觸面，菌絲生長的抑制不明顯，菌絲未見明顯的萎縮和變性。拮抗機制可能為真菌本身產(chǎn)生的活性物質(zhì)以及與病原菌的空間競爭的共同作用。

2.2.4 內(nèi)生真菌As①

生長初期，病原菌呈緩慢上升趨勢，但生長速度高于Ab2.2①、AY10-1①、AXY②，略高于As②，在第5天以后，生長趨勢處于平臺期，病原菌停止生長，As①與黑斑病病原真菌的接觸面，菌絲萎蔫，生長速度變得緩慢，且拮抗面周圍的培養(yǎng)基顏色由暗黃色變?yōu)辄S綠色，在后期覆蓋黑斑病病原真菌表面生長，猜想其拮抗機制為As①與黑斑病病原真菌的空間競爭以及重寄生的共同作用。

2.2.5 內(nèi)生真菌As②

黑斑病病原真菌的生長趨勢與As①相同，但較As①的拮抗作用強，有明顯的差異。試驗組，黑斑病病原菌生長初期，菌落生長緩慢增長，在第4天以后，一直處于平臺期，黑斑病病原真菌停止生長。黑斑病病原真菌對于As②的生長速度幾乎無影響，As②與黑斑病病原真菌接觸后依然繼續(xù)生長，而后覆蓋黑斑病病原真菌的表面。猜想其拮抗機制為空間競爭和重寄生的協(xié)同作用。

表2 人參黑斑病病原菌生長半徑(n=3) cm

3 結(jié)論

在18株內(nèi)生真菌與人參黑斑病病原真菌的拮抗試驗中，共篩選出5株抑菌率在54%以上的拮抗菌株，其中AXY②、AY10-1①、Ab2.2①的抑菌率在70%以上，AXY②的抑菌率最高，為77.5%，毛殼屬真菌As①、As②的抑菌率分別為56.4%、62.4%。

5種內(nèi)生真菌AXY②、AY10-1①、Ab2.2①、As②、As①與人參黑斑病病原真菌的拮抗試驗中，由黑斑病病原真菌的生長曲線可以看出，對照組的黑斑病病原真菌生長速度明顯高于試驗組的生長速度，表明這5種內(nèi)生真菌對黑斑病病原真菌有著明顯的拮抗作用，可用于生物防治菌株的研發(fā)。

[1] 王崇仁,吳友三,卜增山,等.人參黑斑病的研究I:損失調(diào)查、病原菌及發(fā)病規(guī)律[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,1986,17(3):11-21.

[2] 李勇,趙東岳,丁萬隆,等.人參內(nèi)生細菌的分離及拮抗菌株的篩選[J].中國中藥雜志,2012,37(11):1532-1535.

[3] 賈斌,趙貞麗,沈國娟,等.人參黑斑病生防用內(nèi)生拮抗菌分離鑒定及發(fā)酵濃縮液的性質(zhì)[J].中國森林病蟲，2014,33(3):5-10,17.

[4] 李鵬翔.中藥提取物及微生物發(fā)酵提取物對人參病害抑菌效果的研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學,2012:13-15.

[5] 強薇,郭帥,張愛華,等.人參根際土壤中拮抗人參病害微生物的篩選[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報,2014,35(5):76-81.

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[7] 吳長寶,回云靜,徐小明,等.枯草芽孢桿菌生物菌劑對人參病原菌室內(nèi)抑菌實驗研究[J].人參研究,2010(4):11-13.

Screening Biocontrol Fungi against Ginseng Black Spot Pathogen//

Zhang Leiming; Xu Jiao, Liu Zhenpeng, Ren Weichao, Ma Wei

(Bei’an First People’s Hospital, Bei’an 164000, P. R. China)(Heilongjiang University of Chinese Medicine)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(11)：89-91.

Ginseng; Endophytic fungi; Biological control; Ginseng black spot; Ginseng disease

張雷鳴，女，1988年2月生，北安市第一人民醫(yī)院藥局，助理藥師。E-mail:229628771@qq.com。

馬偉，黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，教授。E-mail:88788891@qq.com。

2016年4月12日。

S476+.1

1)2013年度農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項人參產(chǎn)業(yè)技術研究與示范項目(201303111-04)。

責任編輯：程 紅。