劉振鵬 徐姣 張開雪 閆嵩 任偉超 馬偉 劉秀波

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

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膜莢黃芪多糖外源因素誘導(dǎo)組合的篩選1)

劉振鵬 徐姣 張開雪 閆嵩 任偉超 馬偉 劉秀波

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

利用正交試驗設(shè)計，以膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.))生物活性物質(zhì)——黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為衡量指標(biāo)，篩選出最佳外界誘導(dǎo)因素組合。結(jié)果表明：影響葉、莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳處理時間是9 d和6 d；影響根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳處理時間是6 d。影響葉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳處理組合是培養(yǎng)基處理地下部位9 d，影響莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳處理組合是硝酸銀處理地下部位9 d，影響根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳處理組合是培養(yǎng)基處理地上部位6 d。黃芪多糖代謝途徑的最佳外源誘導(dǎo)因素是硝酸銀溶液，最佳處理部位是地下部分，最佳處理時間是6～9 d，最佳多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化檢測部位是黃芪根部。

外源誘導(dǎo)；黃芪多糖；生物活性物質(zhì)；正交試驗

We studied the content ofAstragaluspolysaccharides inAstragalusbioactivator induced by external stimuli and screening out the best combination of stimulating factors. By using the orthogonal experiment design, the content ofAstragaluspolysaccharide was measured for measurable indicator, screening for regulation elicitor ofAstragaluspolysaccharide for secondary metabolism pathways. The best treatment times for leaves and stems were 9 and 6 d, respectively, and the best treatment time for roots was 6 d. The best combination of the treatment for leaf polysaccharide was A2B4C2; the best combination of the treatment for stem polysaccharide was A4B4C2; the best combination of the treatment for root polysaccharide was A2B3C1. The silver nitrate solution was the best elicitor of polysaccharide secondary metabolic pathways, the best processing part was the underground part, the best time for treatment was 6-9 d, and the best detection part was root.

黃芪作為一種重要的中藥，在古代常被用于益氣固表，補氣養(yǎng)血，降血壓。在現(xiàn)代藥理學(xué)中人們發(fā)現(xiàn)：黃芪多糖(APS)對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、物質(zhì)代謝系統(tǒng)，以及保肝、護腎、抗病毒、抗腫瘤等方面具有廣泛影響[1-3]。通過現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)，人們發(fā)現(xiàn)在黃芪中的主要藥效學(xué)物質(zhì)為次生代謝產(chǎn)物多糖類、黃酮類和皂苷類[4]。在長期進化中，植物響應(yīng)環(huán)境刺激，以初生代謝產(chǎn)物為底物，衍生出許多次生產(chǎn)物[5]。本研究根據(jù)外界刺激因素對黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的誘導(dǎo)結(jié)果，篩選出最佳誘導(dǎo)因素組合，為多糖代謝途徑的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)馬偉研究員課題組提供膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.)種子。該種子在日光溫室內(nèi)進行無土栽培，出苗培養(yǎng)35 d，長出7片真葉，幼苗高約15 cm。全株采樣，在105 ℃、0.5 h烘干殺青，然后再用80 ℃烘干至相對恒定質(zhì)量，以1 600 r·min-1速度球磨機對樣品研磨20 min，粉末用于成分提取。利用722型分光光度計檢測黃芪生物活性物質(zhì)黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2 研究方法

1.2.1 正交追加試驗設(shè)計

利用SPASS軟件進行L24(6×4×23)不等水平正交追加試驗設(shè)計與Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析。試驗分三因素不等水平：A(刺激因素)包括7水平，分別為水，培養(yǎng)基溶液(OD600=0.007)，0.1% tween溶液，AgNO3、MeJA、SA溶液(30 μmmol·L-1)，內(nèi)生菌發(fā)酵液(OD600=0.023)；B(誘導(dǎo)時間/d)分為0、3、6、9、12 d，共5個水平；C(處理部位)分為地上部分、地下部分2水平。處理后對各試驗處理的黃芪植株根、莖、葉的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行測定。

1.2.2 多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

多糖提?。? g樣品，20倍體積的70%乙醇室溫浸提10 h，超聲提取0.5 h，12 000 r·min-1離心20 min，分離后，將藥渣用20倍體積水80 ℃水浴提取2 h，離心20 min，丟棄藥渣，將提取液在4倍體積乙醇4 ℃下，冷藏1 h，離心20 min，將沉淀用適量體積的水溶解，離心5 min，取上清液，此時即為多糖溶液[6-7]。

對照品溶液的制備：精密稱取對照品葡萄糖1 mg，置于10 mL容量瓶中，加水溶解，并定容到刻度，搖勻即得[6-7]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：用移液器精密量取對照品溶液0、0.015、0.030、0.045、0.060、0.075 mL，分別置1.5 mL離心管中，分別準(zhǔn)確加水至0.075 mL，再分別加入2%蒽酮乙酸乙酯溶液0.075 mL，置冰浴中緩緩加入硫酸溶液0.75 mL，搖勻后置沸水浴中保溫1 min，取出后立即冰浴冷卻至室溫，在630 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=26.976X+0.031 2，R2=0.999 6[6-7]。

樣品多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定：用移液器精密量取樣品0.075 mL，按照測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法操作，顯色穩(wěn)定后，12 000 r·min-1離心5 min后上機測定吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)因素對黃芪各生長部位多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.1 極差分析結(jié)果

正交試驗中各處理組合黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。對表1數(shù)據(jù)進行極差分析，結(jié)果表明，誘導(dǎo)葉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的最佳組合是A2B4C2，誘導(dǎo)莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的最佳組合是A4B4C2，誘導(dǎo)根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的最佳組合是A2B3C1。各因素的主效作用順序是B>A>C(表2)。

2.1.2 方差分析結(jié)果

由表3可以看出，誘導(dǎo)因子種類、處理時間對黃芪根、莖、葉部位的黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響極顯著；處理部位對黃芪莖和葉部位多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響不顯著，而對黃芪根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響達到了極顯著水平，地下部位處理的根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著地高于地上部位處理。

2.2 外源刺激因素的多重比較

將各外源刺激因素對黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的數(shù)據(jù)結(jié)果做進一步的單因素多重比較，各因素比較結(jié)果見表4。培養(yǎng)基溶液處理的葉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于內(nèi)生菌液、水、水楊酸、茉莉酸甲酯、吐溫溶液處理；硝酸銀溶液處理的葉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于水楊酸、茉莉酸甲酯、吐溫處理，硝酸銀、內(nèi)生菌發(fā)酵液(內(nèi)生菌發(fā)酵液一般會刺激次級代謝產(chǎn)物的生成，調(diào)控藥用植物活性成分的生物合成[8-10])和水溶液處理水平之間葉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著。誘導(dǎo)子硝酸銀溶液處理的莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于內(nèi)生菌發(fā)酵液、水楊酸、培養(yǎng)基、茉莉酸甲酯溶液處理；水溶液處理的莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于培養(yǎng)基、茉莉酸甲酯溶液處理；吐溫、內(nèi)生菌發(fā)酵液、水楊酸溶液處理的莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于茉莉酸甲酯溶液處理。培養(yǎng)基、水楊酸、內(nèi)生菌發(fā)酵液、茉莉酸甲酯、硝酸銀溶液處理的根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于吐溫、水溶液處理，培養(yǎng)基、水楊酸、內(nèi)生菌發(fā)酵液、茉莉酸甲酯、硝酸銀溶液處理的根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著；吐溫溶液處理的根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于水溶液處理。

表1 L24(6×4×23)不等水平正交追加試驗結(jié)果

mg·kg-1

表2 誘導(dǎo)因素水平對黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的極差分析結(jié)果 mg·kg-1

表3 誘導(dǎo)因素水平對黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的方差分析結(jié)果

注：a為R2=0.631(調(diào)整R2=0.606)；b為R2=0.862(調(diào)整R2=0.852)；c為R2=0.844(調(diào)整R2=0.833)。

表4 A因素各水平多重比較

注：葉中誤差項為均方值(錯誤)=0.789。莖中誤差項為均方值(錯誤)=0.570；根中誤差項為均方值(錯誤)=1.184。表中同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

綜上，從外源因素對黃芪中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響的多重比較結(jié)果來看，培養(yǎng)基溶液處理水平可使根和葉部位的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高，而硝酸銀溶液處理水平可使莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高。從整體來看，硝酸銀和培養(yǎng)基溶液是較優(yōu)的處理水平。

2.3 時間因素的多重比較

將各時間因素對黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的數(shù)據(jù)結(jié)果做進一步的單因素多重比較，結(jié)果見表5。從表5可以看出：時間因素中的6、9 d處理水平對黃芪葉和莖中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響顯著高于12、3、0 d處理水平下的黃芪葉和莖多糖；12 d的處理水平下的黃芪葉和莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于3、0 d處理水平；3 d的處理水平下的黃芪葉和莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于0 d的處理水平，時間處理因素對葉和莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的多重比較結(jié)果是一致的。時間因素中的6 d處理水平對黃芪根中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響顯著高于12、9、3、0 d處理水平；12、9 d的處理水平下的黃芪根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于3、0 d處理水平；3 d的處理水平下的黃芪根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于0 d的處理水平。

表5 B因素各水平多重比較

注：葉中誤差項為均方值(錯誤)=0.789；莖中誤差項為均方值(錯誤)=0.570；根中誤差項為均方值(錯誤)=1.184。表中同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

綜上，從時間因素對黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的多重比較結(jié)果來看，影響葉、莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳處理水平是9 d和6 d；影響根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳處理水平是6 d。從整體來看，時間因素對黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的最佳處理水平是6～9 d。

3 結(jié)論

從各誘導(dǎo)因素對黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的直觀分析和方差分析結(jié)果來看，影響葉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳處理組合是A2B4C2，即培養(yǎng)基溶液進行地下部位處理9 d的處理組合；影響莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳處理組合是A4B4C2，也就是硝酸銀溶液進行地下部位處理9 d的處理組合；影響根多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳處理組合是A2B3C1，也就是溶液進行地上部位處理6 d的處理組合。

[1] 韓燕.中藥黃芪的研究概況[J].中醫(yī)學(xué)報,2003,18(6):86-88.

[2] 張小梅.黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及抗腫瘤作用研究進展[J].大連大學(xué)學(xué)報,2003,24(6):101-104.

[3] 杭霏,顧翔,征錦,等.8層螺旋CT冠狀動脈成像的價值[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2007,11(7):61-63.

[4] ZHAO J, ZHU W H, HU Q. Enhanced catharanthine production in catharanthus roseus cell cultures by combined elicitor treatment in shake flasks and bioreactors[J]. Enzyme & Microbial Technology,2001,28(7/8):673-681.

[5] 王春麗,梁宗鎖.外源刺激對植物次生代謝的調(diào)節(jié)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究進展[J].西北植物學(xué)報,2009,29(5):1055-1065.

[6] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2000:196-197.

[7] 王佳佳.玉屏風(fēng)多糖提取和成分分析及對實驗性肝纖維化預(yù)防作用及機制研究[D].合肥:安徽醫(yī)科大學(xué),2010:28.

[8] 譚燕,賈茹,陶金華,等.內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子調(diào)控藥用植物活性成分的生物合成[J].中草藥,2013,44(14):2004-2008.

[9] 周鳳,張弘弛,劉瑞,等.恒山黃芪內(nèi)生真菌分離鑒定及抗菌活性的研究[J].食品科技,2012(1):22-25,28.

[10] 孫月,王琦.膜莢黃芪內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物鑒定及抑菌活性[J].菌物研究,2006,4(3):47-51.

Content of Bioactivator ofAstragalusBy Exogenous Factors//

Liu Zhenpeng, Xu Jiao, Zhang Kaixue, Yan Song, Ren Weichao, Ma Wei, Liu Xiubo

(Heilongjiang University of Chinese Medicine. Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(11)：78-80，88.

Exogenous stimulus;Astragaluspolysaccharide; Bioactivator; Orthogonal experiment

1)黑龍江省杰出青年基金(JC201101)；國家自然科學(xué)基金(81274010)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃”(2012001)；哈爾濱市優(yōu)秀學(xué)科帶頭人基金(2014RFXXJ122)。

劉振鵬，男，1992年1月生，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，碩士研究生。E-mail：2297527225@qq.com。

劉秀波，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，副教授。E-mail：358270831@qq.com。

2016年4月12日。

Q946.8；R282

責(zé)任編輯：程 紅。