王玉，李遠(yuǎn)輝，王佳，王歡，吳瑩，李 希，2

·炮制制劑·

Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取黃芪甲苷工藝研究

王玉1，李遠(yuǎn)輝1，王佳1，王歡1，吳瑩1，李 希1，2

目的：運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取黃芪甲苷最佳工藝條件。方法：以黃芪甲苷的提取量為考察指標(biāo)，HPLC-ELSD色譜法為含量測(cè)定法，對(duì)乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。結(jié)果：乙醇提取黃芪甲苷最佳工藝條件是乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65%，乙醇用量10 倍量，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)3 次。結(jié)論：采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取黃芪甲苷工藝，穩(wěn)定可行、重現(xiàn)性好。

黃芪甲苷；Box-Behnken響應(yīng)面法；提取工藝

黃芪(Radix Astragali)為豆科植物蒙古黃芪(Astragalus membranaceus (Fisch.)Beg. Var.mongholicus(Beg.)Hsiao)或膜莢黃芪(A.membranceus(Fish)Beg.)的干燥根。味甘，性微溫，具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、斂瘡生肌、補(bǔ)中益氣等功效[1]，是一味常見的扶正中藥[2]。據(jù)目前研究報(bào)道，黃芪主要成分為皂苷、黃酮、多糖等，其中黃芪甲苷是黃芪增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的主要活性成分之一，也是多種黃芪制劑含量檢測(cè)指標(biāo)成分之一[3-6]。

Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，已廣泛用于優(yōu)化中藥有效成分提取工藝[7-8]，此方法與正交設(shè)計(jì)不同，主要通過(guò)多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，能夠準(zhǔn)確表示試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化結(jié)果，準(zhǔn)確度高、可預(yù)測(cè)性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)以黃芪甲苷的提取量為考察指標(biāo)，HPLC-ELSD為含量測(cè)定法，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，對(duì)乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察，目前沒(méi)有類似的研究報(bào)道。

1 儀器與材料

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Alltech2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Agilent公司）；BT125D型分析天平（Sartorius公司）；黃芪甲苷（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110781-200613）；黃芪藥材（四川禾一天然藥業(yè)有限公司），按《中國(guó)藥典》2015年版一部黃芪項(xiàng)下規(guī)定檢測(cè)，均符合要求。甲醇、乙腈為色譜純，所用水為純凈水，本文中所涉及的其他試劑均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的配制

精密移取提取液適量，水浴揮干，殘?jiān)铀?0 ml，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? ml使溶解，放冷，通過(guò)D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm)，以水50 ml洗脫，棄去水液，再用體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇30 ml洗脫，棄去洗脫液，繼用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 色譜條件及專屬性考察

安捷倫C18色譜柱（4.6×250 mm,5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（32∶68，v/v），漂移管溫度100 ℃，氣體流速為2.6 L．min-1，柱溫30 ℃，流速為1 mL．min-1，進(jìn)樣量10 μL，理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。分別取對(duì)照品溶液、空白溶劑、供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，HPLC圖如下圖1。峰型良好，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精密移取不同濃度對(duì)照品溶液（0.998,2.001 ,2.999,4.002,4.998,7.005,10.006 mg/mL）各10 μL，以對(duì)照品峰面積積分值自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，得回歸方程：Y=1.199 0X+6.253 8，(r=0.999 3，n=7)，表明黃芪甲苷濃度在0.998～10.006 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取以上對(duì)照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5 次，RSD=1.37%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密移取黃芪提取液5 份，每份20 mL，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，并按上述色譜條件測(cè)定，RSD=0.91%(n=5)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密移取上述已知含量的黃芪提取液9 份，每份20 mL，分別按高、中、低濃度精密加入對(duì)照品溶液，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下處理，并按上述色譜條件測(cè)定，平均回收率=100.1%，RSD=1.21%。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.8 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.8.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在查閱文獻(xiàn)[9-11]的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度（X1）、乙醇用量（X2）、提取時(shí)間（X3）、提取次數(shù)（X4）為考察因素，因素水平表見表1，以黃芪甲苷提取量（Y）為指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2，使用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Exoert8.0.6，對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程模型：Y=11.408-5X1+0.069X2+0.064X3+0.27 X4+0.014X1X2-3X1X3+0.085X1X4+0.024X2X3-0.012X2X4+0.029X3X4-0.19X12+0.02X22-3X32 -0.11X42（r=0.9921，P＜0.01）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見表3。

表1 因素與水平

表2 黃芪甲苷提取工藝Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

?

表3 回歸方程方差分析

由表3可知，F(xiàn)=6.44，此模型P＜0.000 1，表明響應(yīng)面回歸模型具有極顯著性；多元相關(guān)系數(shù)r=0.992 1，表明二次多元方程擬合度良好?？捎糜趦?yōu)化乙醇提取黃芪甲苷工藝。

2.8.2 響應(yīng)面分析 應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件繪制乙醇濃度、乙醇用量，提取時(shí)間、提取次數(shù)的響應(yīng)面圖，如下圖2，圖3所示。乙醇體積分?jǐn)?shù)為約65%，乙醇用量約為原藥材10 倍量時(shí)，黃芪甲苷提取量有最大值；提取時(shí)間約為2 h，提取次數(shù)為3 次時(shí)黃芪甲苷提取量有極大值。

圖2

圖3

2.8.3 工藝優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn) 應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件優(yōu)化提取工藝，得最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)65.57%，乙醇用量9.88 倍，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)3 次，黃芪甲苷提取量可達(dá)到1.590 4 mg/g，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，優(yōu)化工藝參數(shù)乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，乙醇用量10 倍量，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)3 次。按以上優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果黃芪甲苷提取量分別為1.580 5，1.590 0，1.588 4 mg/g，平均值為1.586 3 mg/g。與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差小于5%，驗(yàn)證值與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合較好，說(shuō)明該模型有良好的預(yù)測(cè)性。

3 討論

現(xiàn)代研究表明，黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，降低血糖、保護(hù)組織器官、抗炎抗病毒、抗細(xì)胞凋亡等多方面藥理作用。目前，工藝優(yōu)化應(yīng)用最普遍的是正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)，但精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性差，因此，本研究采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法，在因素與響應(yīng)值之間建立非線性模型，從眾多影響因素中篩選出顯著影響因素，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析比較，優(yōu)化得到最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，乙醇用量10 倍量，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)3 次，在此條件下黃芪甲苷的提取量為1.590 4 mg/ g，精確度高，可預(yù)測(cè)性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。本研究采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，為工業(yè)化大生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：傅舒）

Study on extraction technology of Astragaloside A with ethanol using Box-Behnken design-response surface methodology

WANG Yu1, LI Yuan-hui1, WANG Jia1, WANG Huan1, WU Ying1, LI Xi1,2//(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan; 2.Institute of TCM, Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine sciences, Chengdu 611137 Sichuan )

Objective: To optimize the extraction conditions of Astragaloside A with ethanol using Box-Behnken designresponse surface methodology. Method: Astragaloside A content was detected by HPLC-ELSD method. With Astragaloside A extraction amount as index, ethanol concentration, ethanol volume, extraction time, and extraction times were investigated using Box-Behnken design-response surface method to optimize the extraction process. Result: The optimum conditions for ethanol extract of Astragaloside A was 65% ethanol, 10 volume ethanol, extraction time 2h, extracted 3 times. Conclusion: The extraction technology of Astragaloside A with ethanol optimized using Box-Behnken design-response surface methodology is stable, feasible and reproducible.

Astragaloside A; Box-Behnken response surface methodology; extraction technology

R283.3

A

1674-926X(2016)04-003-03

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

2. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，四川 成都 610031

王玉，在讀研究生，從事中藥新藥、新技術(shù)、新工藝、新劑型的研究工作

Tel:18382284431 Email:272429134@qq.com

李希，碩士，教授，從事中藥新藥、新技術(shù)、新工藝、新劑型的研究工作

Tel:18030897734 Email:1836820767@qq.com.

2015-09-18