熊 宏 ，陳海濤 ，宋 健 ，趙 平 ，劉小燭 ，丁 勇

（西南林業(yè)大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因VdGAPDH1的cDNA克隆與序列分析

熊 宏a，陳海濤a，宋 健a，趙 平b，劉小燭a，丁 勇b

（西南林業(yè)大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析和RT-PCR技術(shù)首次從樟葉越桔Vaccinium dunalianum中克隆了全長(zhǎng)1 570 bp的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因VdGAPDH1，其完整的開放閱讀框推測(cè)編碼由337個(gè)氨基酸殘基組成的VdGAPDH1。VdGAPDH1理論相對(duì)分子量為36.57 kD，等電點(diǎn)為7.06，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為42個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為42個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為23.27，屬穩(wěn)定性蛋白質(zhì)；其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由隨機(jī)卷曲、延伸鏈、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角等構(gòu)件組成。VdGAPDH1為無信號(hào)肽、無跨膜結(jié)構(gòu)的親水性蛋白質(zhì)，推測(cè)其為NAD+-GAPDH的新成員，與已知細(xì)胞質(zhì)型GAPDH之間存在高度保守性。VdGAPDH1包含2個(gè)保守超家族結(jié)構(gòu)域Gp_dh_N和Gp_dh_C，Gp_dh_N為輔酶NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Gp_dh_C是行使糖運(yùn)輸和代謝的催化功能域。推測(cè)VdGAPDH1基因產(chǎn)物在樟葉越桔細(xì)胞質(zhì)中參與糖酵解過程。該研究為后期VdGAPDH1基因的生理功能及其表達(dá)調(diào)控等研究奠定了基礎(chǔ)。

樟葉越桔；甘油醛-3-磷酸脫氫酶；基因克隆；糖酵解

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是生命活動(dòng)中糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)過程中的一種關(guān)鍵酶，是維持生命活動(dòng)能量形成的最基本酶之一[1-4]。在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的糖酵解過程，GAPDH的作用是催化3-磷酸甘油醛氧化磷酸化形成1, 3-二磷酸甘油酸，從而產(chǎn)生糖酵解過程中的第一個(gè)ATP[5]。普遍認(rèn)為GAPDH幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，且通常在同種組織或細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)恒定，因此其常被用作研究其他基因和蛋白表達(dá)的內(nèi)參照[6]。目前研究推測(cè)GAPDH是一種多功能酶，除參與能量代謝外，在動(dòng)物中還參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能，如DNA修復(fù)、核RNA的輸出、維持端粒結(jié)構(gòu)、膜融合和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)平衡和加速微管蛋白成束等[7-12]，以及在植物逆境脅迫下發(fā)揮重要作用[13-16]。

樟葉越桔Vaccinium dunalianumWight為杜鵑花科Ericaceae越桔屬Vaccinium常綠灌木或小喬木，該植物具有多方面的生理活性，植株全株可做藥用，有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)等功效[17]。Zhao等[18]研究發(fā)現(xiàn)云南省武定縣野生樟葉越桔是一種富含皮膚美白天然活性劑原料熊果苷（arbutin）及其衍生物的特殊資源植物，暗示樟葉越桔具有極大的研究和應(yīng)用價(jià)值。隨后，有關(guān)樟葉越桔的系統(tǒng)進(jìn)化[19]、化學(xué)成分[20-21]、核酸提取[22]、組織培養(yǎng)[23]、重要功能基因克隆[24-25]等方面的研究相繼被報(bào)道，但目前尚未見有關(guān)于樟葉越桔GAPDH基因方面的研究報(bào)道。本研究根據(jù)前期樟葉越桔葉芽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)拼接得到的GAPDH基因cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性引物，結(jié)合RT-PCR技術(shù)克隆了樟葉越桔VdGAPDH1基因全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其編碼產(chǎn)物VdGAPDH1蛋白特性進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為樟葉越桔葉芽，采自云南省楚雄州武定縣高橋鎮(zhèn)唐家村（海拔高度為2 100 m，位于 25°57′N、102°24′E），原植物標(biāo)本存放于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館，由劉恩德博士鑒定。取樟葉越桔新鮮葉芽置于液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后于-80℃冰箱中保存，供提取總RNA用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

植物總RNA提取試劑盒購(gòu)于OMEGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD19-T載體和大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于寶生物工程有限公司，DNA膠回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司，其他相關(guān)試劑均購(gòu)于昆明滇工科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取與檢測(cè)

參照朱東陽(yáng)等[22]方法提取樟葉越桔葉芽總RNA，分別用紫外分光光度計(jì)法和1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)總RNA樣品的純度和完整性。

1.2.2 樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的cDNA克隆

根據(jù)本課題組前期對(duì)樟葉越桔葉芽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、拼接、分析獲得的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性引物，包括Sense Primer：5'-CAATCGTCGCTTTAGTTCCA-3'和Anti-sense Primer：5'-TAAATGAGTCCGAGCACAGG-3'，引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。第一鏈cDNA合成按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。取反轉(zhuǎn)錄cDNA模板2 μL，SensePrimer和 Anti-sense Primer各 1μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，建立 25 μL的PCR反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)、回收、T/A克隆與測(cè)序

PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，回收目的片段并連接到pMD19-T載體上，將重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化復(fù)蘇后的菌液涂布在含有Amp、IPTG和X-Gal的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后隨機(jī)篩選白色菌落，將陽(yáng)性克隆菌液送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用NCBI的Blast工具對(duì)核酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相似性比對(duì)，使用ORF Finder工具分析基因mRNA的開放閱讀框；參照已知文獻(xiàn)[24-25]報(bào)道的生物信息學(xué)方法分析蛋白理論分子量、等電點(diǎn)、氨基酸含量和穩(wěn)定性，比對(duì)同源蛋白質(zhì)序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并對(duì)蛋白質(zhì)親水/疏水性特性、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽及功能域進(jìn)行預(yù)測(cè)；目的蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)參照丁勇等[26]應(yīng)用的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟葉越桔葉芽總RNA提取與檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)獲得的樟葉越桔葉芽總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（見圖1）顯示28S、18S和5.8S rRNA條帶清晰，點(diǎn)樣孔無亮斑，無彌散拖尾，28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA的2倍，說明總RNA完整性好且無污染；總RNA的A260/A280值為2.03，說明純度好且無蛋白質(zhì)、多糖和酚類物質(zhì)等雜質(zhì)污染。表明本實(shí)驗(yàn)提取獲得的總RNA能滿足后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 樟葉越桔葉芽總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖像Fig.1 Agrose gel electrophoresis analysis of the total RNA from Vaccinium dunalianumbuds

2.2 樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的cDNA克隆

以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，利用前述引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳圖（見圖2）顯示PCR產(chǎn)物條帶單一，該特異性PCR產(chǎn)物條帶經(jīng)膠回收和TA克隆測(cè)序，得到樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的cDNA，序列長(zhǎng)1 570 bp，與前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序拼接結(jié)果一致，命名為VdGAPDH1。應(yīng)用NCBI中的BlastN同源性比對(duì)分析結(jié)果顯示，樟葉越桔VdGAPDH1基因與 田 七Panax notoginseng（KF815711.1）、人 參Panax ginseng（KF699323.1） 的GAPDH基因的相似性為85%，與大豆Glycine max（NM_001250615.1）、 楊 樹Populus（XM_002298558.2）、 棉 花Gossypium hirsutum（FJ415206.1）、川桑Morus notabilis（XM_010106872.1）、豌豆Pea（L07500.1）、煙草Nicotiana tabacum（AJ133422.1）、可可Theobroma cacao（XM_007037842.1） 和 菜 豆Phaseolus vulgaris（KF033722.1）等的GAPDH基因的相似性為84%，表明該實(shí)驗(yàn)成功獲得樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的cDNA序列。

圖2 樟葉越桔VdGAPDH1基因RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖像Fig.2 Agrose gel electrophoresis analysis of RT-PCR product of VdGAPDH1 gene

2.3 序列分析

NCBI的ORF Finder工具分析結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)克隆的VdGAPDH1基因cDNA序列在50～1 063 bp區(qū)為完整的ORF區(qū)域，1～49 bp區(qū)屬于5'非編碼區(qū)，1 064～1 570 bp區(qū)屬于3'非編碼區(qū)。推測(cè)克隆的VdGAPDH1基因編碼由337個(gè)氨基酸殘基組成的樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（VdGAPDH1），蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，VdGAPDH1分別含負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）和正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)各42個(gè)，等電點(diǎn)pI值預(yù)測(cè)為7.06，理論相對(duì)分子量為36.57 kD，不穩(wěn)定系數(shù)為23.27，推測(cè)VdGAPDH1屬于穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。圖3顯示了VdGAPDH1基因ORF的核苷酸序列及其推導(dǎo)的VdGAPDH1蛋白的氨基酸序列。

蛋白質(zhì)同源性分析結(jié)果（見圖4）顯示VdGAPDH1與巨桉Eucalyptus grandis（EgGAPDH，XP_010026741.1）、 荷 花Nelumbo nucifera（NnGAPDH，XP_010248875.1）、 梅 花Prunus persica（PpGAPDH，XP_007222474.1）、芝 麻Sesamum indicum（SiGAPDH，XP_011086733.1）、甜橙Citrus sinensis（CsGAPDH，XP_006484037.1）、 丹 參Salvia miltiorrhiza（SmGAPDH，AGW24628.1）、 蓖 麻Ricinuscommunis（RcGAPDH，XP_002511235.1）、三七Panax notoginseng（PnGAPDH，AIX10772.1）、金 魚 草Antirrhinum majus（AmGAPDH，P25861.1）等的GAPDH相似性都高達(dá)93%以上，與其它許多植物的GAPDH蛋白相似性也高達(dá)90%。用不同物種GAPDH基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（見圖5）顯示VdGAPDH1雖然獨(dú)自處在一個(gè)分支，但是它與比較的其它12個(gè)物種GAPDH的進(jìn)化關(guān)系卻十分近，說明不同物種的GAPDH同源基因在進(jìn)化過程中高度保守。

圖3 VdGAPDH1 ORF核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of VdGAPDH1 ORF

圖4 VdGAPDH1和其他植物GAPDH的氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Alignment of deduced amino acid sequences of VdGAPDH1 and GAPDH gene from other plants

圖5 VdGAPDH1和其他植物GAPDH的進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis of VdGAPDH1 and other plant GAPDH

分泌性蛋白在N-末端存在一段16至26個(gè)氨基酸殘基組成的特殊序列，稱為信號(hào)肽，其具有指導(dǎo)初生蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移及其定位功能，在行使功能后被切除[27]。VdGAPDH1蛋白信號(hào)肽分析結(jié)果（見圖6）顯示其存在信號(hào)肽的可能性值為0.001、信號(hào)錨定的可能性值為0，N-末端氨基酸殘基信號(hào)肽剪切值為0，表明VdGAPDH1蛋白不可能存在信號(hào)肽。結(jié)合蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果，推測(cè)VdGAPDH1為非分泌性的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果能為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)域和功能域的劃分提供參考依據(jù)[24]。親水/疏水性分析結(jié)果（見圖7）顯示VdGAPDH1整個(gè)肽鏈中均勻分布著親水性氨基酸，且在第142～143位氨基酸殘基出出現(xiàn)親水性最強(qiáng)值（-2.322），雖在第330位氨基酸殘基處出現(xiàn)了疏水性最強(qiáng)值（2.278），但VdGAPDH1整個(gè)肽鏈中沒有出現(xiàn)明顯的疏水區(qū)域，表明VdGAPDH1屬于親水性蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果（見圖8）顯示VdGAPDH1也不存在蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域，表明也不存在疏水性結(jié)構(gòu)域，與疏水性分析結(jié)果相符合。提示VdGAPDH1在樟葉越桔中以非分泌性穩(wěn)定性蛋白質(zhì)存在，其在細(xì)胞質(zhì)核糖體中合成后不經(jīng)運(yùn)轉(zhuǎn)且不與細(xì)胞膜結(jié)合而在細(xì)胞質(zhì)中行使功能。

圖6 VdGAPDH1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of VdGAPDH1protein signal peptide

蛋白質(zhì)分子的多肽鏈通常折疊和盤曲成比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，形成比較穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步才能完成活性功能域構(gòu)象的構(gòu)建，形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，最終完成特定的生命活動(dòng)。VdGAPDH1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（見圖9）顯示其由30.27%的隨機(jī)卷曲、29.97%的延伸鏈、26.11%的α-螺旋和13.65%的β-轉(zhuǎn)角等構(gòu)件組成。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析結(jié)果（見圖10）表明VdGAPDH1包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為位于第4～154位氨基酸殘基的Gp_dh_N超家族結(jié)構(gòu)域和位于第159～316位氨基酸殘基處的Gp_dh_C超家族結(jié)構(gòu)域，這符合已知GAPDH的結(jié)構(gòu)和功能特征，其每個(gè)亞基包含兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域。

圖7 VdGAPDH1蛋白質(zhì)疏水性和親水性分析Fig.7 Prediction of VdGAPDH1protein hydrophobicity and hydrophilicity pro fi le

圖8 VdGAPDH1跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of transmembrane region of VdGAPDH1

圖9 VdGAPDH1蛋白氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 The secondary structure of the deduced VdGAPDH1 polypeptide

圖10 VdGAPDH1蛋白保守區(qū)分析Fig.10 Analysis of VdGAPDH1protein conservative region

圖11 樟葉越桔VdGAPDH1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖像Fig.11 3D structure prediction of VdGAPDH1 protein

I-TASSER程序預(yù)測(cè)VdGAPDH1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)圖（見圖11-A）中可以明顯顯示出Gp_dh_N和Gp_dh_C兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，SWISS-MODEL同源建模法構(gòu)建了樟葉越桔高級(jí)結(jié)構(gòu)模型，顯示VdGAPDH1以同源四聚體的形式存在，與水稻Oryza Sativa細(xì)胞質(zhì)型GAPDH同源四聚體模型3e5r.1.A具有85.71%的同源性，與水稻Oryza Sativa細(xì)胞質(zhì)型GAPDH同源四聚體模型3e6a.1.D和3e6a.1.C也同時(shí)具有85.67%的同源性。推測(cè)VdGAPDH1屬于細(xì)胞質(zhì)的NAD+-GAPDH，并類似于水稻細(xì)胞質(zhì)型GAPDH在生物體中以同源四聚體的形式發(fā)揮生物學(xué)功能。

3 討 論

GAPDH存在于所有生物體中，是維持生命活動(dòng)能量形成的最基本酶之一[1-4]。GAPDH的基因和蛋白已在谷子Setaria italica[28]、小麥Triticeae Dumort[29]、 家 蠶Bombyx mori[30]、 球毛殼菌Chaetomium globosum[31]等物種中得到了一定的研究。本研究首次從樟葉越桔中克隆了GAPDH基因長(zhǎng)1 570 bp的cDNA序列，命名為VdGAPDH1。推測(cè)VdGAPDH1在樟葉越桔中編碼由337個(gè)氨基酸殘基組成的36.57 kD的VdGAPDH1。蛋白質(zhì)一致性分析結(jié)果顯示VdGAPDH1與巨桉Eucalyptus grandis、荷花Nelumbo nucifera和梅花Prunus persica等多數(shù)已知植物的GAPDH都具有非常高的相似性，與已知研究觀點(diǎn)相一致[1-4]，表明GAPDH在不同生物中具有高度保守性。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能分析結(jié)果顯示VdGAPDH1的第4～154位氨基酸殘基與Gp_dh_N超家族高度同源，而其第159～316位氨基酸殘基與Gp_dh_C超家族高度同源，表明VdGAPDH1在功能結(jié)構(gòu)上符合已知GAPDH的結(jié)構(gòu)和功能特征，包含2個(gè)保守超家族結(jié)構(gòu)域Gp_dh_N和Gp_dh_C，這兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域在VdGAPDH1蛋白三維結(jié)構(gòu)圖中能清晰顯示出來。推測(cè)VdGAPDH1的Gp_dh_N保守結(jié)構(gòu)域?yàn)檩o酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Gp_dh_C保守結(jié)構(gòu)域?yàn)榇呋Y(jié)構(gòu)域。

目前研究已證實(shí)，GAPDH以兩種不同類型存在高等植物中，一種是NAD+-GAPDH，存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，由4個(gè)相同的GapC亞基組成，特異性結(jié)合NAD+后在糖酵解過程中發(fā)揮作用；另一種是NADP+-GAPDH，存在于細(xì)胞葉綠體中，由GapA和GapB兩個(gè)不同亞基組成，特異性結(jié)合NADP+后在卡爾文循環(huán)中發(fā)揮作用[32,33]。本研究克隆的VdGAPDH1基因推測(cè)編碼由337個(gè)氨基酸殘基組成的VdGAPDH1為無信號(hào)肽、無跨膜結(jié)構(gòu)的親水性蛋白質(zhì)，且與已知細(xì)胞質(zhì)型GAPDH具有非常高的同源性，推測(cè)VdGAPDH1為NAD+-GAPDH的新成員。該推測(cè)同時(shí)符合羅聰?shù)萚34]的研究結(jié)果，認(rèn)為由337～340個(gè)氨基酸殘基組成的GAPDH存在于細(xì)胞質(zhì)中主要參與糖酵解過程。

有研究認(rèn)為GAPDH在同一生物體內(nèi)不同組織中均高量而穩(wěn)定表達(dá)，因此可作為內(nèi)參基因來研究其他功能基因的表達(dá)水平[6]。來自不同植物的GapC基因和蛋白質(zhì)序列高度保守，因此又可作為植物起源與進(jìn)化的分子標(biāo)準(zhǔn)[35]。也有研究認(rèn)為GAPDH是一個(gè)多功能的酶，除參與能量代謝外，在動(dòng)物中還參與DNA修復(fù)、核RNA的輸出、膜融合和轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能[7-12]，以及在植物光合作用和逆境脅迫下發(fā)揮重要作用[13-16,36]，GAPDH基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯水平會(huì)隨著內(nèi)外源誘導(dǎo)因子變化而變化。然而VdGAPDH1基因在樟葉越桔中表達(dá)是否穩(wěn)定、是否可以作為內(nèi)參用于研究其他功能基因的表達(dá)量有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究首次從樟葉越桔中克隆了全長(zhǎng)1 570bp的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因mRNA序列，命名為VdGAPDH1。推測(cè)VdGAPDH1基因在樟葉越桔中編碼由337個(gè)氨基酸殘基組成的36.57 kD的VdGAPDH1。VdGAPDH1為無信號(hào)肽、無跨膜結(jié)構(gòu)、親水性的穩(wěn)定蛋白質(zhì)，且與已知細(xì)胞質(zhì)型GAPDH具有高度同源性，推測(cè)其為NAD+-GAPDH的新成員。VdGAPDH1包含2個(gè)保守超家族結(jié)構(gòu)域Gp_dh_N和Gp_dh_C，Gp_dh_N保守結(jié)構(gòu)域?yàn)檩o酶NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Gp_dh_C保守結(jié)構(gòu)域是行使糖運(yùn)輸和代謝的催化功能域。推測(cè)VdGAPDH1基因產(chǎn)物在樟葉越桔細(xì)胞質(zhì)中參與糖酵解過程。該研究為對(duì)VdGAPDH1基因的生理功能及其表達(dá)調(diào)控等進(jìn)行深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and bioinformatics analysis ofVdGAPDH1gene inVaccinium dunalianum

XIONG Honga, CHEN Hai-taoa, SONG Jiana, ZHAO Pingb, LIU Xiao-zhua, DING Yongb
(a.College of Life Sciences; b.Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China,Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China)

In this study, the geneVdGAPDH1with a full-length cDNA comprised 1570 nucleotides was primordial obtained by transcriptome sequencing and RT-PCR amplification fromV.dunalianum.The open reading frame encoded a putative VdGAPDH1 comprising 337 amino acid residues with molecular weight of 36.57 kD and isoelectric point of 7.06.The total number of positively charged residues (Arg+Lys) was 42, and the total number of negatively charged residues (Asp+Glu) was also 42.VdGAPDH1 with unstable coef fi cient 23.27 belongs to the stable protein.The main parts of predicted secondary structures of VdGAPDH1 were α-helices,random coils and extended strand.It was predictive VdGAPDH1 belongs to hydrophilic protein without any signal peptide and transmembrane structure.VdGAPDH1 was considered to be a new number of NAD+-GAPDH super family proteins.VdGAPDH1 shares with highly conservation in sequences with cytoplasmic GAPDH in many plants.There are two conserved super family structures,named as Gp_dh_N and Gp_dh_C in the structure of VdGAPDH1 protein.Homology modeling of the GAPDH inB.gymnorrhizabased on the 3D structure of the one in Spinaciaoleracea con fi rmed that the polypeptides between 70th to 405th amino acids was highly conserved.Plays a very important role in sugar metabolism and energy metabolism.TheVdGAPDH1gene product consists of two super family structures Gp_dh_N with function combining and Gp_dh_C, This work also suggested that VdGAPDH1 involve in process of glycolysis in the cytoplasm inV.dunalianum.The study results established the foundation for the expression, regulation and functional analysis ofVdGAPDH1.

Vaccinium dunalianum; GAPDH; gene cloning; glycolysis

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.07.004

http: //qks.csuft.edu.cn

S718.46

A

1673-923X(2016)07-0017-08

2015-10-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21462040, 31460076）；云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（50097505）

熊 宏，碩士研究生

丁 勇，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士生導(dǎo)師；E-mail：dingyong@swfu.edu.cn

熊 宏，陳海濤，宋 健，等.樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因VdGAPDH1的cDNA克隆與序列分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2016, 36(7): 17-24, 30.

[本文編校：吳 毅]