周 洲，李永麗，安世恒，胡建軍

（1.河南科技大學(xué) 林學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植保學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所，北京 100091）

歐美楊108高效組培再生系統(tǒng)

周 洲1，李永麗1，安世恒2，胡建軍3

（1.河南科技大學(xué) 林學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植保學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所，北京 100091）

歐美楊108生產(chǎn)性狀優(yōu)良，是基因工程轉(zhuǎn)化的理想受體，高效的組培再生系統(tǒng)是轉(zhuǎn)化工作的基礎(chǔ)。以歐美楊108莖段、葉柄、葉片3種外植體為起始材料，確定了植株再生過(guò)程中誘導(dǎo)叢生芽、芽的莖伸長(zhǎng)和生根培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)條件，建立了穩(wěn)定高效的再生培養(yǎng)系統(tǒng)。結(jié)果表明：基本培養(yǎng)基MS優(yōu)于WPM；最適從生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + TDZ 0.05 mg/L + 6-BA 0.05 mg/L + NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L，莖段、葉柄、葉片3種外植體叢生芽誘導(dǎo)率分別達(dá) 100%、100%和86%。叢生芽需要進(jìn)行莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)的環(huán)節(jié)，莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)效率最高是MS +KT 0.5 mg/L+ GA32 mg/L +果糖30 g/L 培養(yǎng)基，莖段和葉柄叢生芽莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)最好，誘導(dǎo)培養(yǎng)20 d，得到平均芽長(zhǎng)3 cm的有效芽，增殖系數(shù)大于4。抽莖芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)前，須經(jīng)MS基本培養(yǎng)基壯化培養(yǎng)。在1/2 MS + IAA 0.02 mg/L+ IBA 0.02 mg/L + AC3 g/L+蔗糖30 g/L培養(yǎng)基上，試管苗生根率可達(dá)100%，苗體健壯。歐美楊108高效組培再生系統(tǒng)為其遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

歐美楊108；離體培養(yǎng)；芽伸長(zhǎng)誘導(dǎo)；芽壯化培養(yǎng)

歐美楊108P.euramericana‘Guariento’具有優(yōu)良的速生性、抗病蟲(chóng)害能力及材性，可營(yíng)造工業(yè)和造紙商品林，也適于營(yíng)造生態(tài)林改善生態(tài)環(huán)境[1,2]。組培再生系統(tǒng)是其種質(zhì)資源保存利用和基因轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)[3]。楊樹(shù)不同品種再生研究表明[4-14]，楊樹(shù)品種間組培再生條件區(qū)別明顯。歐美楊108高效組培再生系統(tǒng)具有應(yīng)用價(jià)值高，筆者選擇葉片、葉柄和莖段3種外植體，反復(fù)試驗(yàn)啟動(dòng)培養(yǎng)和循環(huán)繼代培養(yǎng)條件，建立其穩(wěn)定高效的組培再生系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)條件

歐美楊108P.euramericana‘Guariento’由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院提供。培養(yǎng)溫度 （26 ±1） ℃，光周期16L:8D，光照度 2 000 lx。

1.2 啟動(dòng)培養(yǎng)

1.2.1 外植體處理

歐美楊108一年生枝條扦插苗，5～7月剪取新生嫩枝，自來(lái)水下流動(dòng)沖洗2 h。超凈工作臺(tái)中，用75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水洗滌1次；再用1 g/L 的HgCl2溶液浸泡4 min，最后用無(wú)菌水洗滌5次，獲得除菌外植體。莖段、葉柄剪成1.5 cm左右長(zhǎng)度，幼嫩葉片剪3道切口橫向深達(dá)主脈，接種于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，葉背面向上；每種外植體接種60個(gè)。

1.2.2 叢生芽的誘導(dǎo)與分化

基本培養(yǎng)基MS和wpm，添加不同質(zhì)量濃度的噻苯?。═DZ）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA），最后添加瓊脂5 g/L，蔗糖30 g/L，滅菌前pH值調(diào)整至6.0。15d在原接種培養(yǎng)基上繼代1次，30 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷和叢生芽誘導(dǎo)狀況，統(tǒng)計(jì)各處理叢生芽誘導(dǎo)率。

1.2.3 叢生芽抽莖生長(zhǎng)及壯化

基本培養(yǎng)基MS，分別添加TDZ、激動(dòng)素（KT）、6 -BA、吲哚丁酸（IBA）、NAA、谷氨酰胺（Gln）、赤霉素（GA3）等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，部分組合見(jiàn)表2，另附加葡萄糖、果糖或蔗糖30 g/L，瓊脂5 g/L，滅菌前pH值調(diào)整至6.0。20 d 后觀察叢生芽伸長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)各處理的叢生芽伸長(zhǎng)率，對(duì)比不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)試管苗莖伸長(zhǎng)的影響。

1.2.4 試管苗的生根

基本培養(yǎng)基MS、1/2 MS或1/4 MS，添加吲哚乙酸（IAA）、IBA、NAA，或附加活性炭（AC），另附加蔗糖30 g/L，瓊脂 5 g/L，滅菌前pH值調(diào)整至6.0。每處理接種40個(gè)4 cm長(zhǎng)的芽，20 d 后統(tǒng)計(jì)各處理的生根率、每苗平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)。

1.3 循環(huán)繼代培養(yǎng)

1.3.1 外植體處理

歐美楊108高度10 cm的生根組培苗，莖段、葉柄分別剪成1 cm的短段；完全展開(kāi)的葉片剪3道切口橫向深達(dá)主脈，葉背面向上，每處理40個(gè)外植體接種在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.3.2 叢生芽的誘導(dǎo)

基本培養(yǎng)基MS，附加不同含量TDZ、6-BA、NAA組合見(jiàn)表4，另附加瓊脂5 g/L，蔗糖30 g/L，滅菌前pH值調(diào)整至6.0。15 d在原接種培養(yǎng)基上繼代1次，培養(yǎng) 30 d 后并觀察愈傷和叢生芽生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)各處理叢生芽誘導(dǎo)率（同1.2.2）。

1.3.3 叢生芽抽莖生長(zhǎng)及壯化

基本培養(yǎng)基MS，添加KT、GA3、果糖組合見(jiàn)表5，另附加瓊脂5 g/L，蔗糖30 g/L，滅菌前pH值調(diào)整至6.0。培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計(jì)各處理的叢生芽伸長(zhǎng)率和平均芽長(zhǎng)（同1.2.3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)培養(yǎng)

2.1.1 田間來(lái)源外植體叢生芽的誘導(dǎo)

當(dāng)6-BA、TDZ和 NAA 同時(shí)存在時(shí)，莖段、葉柄和葉片3種外植體均可誘導(dǎo)出叢生芽，而其中任意2種調(diào)節(jié)物質(zhì)的組合，未能誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽（見(jiàn)表1）。相同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合，MS比WPM上的外植體叢生芽誘導(dǎo)率高；經(jīng)過(guò)30 d培養(yǎng)，外植體更綠。在MS + TDZ 0.05 mg/L+6-BA 0.05 mg/L+ NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基上，接種7 d后，莖段、葉柄外植體切口發(fā)紅膨大，切面中部向外凸起，形成綠色愈傷組織；接種15 d后，愈傷組織開(kāi)始出現(xiàn)密集的叢生芽，芽誘導(dǎo)率分別達(dá)95%和90%。每隔15 d在原培養(yǎng)基上繼代一次，30 d后，叢生芽葉片長(zhǎng)度1 cm左右，但沒(méi)有莖（見(jiàn)圖 1a、b）。葉片外植體接種10 d后，主葉脈切口處形成的白色愈傷，20 d后出現(xiàn)叢生芽（見(jiàn)圖1c），叢生芽較莖段、葉柄外植體上密度小，叢生芽誘導(dǎo)率10%。

2.1.2 叢生芽誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)及壯化培養(yǎng)

叢生芽需誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)的環(huán)節(jié)，才能形成有效的再生芽，此過(guò)程需更換與叢生芽誘導(dǎo)組分不同的培養(yǎng)基。外植體初始誘導(dǎo)出的叢生芽，在原叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；或在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中再添加GA3；或用IBA代替NAA；或降低細(xì)胞分裂素6-BA、TDZ或生長(zhǎng)素NAA的含量；或僅有生長(zhǎng)素IBA存在，叢生芽的莖均不能伸長(zhǎng)生長(zhǎng)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，叢生芽逐漸黃化，甚至褐化死亡。MS培養(yǎng)基附加KT和GA3，能夠較好地誘導(dǎo)叢生芽莖伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。培養(yǎng)基為MS+ KT 0.5 mg/L + GA32 mg/L +果糖 30 g/L時(shí)，莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)最好，莖段外植體來(lái)源的叢生芽伸長(zhǎng)率達(dá)100 %，第14天芽高度平均3 cm，每外植體平均有4個(gè)抽莖芽（見(jiàn)表2）。在莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + KT 0.25 mg/L+ GA31 mg/L +果糖30 g/L中，培養(yǎng)14 d后，莖伸長(zhǎng)的有效芽平均高2 cm，每外植體平均有3個(gè)芽，芽長(zhǎng)度稍短；培養(yǎng)基為MS + KT 1 mg/L + GA34 mg/L + 果糖 30 g/L時(shí)，培養(yǎng)14 d后，每個(gè)外植體平均有3個(gè)芽，有效的再生芽平均高3 cm，抽莖芽數(shù)量稍少。莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)后得到的芽的莖、葉細(xì)弱（見(jiàn)圖 2a、b）；將原外植體攜帶此細(xì)弱的芽轉(zhuǎn)移到MS基本培養(yǎng)基上，可使莖、葉器官逐漸增粗增大，使有效芽木質(zhì)化程度加深（見(jiàn)圖 2c）。

表1 不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)歐美楊108叢生芽誘導(dǎo)的影響Table 1 Effect of different hormone concentration on bud induction of P.euramericana ‘Guariento’

圖1 歐美楊108田間外植體的叢生芽的誘導(dǎo)Fig.1 Shoots induction on different explants from fi eld cultures of P.euramericana ‘Guariento’

表2 不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)歐美楊108莖段叢生芽伸長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of different hormone concentration on enlongation of adventitious shoots from stem xplants of P.euramericana ‘Guariento’

2.1.3 試管苗的生根

圖2 歐美楊108叢生芽的伸長(zhǎng)及壯化培養(yǎng)Fig.2 Adventitious shoots enlongation and shoot strengthening of P.euramericana ‘Guariento’

選擇高4～5 cm、莖健壯的無(wú)根苗用以生根。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)不同，試管苗生根差別較大（見(jiàn)表3），在培養(yǎng)基中添加IAA和IBA，生根率高。其中在1/2MS + IAA 0.02 g/L +IBA 0.02 g/L+ AC 3 g/L培養(yǎng)基中生根最好，生根率100%；生根培養(yǎng)7 d后，莖基部長(zhǎng)出紅色凸起根點(diǎn)；20 d后生根4條以上，根長(zhǎng)度4 cm左右；主根粗壯，側(cè)根豐富（見(jiàn)圖 3）。

表3 不同培養(yǎng)基中歐美楊108芽生根Table 3 Shoots rooting of P.euramericana ‘Guariento’ in different culture mediums

圖3 歐美楊108試管苗生根Fig.3 Shoot rooting of P.euramericana ‘Guariento’

2.2 循環(huán)繼代培養(yǎng)

2.2.1 無(wú)菌苗外植體誘導(dǎo)叢生芽

TDZ、6-BA和NAA共同存在，且質(zhì)量濃度在0.025～0.10 mg/L范圍內(nèi)，全部莖段和葉柄外植體可誘導(dǎo)出叢生芽，葉片外植體叢生芽誘導(dǎo)率較低，誘導(dǎo)率可達(dá)86%（見(jiàn)表4）。在MS+TDZ 0.05 mg/L+ 6-BA 0.05 mg/L + NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基上，接種5 d后，莖段、葉柄和葉片切口就觀察到綠色愈傷組織形成，15 d左右開(kāi)始出現(xiàn)大量叢生芽，叢生芽無(wú)莖（見(jiàn)圖 4），30 d后叢生芽葉片長(zhǎng)為1 cm。TDZ、6-BA和NAA質(zhì)量濃度在0.025 mg/L或0.10 mg/L時(shí)，外植體形成的愈傷體積稍小，叢生芽密度也低。

2.2.2 不同外植體來(lái)源的叢生芽伸長(zhǎng)差異

在MS + KT 0.25 mg/L + GA31 mg/L+果糖 30 g/L培養(yǎng)基上，叢生芽誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)效果最好，可形成數(shù)量較多的有效芽（見(jiàn)圖 5）；但不同外植體來(lái)源的叢生芽莖，伸長(zhǎng)誘導(dǎo)效率差異明顯（見(jiàn)表5）。莖段和葉柄外植體上的叢生芽莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)率100%，葉片外植體上的叢生芽莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)率為80%。莖段外植體來(lái)源的叢生芽，莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)20 d后，每個(gè)外植體形成有效芽平均6.3個(gè)，芽平均長(zhǎng)度4.5 cm，莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)效率顯著高于葉柄和葉片外植體。

表4 不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)歐美楊108組培苗外植體叢生芽誘導(dǎo)的影響Table 4 Effect of different hormone concentration on shoot induction from tissue-culture plantlet explants of P.euramericana ‘Guariento’

圖4 歐美楊108無(wú)菌苗外植體叢生芽的誘導(dǎo)Fig.4 Shoots induction from different explants from tissue culture plantlets of P.euramericana ‘Guariento’

表5 歐美楊108不同外植體叢生芽伸長(zhǎng)?Table 5 Difference on adventitious shoots enlongation for explants of P.euramericana ‘Guariento’

圖5 歐美楊108不同外植體的叢生芽莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)Fig.5 Adventitious shoots enlongation form different explants of tissue cultured plantlets of P.euramericana ‘Guariento’

3 結(jié)論與討論

3.1 TDZ、6-BA和NAA配合誘導(dǎo)叢生芽

在培養(yǎng)條件相同的情況下，TDZ 0.05 mg/L、6-BA 0.05 mg/L 和 NAA 0.05 mg/L 共同配合，歐美楊108叢生芽誘導(dǎo)率最高；但是相同質(zhì)量濃度的TDZ、6-BA 和 NAA，任何2種配合均不能誘導(dǎo)成芽。在河北楊和新疆楊[8]，以及在‘2001’楊[11]及銀中楊[15]再生過(guò)程中，均發(fā)現(xiàn)TDZ對(duì)叢生芽分化有重要影響，較低質(zhì)量濃度的TDZ有利于分化。在歐美楊108叢生芽誘導(dǎo)過(guò)程中，6-BA和NAA的配合也非常關(guān)鍵，同時(shí)也要求存在低質(zhì)量濃度的TDZ。

3.2 叢生芽需莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)環(huán)節(jié)

歐美楊108叢生芽形成后，必須更換培養(yǎng)基，才能促使芽進(jìn)一步生長(zhǎng)，誘導(dǎo)叢生芽和誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)所用培養(yǎng)基不同。在KT 0.5 mg/L和GA32 mg/L條件下，輔以30 g/L的果糖碳源培養(yǎng)基上，歐美楊108叢生芽莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)效率最高，3種外植體來(lái)源的叢生芽均可得到很好伸長(zhǎng)。在楊樹(shù)許多品種的組織培養(yǎng)中，叢生芽形成后，并非必須誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)環(huán)節(jié)。白楊派來(lái)源的楊樹(shù)，往往不用更換培養(yǎng)基，叢生芽的莖葉便繼續(xù)生長(zhǎng)[5]；而黑楊派來(lái)源的楊樹(shù)，往往需更換培養(yǎng)基，減少原莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，叢生芽方可進(jìn)一步生長(zhǎng)[6]。

本試驗(yàn)中，叢生芽接種在莖伸長(zhǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，GA3含量在2～4 g/L范圍內(nèi)，均能夠誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)。一般認(rèn)為，GA3對(duì)試管苗的增殖和伸長(zhǎng)有顯著效果，但是GA3會(huì)抑制根原基和芽原基分化，必須在愈傷組織分化后，才能加入GA3[9]。碳源是果糖時(shí)，歐美楊108叢生芽莖伸長(zhǎng)效率最高，張小蘋[16]也發(fā)現(xiàn)果糖對(duì)桑樹(shù)叢生芽莖伸長(zhǎng)效率更好，不同器官對(duì)于不同碳源利用能力差異是原因之所在。

3.3 Ac和壯化培養(yǎng)對(duì)生根的重要性

一般認(rèn)為Ac的作用是通過(guò)吸附而發(fā)揮，有效吸附有害物質(zhì)。在培養(yǎng)基中加入Ac，對(duì)許多植物的組培生長(zhǎng)均表現(xiàn)出促進(jìn)作用[17]，并提供了黑暗的生長(zhǎng)環(huán)境有助根的形成[18-19]；但也有研究發(fā)現(xiàn)，Ac對(duì)楊樹(shù)的組培生根有害[10]。在歐美楊108試驗(yàn)中，設(shè)置了Ac梯度，比較其對(duì)歐美楊108生根的作用。結(jié)果表明，適量的Ac能對(duì)其生根起到促進(jìn)作用，在3 g/L時(shí)最有利，不但有助于歐美楊108根系的增粗和伸長(zhǎng)，而且防止褐化產(chǎn)生。

對(duì)歐美楊108來(lái)說(shuō)，芽的壯化對(duì)生根非常重要。經(jīng)誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)形成的歐美楊108有效芽，經(jīng)MS壯化培養(yǎng)后，木質(zhì)化程度加深，莖增粗，葉片增大，誘導(dǎo)生根很容易；如果不經(jīng)壯化培養(yǎng)，則生根困難，苗成活率低。一般從愈傷組織上誘導(dǎo)出的叢生芽較小，長(zhǎng)勢(shì)不良，如果直接讓其生根，生根率也低，則不易成活，故及時(shí)進(jìn)行壯化培養(yǎng)是有效提高生根率的措施。有研究發(fā)現(xiàn)，部分楊樹(shù)品種形成的芽可直接生根，無(wú)需壯化。如中黑防楊叢生芽長(zhǎng)至0.5 cm左右時(shí)，切下轉(zhuǎn)入莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，21 d后叢生芽長(zhǎng)成無(wú)根苗；將苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，基部14 d左右長(zhǎng)出白色小根，95%的苗20 d后可長(zhǎng)出l～2 cm粗壯的根[7]。歐美楊108同屬于黑楊派，品種間組培生根差別是明顯的，這種差異的原因有待進(jìn)一步研究。

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Effective tissue culture system forPopulus euramericana‘Guariento’

ZHOU Zhou1, LI Yong-li1, AN Shi-heng2, HU Jian-jun3
(1.College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan, China;2.College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;3.Research Institute of Forestry, Chinese Academe of Forestry, Beijing 100091, China)

Production behaviors ofP.euramericana‘Guariento’ show that it is a superior variety, so it is a good recipient material for gene transformation.Stem, petiole and leaf were cultured as the initiation explants developing from tender branches outdoor to investigate the micropropagation.The key factors affecting the growth ofP.euramericana‘Guariento’in vitroand the optimal tissue culture conditions for it were ascertained.The optimum basic culture medium was MS.Cultured explants on MS + TDZ 0.05 mg/L +6-BA 0.05 mg/L+ NAA 0.05 mg/L+ Sucrose 30 g/L was the best way of inducement and differentiation, with inducement rate 100%,100% and 86% for stem, petiole and leaf from tissue culture plantlets.For elongation of the induced buds, the suitable culture medium was MS + KT 0.5 mg/L+ GA32 mg/L+ Fructose 30 g/L.More than 4 shoots about 3 cm high were elongated from the induced buds after 20 days.The optimal subculture medium and root inducement culture medium for shoot were 1/2 MS + IAA 0.02 mg/L + IBA 0.02 mg/L +AC3 g/L+ Sucrose 30 g/L, and the rooting rate was 100%.The high frequency regeneration system forP.euramericana‘Guariento’in vitroprovides a basis for gene modi fi cation in this study.

Populus euramericana‘Guariento’;in vitroculture; shoot elongation induction; shoots strengthen culture

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.07.001

http: //qks.csuft.edu.cn

A

1673-923X(2016)07-0001-06

2015-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1204324）；河南省科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目（132102110037）

周 洲，副教授，博士；E-mail：zhouzhouhaust@163.com

周 洲，李永麗，安世恒，等.歐美楊108高效組培再生系統(tǒng)[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2016, 36(7): 1-6.

[本文編校：吳 毅]