米 智, 曾 彪, 徐 水, 朱 勇*

(1.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716；2.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009)

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氟化物對(duì)家蠶血液和中腸酪氨酸酶活性的影響

米 智1,2, 曾 彪1, 徐 水1, 朱 勇1*

(1.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716；2.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009)

為了探討氟化物對(duì)家蠶代謝機(jī)制的影響，以家蠶耐氟品種T6和氟化物敏感品種734為研究材料，從5齡起蠶開始分別添食經(jīng)50、100、200、400 mg/kg NaF溶液浸泡后的新鮮桑葉，檢測(cè)家蠶血液和中腸中酪氨酸酶活性的變化。結(jié)果表明，在血液中，734添氟組酪氨酸酶活性是對(duì)照組的0.79～1.71倍，T6約是對(duì)照組的0.59～0.96倍。734對(duì)照組和2個(gè)低濃度添氟組(50、100 mg/kg NaF處理組)之間差異極顯著(P<0.01)，2個(gè)高濃度添氟組之間差異顯著(P<0.05)；T6對(duì)照組和最高濃度添氟組之間的差異極顯著。在中腸中，734添氟組酪氨酸酶活性是對(duì)照組的0.60～1.16倍，T6約是對(duì)照組的1.23～1.62倍。734、T6對(duì)照組和最高濃度添氟組之間差異顯著(P<0.05)。敏感家蠶酪氨酸酶活性因添食NaF濃度的高低表現(xiàn)出不同的活性，NaF對(duì)耐氟家蠶血液酪氨酸酶活性起抑制作用，而對(duì)中腸酪氨酸酶活性起促進(jìn)作用。本試驗(yàn)表明，家蠶酪氨酸酶活性與蠶體的耐氟性能有一定的相關(guān)性。

家蠶；氟化物；血液；中腸；酪氨酸酶

近年來(lái)隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，陶瓷、磚瓦、磷肥、煉鋁、水泥、玻璃、火力發(fā)電等部門排放的廢氣中含有大量氟化物，給蠶桑生產(chǎn)帶來(lái)較大的危害。氟化物是一類原生質(zhì)毒劑，研究表明，氟化物隨桑葉進(jìn)入蠶體累積于消化液、腸壁和體壁等處，通過(guò)消化管進(jìn)入血液，在血液和組織中與蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制生長(zhǎng)發(fā)育，出現(xiàn)氟中毒癥狀[1]。氟中毒能損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，內(nèi)分泌系統(tǒng)及心、肝、腎等，并引起生物酶學(xué)改變和免疫功能改變[2]。

酪氨酸酶(EC.1.14.18.1)是一種含銅的氧化還原酶，廣泛存在于生物體中[3]。在植物中，酪氨酸酶一般稱為多酚氧化酶；在昆蟲中，則稱為酚氧化酶；在微生物和人體中，稱為酪氨酸酶。根據(jù)分解底物的不同，通常將昆蟲酚氧化酶分為酪氨酸酶類型酚氧化酶(tyrosinase-type phenoloxidase，簡(jiǎn)稱酪氨酸酶tyrosinase)和漆酶類型酚氧化酶(laccase-type phenoloxidase，簡(jiǎn)稱漆酶laccase)。這2種類型酚氧化酶都是含多個(gè)銅離子的金屬蛋白酶，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似[4]。酪氨酸酶具有雙重催化功能，既可以催化單酚類物質(zhì)(如酪氨酸)的羥化，又可以催化多酚類物質(zhì)的氧化，這種雙重反應(yīng)功能,對(duì)生物體黑色素的形成和外來(lái)物侵入時(shí)獲得性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生至關(guān)重要[5-6]；漆酶不能氧化酪氨酸等單酚類物質(zhì)，只能催化多酚類物質(zhì)進(jìn)行氧化，尤其對(duì)間位酚和對(duì)位酚類似物表現(xiàn)出較強(qiáng)的催化能力，不被一氧化碳所抑制[7]。昆蟲酪氨酸酶原經(jīng)體內(nèi)蛋白酶水解激活成酪氨酸酶，在表皮損傷部位催化黑化反應(yīng)合成黑色素，在凝集外源侵染物過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8-9]。目前酪氨酸酶是已知生物體中參與黑色素合成的關(guān)鍵酶[10-12]，不僅決定黑色素合成的速率，還是黑色素細(xì)胞分化成熟的特征性標(biāo)志[13-14]。

本試驗(yàn)通過(guò)研究家蠶添食NaF后中腸和血液中酪氨酸酶活性變化，為從生理生化水平上闡明家蠶對(duì)氟化物的代謝機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

家蠶耐氟品種T6、敏感品種734，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供，西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院家蠶遺傳育種室保存。按照常規(guī)方法飼養(yǎng)到5齡起蠶時(shí)，對(duì)照組喂食清水浸泡11 min后自然晾干的新鮮桑葉，試驗(yàn)組分別用50、100、200、400 mg/kg NaF溶液浸泡11 min后自然晾干的桑葉飼養(yǎng)[15]，每隔8 h添食1次，每天添食3次。試驗(yàn)采用平行設(shè)計(jì)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。從5齡起蠶第1～7天每天分別取各組幼蟲的組織樣品。

1.2 組織樣品制備

1.2.1 血淋巴的提取[16-17]將蠶體表用蒸餾水擦洗處理后，并用吸水紙擦干，使蠶體彎曲，用無(wú)菌剪刀剪其腹足讓血液滴入放有少許苯基硫脲的預(yù)冷離心管中，在0～4 ℃下5000 r/min離心15 min，取上清液作為酶液，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 中腸組織的分離[16-17]在冰浴中，用消毒解剖刀將幼蟲從腹部到頭部剖開，取出整個(gè)腸道，去除腸道內(nèi)由圍食膜包裹的食物，將中腸部分放到預(yù)冷的生理鹽水中漂洗干凈桑葉殘?jiān)?，將中腸于濾紙上迅速吸干，每5頭蠶的中腸收集于1個(gè)離心管中。加預(yù)冷的0.1 mol/L pH 6.2磷酸緩沖液進(jìn)行勻漿，之后10 000 r/min離心10 min，取上清液作為酶粗提液，放于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照Bradford[18]考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行測(cè)定。以牛血清白蛋白的含量為橫坐標(biāo)，以O(shè)D595為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得方程為：y=0.0068x+ 0.0172，R2=0.998。

1.3.2 酪氨酸酶活性測(cè)定 參照劉吉平[19-20]的方法，并略有改動(dòng)。取0.01 mol/L鄰苯二酚1.5 mL，0.1 mol/L pH 6.2磷酸緩沖液1.4 mL于試管內(nèi)混勻后，作為酶液的底物反應(yīng)體系，放在30 ℃水浴中10 min，以2.9 mL的底物反應(yīng)體系做空白對(duì)照調(diào)零后，加入0.1 mL經(jīng)磷酸緩沖液稀釋后的酶粗提液；混勻后立即在紫外分光光度計(jì)420 nm處測(cè)定吸光值在90s內(nèi)的變化，記錄每30 s測(cè)定的OD420值的大小。每個(gè)樣品均重復(fù)3次測(cè)定，取平均值，以每分鐘每毫克蛋白的吸光度改變0.001為所需的酶量，計(jì)算酶比活力，計(jì)算公式如下。

U=ΔOD/[(0.001×蛋白量(mg)×測(cè)定時(shí)間(min)]

其中，U為酶的比活力值(U/mg)。ΔOD為測(cè)定起始時(shí)間與終止時(shí)間的吸光度差值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel軟件對(duì)酪氨酸酶活性做柱狀圖分析；運(yùn)用SPSS17.0軟件對(duì)酶活性采用Duncan方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟化物對(duì)家蠶血液酪氨酸酶活性的影響

從圖1～2可以看出，氟化物敏感品種734對(duì)照組血液酪氨酸酶活性前3 d呈上升趨勢(shì)，且在第3天達(dá)到最大值，后4 d呈下降趨勢(shì)，但變化趨勢(shì)很緩，近乎一條直線；50 mg/kg NaF處理組的酶活性前2 d上升，之后下降，但在第6天的酶活性突然升高達(dá)12.41U，第7天的酶活性降低整個(gè)試驗(yàn)期最低；100 mg/kg NaF處理組在前4 d呈先升后降的趨勢(shì)，且在第2天達(dá)最大值，最后3 d的酶活性呈下降趨勢(shì)，但后3 d的酶活性遠(yuǎn)大于前4 d的；200 mg/kg NaF處理組的酶活性前2 d呈上升，之后驟降至約3.22 U，后4 d呈波折型上升趨勢(shì)，第6～7天變化幅度很大；400 mg/kg NaF處理組前4 d酶活力變化很平緩，略小于4 U，之后的2 d酶活力上升。耐氟品種T6對(duì)照組血液酪氨酸酶活性在1～3 d呈下降趨勢(shì)，且酶活性大于添氟處理組，4～6 d的酪氨酸酶活性約在6～7 U之間，最后1 d稍下降；50 mg/kg NaF處理組的活性在整個(gè)試驗(yàn)期呈現(xiàn)先升后降再升的變化趨勢(shì)，第7天的活性最大，且遠(yuǎn)大于其他各處理組；100 mg/kg NaF處理組整體上呈現(xiàn)“M”的變化趨勢(shì)，第1天的酶活性最低，且低于其它各處理組，在第2和6天出現(xiàn)2個(gè)極大值；200 mg/kg NaF處理組酶活性變化規(guī)律基本同100 mg/kg NaF處理組，但是幅度大于100 mg/kg NaF處理組。400 mg/kg NaF處理組變化趨勢(shì)較緩和，前4 d呈下降趨勢(shì)，后3 d的酶活性相似。

圖1 734的5齡幼蟲添食NaF后血液酪氨酸酶活性的變化Fig.1 Variations of tyrosinase activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori 734 after treatment with NaF

圖2 T6 的5齡幼蟲添食NaF后血液酪氨酸酶活性的變化Fig.2 Variations of tyrosinase activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori T6 after treatment with NaF

2.2 氟化物對(duì)家蠶中腸酪氨酸酶活性的影響

從圖3～4可見，氟化物敏感品種734對(duì)照組中腸酪氨酸酶活性在整個(gè)試驗(yàn)期呈上下波動(dòng)趨勢(shì)變化，第2和4 天均是極大值；50 mg/kg NaF處理組的酶活性前2 d下降，在3～4 d上升，且達(dá)到最大值，之后又呈波動(dòng)型變化；100 mg/kg NaF處理組前4 d呈上升趨勢(shì)，最后3 d呈波動(dòng)型變化，200 mg/kg NaF處理組前4 d和后3 d均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，只是第5天的酶活性最低；400 mg/kg NaF處理組的酶活性變化較緩和，前3 d的酶活性略大于3 U，中間2 d的酶活性略小于7 U，最后2 d約11U，從整個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，最后4 d的酶活性大于前3 d的，而且變化幅度較大；耐氟品種T6對(duì)照組中腸酪氨酸酶活性在1～3 d相似，第4天是試驗(yàn)期的最大值，最后3 d呈上升的變化趨勢(shì)；500 mg/kg NaF處理組前4 d呈直線上升，之后波折型變化；100 mg/kg NaF處理組前2 d酶活性相當(dāng)，之后呈波折型變化，在第3和6天出現(xiàn)極大值；200 mg/kg NaF處理組前4 d和后3 d均呈上升趨勢(shì)，但第4 天的酶活性最大；400 mg/kg NaF處理組前4 d呈上升趨勢(shì)，后3 d波折型變化。

圖3 734的5齡幼蟲添食NaF后中腸酪氨酸酶活性的變化Fig.3 Variations of tyrosinase activity of midgut in 5th instar larvae of Bombyx mori 734 after treatment with NaF

圖4 T6的5齡幼蟲添食NaF后中腸酪氨酸酶活性的變化Fig.4 Variations of tyrosinase activity of midgut in 5th instar larvae of Bombyx mori T6 after treatment with NaF

2.3 不同濃度氟化物及氟化物處理后不同天數(shù)血液酪氨酸酶活性差異顯著性分析

734可分為對(duì)照組，低濃度添氟組(50、100 mg/kg NaF處理組)和高濃度添氟組(200、400 mg/kg NaF處理組)3組，對(duì)照組和低濃度添氟組之間差異不僅顯著，而且極顯著，而和高濃度添氟組之間的差異不顯著，2個(gè)高濃度添氟組之間差異顯著。T6對(duì)照組和最高濃度添氟組之間的差異不僅顯著而且極顯著，和100 mg/kg NaF處理組之間差異顯著(表1)。

734血液的酪氨酸酶活性在添氟后第4天與其添氟后第2、5、6和7天差異顯著，添氟后4 d和第6和7天差異極顯著。T6在添氟處理后第2天與添氟后第3、4和5天差異不僅顯著，而且極顯著。2品種添氟處理后之間的差異不顯著(表2)。

2.4 不同濃度氟化物及氟化物處理后不同天數(shù)中腸酪氨酸酶活性差異顯著性分析

734對(duì)照組和最高濃度添氟組之間差異顯著，50 mg/kg NaF處理組和400 mg/kg NaF處理組之間差異不僅顯著，而且極顯著。T6對(duì)照組和最高濃度添氟組之間差異顯著(表1)。

734添氟后1～2、3和5、4和6 d 3組之間差異顯著，組內(nèi)差異不顯著，第7天僅和第1、2、4 天之間的差異顯著，第2天和除1 d以外時(shí)間點(diǎn)差異極顯著，第4天和其它時(shí)間點(diǎn)差異極顯著。T6添氟后1、2和5 d、3和7 d、4和6 d 3組之間的差異不僅顯著，而且極顯著。2品種在添氟處理后的5 d差異顯著(表2)。

表1 734與T6添食不同濃度氟化物后血液和中腸酪氨酸酶活性多重比較

Table 1 Multiple comparison on activity variations of tyrosinase in hemolymph and midgut between 734 and T6 after treatment with different sodium fluoride

品種及添食NaF質(zhì)量濃度StrainandconcentrationofNaF血液酪氨酸酶活性差異顯著性Significantdifferenceoftyrosinaseactivityinhemolymph中腸酪氨酸酶活性差異顯著性SignificantdifferenceoftyrosinaseactivityinmidgutP<0.05P<0.01P<0.05P<0.01743,CKabcABCbcABT6,CKdeCDEaA743,50mg/kgNaFdeDEcBT6,50mg/kgNaFcdeBCDEabcAB743,100mg/kgNaFeEbcABT6,100mg/kgNaFabcABCDabcAB743,200mg/kgNaFbcdABCDEabABT6,200mg/kgNaFcdABCDEabAB743,400mg/kgNaFaAaAT6,400mg/kgNaFabABbcAB

注：表中不同小寫字母表示組間比較差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示組間比較差異極顯著(P<0.01)。下同。 Note:Different low-case letters in the table represent significant difference between different groups (P<0.05)，and the different upper-case letters represent extremely significant difference between different groups (P< 0.01). The same as below.

表2 734與T6添食NaF后不同時(shí)間段血液和中腸酪氨酸酶活性多重比較

Table 2 Multiple comparison on activity variations of tyrosinase in hemolymph and midgut at different time between 734 and T6 after treatment with sodium fluoride

品種及添食NaF天數(shù)StrainandthedaysaftertreatingwithNaF血液酪氨酸酶活性差異顯著性Significantdifferenceoftyrosinaseactivityinhemolymph中腸酪氨酸酶活性差異顯著性SignificantdifferenceoftyrosinaseactivityinmidgutP<0.05P<0.01P<0.05P<0.01743,1dbcdABCDaABT6,1dcdeABCDaA743,2dcdeCDaAT6,2deDaA743,3dbcdABCDbBCT6,3dabcABCbCD743,4dabABdFT6,4daAdEF743,5dcdeABCDbBCT6,5dabcdABCaAB743,6ddeCDcdDEFT6,6dcdeBCDdF743,7dcdeCDbcCDET6,7dcdeABCDbCD

3 討 論

酪氨酸酶在昆蟲的正常發(fā)育過(guò)程中具有重要的生理功能：①參與表皮的硬化和黑化；②對(duì)卵殼的鞣化作用；③參與傷害防御；④加速傷口的愈合[21]，是昆蟲體內(nèi)起主要免疫作用的氧化還原酶[22],當(dāng)外來(lái)物入侵時(shí)，酪氨酸酶在外來(lái)物周圍沉積形成黑色素，通過(guò)包裹和黑化來(lái)限制入侵的外來(lái)物。另外在酪氨酸酶被激活過(guò)程中，還產(chǎn)生具有細(xì)胞毒作用的氧自由基和潛在細(xì)胞毒作用的半醌及三羥酚，進(jìn)一步增強(qiáng)寄主的防御能力[23]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同家蠶品系添食NaF，檢測(cè)其血液和中腸的酪氨酸酶活性，在血液中，氟化物敏感品種734添氟組約是對(duì)照組的0.79～1.71倍，耐氟品種T6添氟組約是對(duì)照組的0.59～0.96倍。T6添氟處理后以及734的400 mg/kg NaF處理組的酪氨酸酶活性均低于對(duì)照組，而734的其它添氟組的酶活性反而高于對(duì)照組，原因可能與酪氨酸酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，它是一種以Cu“為輔助因子的金屬酶，每一個(gè)亞基含2個(gè)金屬銅離子，2個(gè)銅離子分別與蛋白質(zhì)分子中2個(gè)平展的組氨酸和一個(gè)弱的直立組氨酸配體結(jié)合，另有一個(gè)內(nèi)源橋基將2個(gè)銅離子聯(lián)系在一起，構(gòu)成酪氨酸酶催化氧化反應(yīng)活性中心[24]。當(dāng)家蠶食有可溶性的NaF后，通過(guò)其消化、吸收等作用，氟離子以游離的狀態(tài)存在于家蠶體內(nèi)，這種非金屬性較強(qiáng)的離子會(huì)和一些蛋白質(zhì)或者金屬陽(yáng)離子結(jié)合，形成絡(luò)合物或者較為穩(wěn)定的鹽，進(jìn)而被代謝。由于酪氨酸酶是以銅離子為輔基的酶類，可能氟離子與銅離子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合之后，降低了酪氨酸酶活性，這種復(fù)合物進(jìn)而被代謝。734對(duì)照組和2個(gè)低濃度添氟組(50、100 mg/kg NaF處理組)之間差異極顯著，而和2個(gè)高濃度添氟組之間的差異不顯著，2個(gè)高濃度添氟組之間差異顯著。T6對(duì)照組和最高濃度添氟組之間的差異極顯著。

在中腸中，734添氟組是對(duì)照組的0.60～1.16倍，T6添氟組是對(duì)照組的1.23～1.62倍。T6和734的2個(gè)低濃度添氟組的酪氨酸酶活性均大于對(duì)照組，而734的2個(gè)高濃度添氟組的酶活性低于對(duì)照組。由于中腸是各種毒物較早接觸的器官，故NaF刺激家蠶體內(nèi)免疫體系，發(fā)生防御性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更多的酪氨酸酶(或提高了體內(nèi)的酶活性)，從而生成更多黑色素包被[19]。734在高濃度的NaF作用下，嚴(yán)重?cái)_亂了酶的代謝系統(tǒng)[25]，表現(xiàn)出酪氨酸酶活性降低。再者酪氨酸酶是一個(gè)很大的酶系，其在昆蟲的不同種類以及昆蟲的不同部位、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)不同。734、T6對(duì)照組和最高濃度添氟組之間差異顯著(P<0.05)。

本實(shí)驗(yàn)表明，NaF對(duì)耐氟品種T6血液酪氨酸酶活性起抑制作用，而對(duì)中腸酪氨酸酶活性起促進(jìn)作用。敏感品種734的酪氨酸酶活性因NaF濃度的高低表現(xiàn)出不同的活性。推測(cè)家蠶酪氨酸酶活性與蠶體的耐氟性能有一定的相關(guān)性，而這種酶在家蠶對(duì)氟化物代謝過(guò)程中的作用機(jī)理尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 陳 虹)

Effects of Fluoride on Activity of Tyrosinase in Hemolymph and Midgut ofBombyxmori

MI Zhi1,2, ZENG Biao1,XU Shui1, ZHU Yong1*

(1.College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2.College of Life Science, Shanxi Datong University, Shanxi Datong 037009, China)

In order to explore the effects of NaF on the metabolic mechanism of silkworm (Bombyxmori) , the fluoride-resistant silkworm variety T6 and the fluoride-sensitive variety 734 were used as materials, the silkworm larvae from the first day of fifth instar with mulberry leaves soaked in 50, 100, 200 and 400 mg/kg NaF solutions were fed, respectively, and the tyrosinase activity in the silkworm’s hemolymph and midgut were examined. The results showed that the activity of tyrosinase in hemolymph was 0.79-1.71 times in 734 strain and 0.58-0.96 times in T6 strain compared with control group, respectively. The 734 strain tyrosinase activities of the two lower concentration(50, 100 mg/kg)NaF-treated groups and the control group were extremely significantly different(P<0.01), and their two higher concentration NaF-treated groups performed significant differences(P<0.05); T6’s control group and the highest concentration NaF-treated groups performed extremely significant differences. In midgut, the activities of tyrosinase in 734 strain were 0.60-1.16 times and in T6 strain 1.23-1.62 times compared with control group, and 734, T6’s control group and their highest concentration NaF-treated groups were significantly different(P<0.05). The activity fluoride-sensitive variety’s tyrosinase showed difference with feeding different concentrations of NaF. Fluoride could decrease the tyrosinase activity in the fluoride-resistant silkworm’s hemolyph but increase the activity in midgut. This results indicated that the tyrosinase activity had a certain relationship with the fluoride-resistant to silkworm.

Bombyxmori; Fluoride; Hemolymph; Midgut; Tyrosinase

1001-4829(2016)11-2763-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.046

2015-11-16

重慶市重大攻關(guān)項(xiàng)目(CSTC，2009AA1024)；山西大同大學(xué)博士科研啟動(dòng)資金

米 智(1985-)，男，山西大同人，博士，講師，從事家蠶遺傳育種研究，E-mail:mizhi775@126.com，*為通訊作者：朱 勇，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: zhuy@swu.edu.cn。

S851.34+7.31

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