米 智, 曾 彪, 徐 水, 朱 勇*

(1.西南大學生物技術(shù)學院，重慶 400716；2.山西大同大學生命科學學院，山西 大同 037009)

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氟化物對家蠶血液和中腸酪氨酸酶活性的影響

米 智1,2, 曾 彪1, 徐 水1, 朱 勇1*

(1.西南大學生物技術(shù)學院，重慶 400716；2.山西大同大學生命科學學院，山西 大同 037009)

為了探討氟化物對家蠶代謝機制的影響，以家蠶耐氟品種T6和氟化物敏感品種734為研究材料，從5齡起蠶開始分別添食經(jīng)50、100、200、400 mg/kg NaF溶液浸泡后的新鮮桑葉，檢測家蠶血液和中腸中酪氨酸酶活性的變化。結(jié)果表明，在血液中，734添氟組酪氨酸酶活性是對照組的0.79～1.71倍，T6約是對照組的0.59～0.96倍。734對照組和2個低濃度添氟組(50、100 mg/kg NaF處理組)之間差異極顯著(P<0.01)，2個高濃度添氟組之間差異顯著(P<0.05)；T6對照組和最高濃度添氟組之間的差異極顯著。在中腸中，734添氟組酪氨酸酶活性是對照組的0.60～1.16倍，T6約是對照組的1.23～1.62倍。734、T6對照組和最高濃度添氟組之間差異顯著(P<0.05)。敏感家蠶酪氨酸酶活性因添食NaF濃度的高低表現(xiàn)出不同的活性，NaF對耐氟家蠶血液酪氨酸酶活性起抑制作用，而對中腸酪氨酸酶活性起促進作用。本試驗表明，家蠶酪氨酸酶活性與蠶體的耐氟性能有一定的相關(guān)性。

家蠶；氟化物；血液；中腸；酪氨酸酶

近年來隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，陶瓷、磚瓦、磷肥、煉鋁、水泥、玻璃、火力發(fā)電等部門排放的廢氣中含有大量氟化物，給蠶桑生產(chǎn)帶來較大的危害。氟化物是一類原生質(zhì)毒劑，研究表明，氟化物隨桑葉進入蠶體累積于消化液、腸壁和體壁等處，通過消化管進入血液，在血液和組織中與蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制生長發(fā)育，出現(xiàn)氟中毒癥狀[1]。氟中毒能損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，內(nèi)分泌系統(tǒng)及心、肝、腎等，并引起生物酶學改變和免疫功能改變[2]。

酪氨酸酶(EC.1.14.18.1)是一種含銅的氧化還原酶，廣泛存在于生物體中[3]。在植物中，酪氨酸酶一般稱為多酚氧化酶；在昆蟲中，則稱為酚氧化酶；在微生物和人體中，稱為酪氨酸酶。根據(jù)分解底物的不同，通常將昆蟲酚氧化酶分為酪氨酸酶類型酚氧化酶(tyrosinase-type phenoloxidase，簡稱酪氨酸酶tyrosinase)和漆酶類型酚氧化酶(laccase-type phenoloxidase，簡稱漆酶laccase)。這2種類型酚氧化酶都是含多個銅離子的金屬蛋白酶，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似[4]。酪氨酸酶具有雙重催化功能，既可以催化單酚類物質(zhì)(如酪氨酸)的羥化，又可以催化多酚類物質(zhì)的氧化，這種雙重反應功能,對生物體黑色素的形成和外來物侵入時獲得性免疫反應的產(chǎn)生至關(guān)重要[5-6]；漆酶不能氧化酪氨酸等單酚類物質(zhì)，只能催化多酚類物質(zhì)進行氧化，尤其對間位酚和對位酚類似物表現(xiàn)出較強的催化能力，不被一氧化碳所抑制[7]。昆蟲酪氨酸酶原經(jīng)體內(nèi)蛋白酶水解激活成酪氨酸酶，在表皮損傷部位催化黑化反應合成黑色素，在凝集外源侵染物過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。目前酪氨酸酶是已知生物體中參與黑色素合成的關(guān)鍵酶[10-12]，不僅決定黑色素合成的速率，還是黑色素細胞分化成熟的特征性標志[13-14]。

本試驗通過研究家蠶添食NaF后中腸和血液中酪氨酸酶活性變化，為從生理生化水平上闡明家蠶對氟化物的代謝機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

家蠶耐氟品種T6、敏感品種734，由中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所提供，西南大學生物技術(shù)學院家蠶遺傳育種室保存。按照常規(guī)方法飼養(yǎng)到5齡起蠶時，對照組喂食清水浸泡11 min后自然晾干的新鮮桑葉，試驗組分別用50、100、200、400 mg/kg NaF溶液浸泡11 min后自然晾干的桑葉飼養(yǎng)[15]，每隔8 h添食1次，每天添食3次。試驗采用平行設計，每組設3個重復。從5齡起蠶第1～7天每天分別取各組幼蟲的組織樣品。

1.2 組織樣品制備

1.2.1 血淋巴的提取[16-17]將蠶體表用蒸餾水擦洗處理后，并用吸水紙擦干，使蠶體彎曲，用無菌剪刀剪其腹足讓血液滴入放有少許苯基硫脲的預冷離心管中，在0～4 ℃下5000 r/min離心15 min，取上清液作為酶液，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 中腸組織的分離[16-17]在冰浴中，用消毒解剖刀將幼蟲從腹部到頭部剖開，取出整個腸道，去除腸道內(nèi)由圍食膜包裹的食物，將中腸部分放到預冷的生理鹽水中漂洗干凈桑葉殘渣，將中腸于濾紙上迅速吸干，每5頭蠶的中腸收集于1個離心管中。加預冷的0.1 mol/L pH 6.2磷酸緩沖液進行勻漿，之后10 000 r/min離心10 min，取上清液作為酶粗提液，放于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測定 蛋白質(zhì)含量的測定參照Bradford[18]考馬斯亮藍G-250染色法進行測定。以牛血清白蛋白的含量為橫坐標，以OD595為縱坐標繪制標準曲線。所得方程為：y=0.0068x+ 0.0172，R2=0.998。

1.3.2 酪氨酸酶活性測定 參照劉吉平[19-20]的方法，并略有改動。取0.01 mol/L鄰苯二酚1.5 mL，0.1 mol/L pH 6.2磷酸緩沖液1.4 mL于試管內(nèi)混勻后，作為酶液的底物反應體系，放在30 ℃水浴中10 min，以2.9 mL的底物反應體系做空白對照調(diào)零后，加入0.1 mL經(jīng)磷酸緩沖液稀釋后的酶粗提液；混勻后立即在紫外分光光度計420 nm處測定吸光值在90s內(nèi)的變化，記錄每30 s測定的OD420值的大小。每個樣品均重復3次測定，取平均值，以每分鐘每毫克蛋白的吸光度改變0.001為所需的酶量，計算酶比活力，計算公式如下。

U=ΔOD/[(0.001×蛋白量(mg)×測定時間(min)]

其中，U為酶的比活力值(U/mg)。ΔOD為測定起始時間與終止時間的吸光度差值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)使用Excel軟件對酪氨酸酶活性做柱狀圖分析；運用SPSS17.0軟件對酶活性采用Duncan方法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟化物對家蠶血液酪氨酸酶活性的影響

從圖1～2可以看出，氟化物敏感品種734對照組血液酪氨酸酶活性前3 d呈上升趨勢，且在第3天達到最大值，后4 d呈下降趨勢，但變化趨勢很緩，近乎一條直線；50 mg/kg NaF處理組的酶活性前2 d上升，之后下降，但在第6天的酶活性突然升高達12.41U，第7天的酶活性降低整個試驗期最低；100 mg/kg NaF處理組在前4 d呈先升后降的趨勢，且在第2天達最大值，最后3 d的酶活性呈下降趨勢，但后3 d的酶活性遠大于前4 d的；200 mg/kg NaF處理組的酶活性前2 d呈上升，之后驟降至約3.22 U，后4 d呈波折型上升趨勢，第6～7天變化幅度很大；400 mg/kg NaF處理組前4 d酶活力變化很平緩，略小于4 U，之后的2 d酶活力上升。耐氟品種T6對照組血液酪氨酸酶活性在1～3 d呈下降趨勢，且酶活性大于添氟處理組，4～6 d的酪氨酸酶活性約在6～7 U之間，最后1 d稍下降；50 mg/kg NaF處理組的活性在整個試驗期呈現(xiàn)先升后降再升的變化趨勢，第7天的活性最大，且遠大于其他各處理組；100 mg/kg NaF處理組整體上呈現(xiàn)“M”的變化趨勢，第1天的酶活性最低，且低于其它各處理組，在第2和6天出現(xiàn)2個極大值；200 mg/kg NaF處理組酶活性變化規(guī)律基本同100 mg/kg NaF處理組，但是幅度大于100 mg/kg NaF處理組。400 mg/kg NaF處理組變化趨勢較緩和，前4 d呈下降趨勢，后3 d的酶活性相似。

圖1 734的5齡幼蟲添食NaF后血液酪氨酸酶活性的變化Fig.1 Variations of tyrosinase activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori 734 after treatment with NaF

圖2 T6 的5齡幼蟲添食NaF后血液酪氨酸酶活性的變化Fig.2 Variations of tyrosinase activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori T6 after treatment with NaF

2.2 氟化物對家蠶中腸酪氨酸酶活性的影響

從圖3～4可見，氟化物敏感品種734對照組中腸酪氨酸酶活性在整個試驗期呈上下波動趨勢變化，第2和4 天均是極大值；50 mg/kg NaF處理組的酶活性前2 d下降，在3～4 d上升，且達到最大值，之后又呈波動型變化；100 mg/kg NaF處理組前4 d呈上升趨勢，最后3 d呈波動型變化，200 mg/kg NaF處理組前4 d和后3 d均呈現(xiàn)上升的趨勢，只是第5天的酶活性最低；400 mg/kg NaF處理組的酶活性變化較緩和，前3 d的酶活性略大于3 U，中間2 d的酶活性略小于7 U，最后2 d約11U，從整個實驗數(shù)據(jù)來看，最后4 d的酶活性大于前3 d的，而且變化幅度較大；耐氟品種T6對照組中腸酪氨酸酶活性在1～3 d相似，第4天是試驗期的最大值，最后3 d呈上升的變化趨勢；500 mg/kg NaF處理組前4 d呈直線上升，之后波折型變化；100 mg/kg NaF處理組前2 d酶活性相當，之后呈波折型變化，在第3和6天出現(xiàn)極大值；200 mg/kg NaF處理組前4 d和后3 d均呈上升趨勢，但第4 天的酶活性最大；400 mg/kg NaF處理組前4 d呈上升趨勢，后3 d波折型變化。

圖3 734的5齡幼蟲添食NaF后中腸酪氨酸酶活性的變化Fig.3 Variations of tyrosinase activity of midgut in 5th instar larvae of Bombyx mori 734 after treatment with NaF

圖4 T6的5齡幼蟲添食NaF后中腸酪氨酸酶活性的變化Fig.4 Variations of tyrosinase activity of midgut in 5th instar larvae of Bombyx mori T6 after treatment with NaF

2.3 不同濃度氟化物及氟化物處理后不同天數(shù)血液酪氨酸酶活性差異顯著性分析

734可分為對照組，低濃度添氟組(50、100 mg/kg NaF處理組)和高濃度添氟組(200、400 mg/kg NaF處理組)3組，對照組和低濃度添氟組之間差異不僅顯著，而且極顯著，而和高濃度添氟組之間的差異不顯著，2個高濃度添氟組之間差異顯著。T6對照組和最高濃度添氟組之間的差異不僅顯著而且極顯著，和100 mg/kg NaF處理組之間差異顯著(表1)。

734血液的酪氨酸酶活性在添氟后第4天與其添氟后第2、5、6和7天差異顯著，添氟后4 d和第6和7天差異極顯著。T6在添氟處理后第2天與添氟后第3、4和5天差異不僅顯著，而且極顯著。2品種添氟處理后之間的差異不顯著(表2)。

2.4 不同濃度氟化物及氟化物處理后不同天數(shù)中腸酪氨酸酶活性差異顯著性分析

734對照組和最高濃度添氟組之間差異顯著，50 mg/kg NaF處理組和400 mg/kg NaF處理組之間差異不僅顯著，而且極顯著。T6對照組和最高濃度添氟組之間差異顯著(表1)。

734添氟后1～2、3和5、4和6 d 3組之間差異顯著，組內(nèi)差異不顯著，第7天僅和第1、2、4 天之間的差異顯著，第2天和除1 d以外時間點差異極顯著，第4天和其它時間點差異極顯著。T6添氟后1、2和5 d、3和7 d、4和6 d 3組之間的差異不僅顯著，而且極顯著。2品種在添氟處理后的5 d差異顯著(表2)。

表1 734與T6添食不同濃度氟化物后血液和中腸酪氨酸酶活性多重比較

Table 1 Multiple comparison on activity variations of tyrosinase in hemolymph and midgut between 734 and T6 after treatment with different sodium fluoride

品種及添食NaF質(zhì)量濃度StrainandconcentrationofNaF血液酪氨酸酶活性差異顯著性Significantdifferenceoftyrosinaseactivityinhemolymph中腸酪氨酸酶活性差異顯著性SignificantdifferenceoftyrosinaseactivityinmidgutP<0.05P<0.01P<0.05P<0.01743,CKabcABCbcABT6,CKdeCDEaA743,50mg/kgNaFdeDEcBT6,50mg/kgNaFcdeBCDEabcAB743,100mg/kgNaFeEbcABT6,100mg/kgNaFabcABCDabcAB743,200mg/kgNaFbcdABCDEabABT6,200mg/kgNaFcdABCDEabAB743,400mg/kgNaFaAaAT6,400mg/kgNaFabABbcAB

注：表中不同小寫字母表示組間比較差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示組間比較差異極顯著(P<0.01)。下同。 Note:Different low-case letters in the table represent significant difference between different groups (P<0.05)，and the different upper-case letters represent extremely significant difference between different groups (P< 0.01). The same as below.

表2 734與T6添食NaF后不同時間段血液和中腸酪氨酸酶活性多重比較

Table 2 Multiple comparison on activity variations of tyrosinase in hemolymph and midgut at different time between 734 and T6 after treatment with sodium fluoride

品種及添食NaF天數(shù)StrainandthedaysaftertreatingwithNaF血液酪氨酸酶活性差異顯著性Significantdifferenceoftyrosinaseactivityinhemolymph中腸酪氨酸酶活性差異顯著性SignificantdifferenceoftyrosinaseactivityinmidgutP<0.05P<0.01P<0.05P<0.01743,1dbcdABCDaABT6,1dcdeABCDaA743,2dcdeCDaAT6,2deDaA743,3dbcdABCDbBCT6,3dabcABCbCD743,4dabABdFT6,4daAdEF743,5dcdeABCDbBCT6,5dabcdABCaAB743,6ddeCDcdDEFT6,6dcdeBCDdF743,7dcdeCDbcCDET6,7dcdeABCDbCD

3 討 論

酪氨酸酶在昆蟲的正常發(fā)育過程中具有重要的生理功能：①參與表皮的硬化和黑化；②對卵殼的鞣化作用；③參與傷害防御；④加速傷口的愈合[21]，是昆蟲體內(nèi)起主要免疫作用的氧化還原酶[22],當外來物入侵時，酪氨酸酶在外來物周圍沉積形成黑色素，通過包裹和黑化來限制入侵的外來物。另外在酪氨酸酶被激活過程中，還產(chǎn)生具有細胞毒作用的氧自由基和潛在細胞毒作用的半醌及三羥酚，進一步增強寄主的防御能力[23]。

本實驗對不同家蠶品系添食NaF，檢測其血液和中腸的酪氨酸酶活性，在血液中，氟化物敏感品種734添氟組約是對照組的0.79～1.71倍，耐氟品種T6添氟組約是對照組的0.59～0.96倍。T6添氟處理后以及734的400 mg/kg NaF處理組的酪氨酸酶活性均低于對照組，而734的其它添氟組的酶活性反而高于對照組，原因可能與酪氨酸酶的化學結(jié)構(gòu)有關(guān)，它是一種以Cu“為輔助因子的金屬酶，每一個亞基含2個金屬銅離子，2個銅離子分別與蛋白質(zhì)分子中2個平展的組氨酸和一個弱的直立組氨酸配體結(jié)合，另有一個內(nèi)源橋基將2個銅離子聯(lián)系在一起，構(gòu)成酪氨酸酶催化氧化反應活性中心[24]。當家蠶食有可溶性的NaF后，通過其消化、吸收等作用，氟離子以游離的狀態(tài)存在于家蠶體內(nèi)，這種非金屬性較強的離子會和一些蛋白質(zhì)或者金屬陽離子結(jié)合，形成絡合物或者較為穩(wěn)定的鹽，進而被代謝。由于酪氨酸酶是以銅離子為輔基的酶類，可能氟離子與銅離子競爭性結(jié)合之后，降低了酪氨酸酶活性，這種復合物進而被代謝。734對照組和2個低濃度添氟組(50、100 mg/kg NaF處理組)之間差異極顯著，而和2個高濃度添氟組之間的差異不顯著，2個高濃度添氟組之間差異顯著。T6對照組和最高濃度添氟組之間的差異極顯著。

在中腸中，734添氟組是對照組的0.60～1.16倍，T6添氟組是對照組的1.23～1.62倍。T6和734的2個低濃度添氟組的酪氨酸酶活性均大于對照組，而734的2個高濃度添氟組的酶活性低于對照組。由于中腸是各種毒物較早接觸的器官，故NaF刺激家蠶體內(nèi)免疫體系，發(fā)生防御性免疫反應，產(chǎn)生更多的酪氨酸酶(或提高了體內(nèi)的酶活性)，從而生成更多黑色素包被[19]。734在高濃度的NaF作用下，嚴重擾亂了酶的代謝系統(tǒng)[25]，表現(xiàn)出酪氨酸酶活性降低。再者酪氨酸酶是一個很大的酶系，其在昆蟲的不同種類以及昆蟲的不同部位、不同發(fā)育時期的表達不同。734、T6對照組和最高濃度添氟組之間差異顯著(P<0.05)。

本實驗表明，NaF對耐氟品種T6血液酪氨酸酶活性起抑制作用，而對中腸酪氨酸酶活性起促進作用。敏感品種734的酪氨酸酶活性因NaF濃度的高低表現(xiàn)出不同的活性。推測家蠶酪氨酸酶活性與蠶體的耐氟性能有一定的相關(guān)性，而這種酶在家蠶對氟化物代謝過程中的作用機理尚不清楚，有待進一步研究。

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(責任編輯 陳 虹)

Effects of Fluoride on Activity of Tyrosinase in Hemolymph and Midgut ofBombyxmori

MI Zhi1,2, ZENG Biao1,XU Shui1, ZHU Yong1*

(1.College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2.College of Life Science, Shanxi Datong University, Shanxi Datong 037009, China)

In order to explore the effects of NaF on the metabolic mechanism of silkworm (Bombyxmori) , the fluoride-resistant silkworm variety T6 and the fluoride-sensitive variety 734 were used as materials, the silkworm larvae from the first day of fifth instar with mulberry leaves soaked in 50, 100, 200 and 400 mg/kg NaF solutions were fed, respectively, and the tyrosinase activity in the silkworm’s hemolymph and midgut were examined. The results showed that the activity of tyrosinase in hemolymph was 0.79-1.71 times in 734 strain and 0.58-0.96 times in T6 strain compared with control group, respectively. The 734 strain tyrosinase activities of the two lower concentration(50, 100 mg/kg)NaF-treated groups and the control group were extremely significantly different(P<0.01), and their two higher concentration NaF-treated groups performed significant differences(P<0.05); T6’s control group and the highest concentration NaF-treated groups performed extremely significant differences. In midgut, the activities of tyrosinase in 734 strain were 0.60-1.16 times and in T6 strain 1.23-1.62 times compared with control group, and 734, T6’s control group and their highest concentration NaF-treated groups were significantly different(P<0.05). The activity fluoride-sensitive variety’s tyrosinase showed difference with feeding different concentrations of NaF. Fluoride could decrease the tyrosinase activity in the fluoride-resistant silkworm’s hemolyph but increase the activity in midgut. This results indicated that the tyrosinase activity had a certain relationship with the fluoride-resistant to silkworm.

Bombyxmori; Fluoride; Hemolymph; Midgut; Tyrosinase

1001-4829(2016)11-2763-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.046

2015-11-16

重慶市重大攻關(guān)項目(CSTC，2009AA1024)；山西大同大學博士科研啟動資金

米 智(1985-)，男，山西大同人，博士，講師，從事家蠶遺傳育種研究，E-mail:mizhi775@126.com，*為通訊作者：朱 勇，教授，博士生導師，E-mail: zhuy@swu.edu.cn。

S851.34+7.31

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