焦 展，安勝軍*，邵鐵梅，仵 陶，李 雪，劉 培，高維娟，柴錫慶

(1.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術學院，河北省高校生物反應器與蛋白類藥物開發(fā)應用技術研發(fā)中心，河北 石家莊 050026；2.河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050200)

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油葵轉化體系建立和重組人胰島素的初步表達

焦 展1，安勝軍1*，邵鐵梅1，仵 陶1，李 雪1，劉 培1，高維娟2，柴錫慶1

(1.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術學院，河北省高校生物反應器與蛋白類藥物開發(fā)應用技術研發(fā)中心，河北 石家莊 050026；2.河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050200)

為建立并研究利用油葵油體表達系統(tǒng)表達重組人胰島素蛋白的方法，采用PCR技術構建植物種子特異性表達載體，經(jīng)花粉管通道用重組人胰島素基因轉化油葵。利用PCR法檢測目的基因的轉化情況，用SDS-PAGE和Western blot對胰島素蛋白的表達進行鑒定。結果表明，合成了重組人胰島素與花生油體蛋白融合基因，并獲得植物種子特異性表達載體pBINOI?；ǚ酃芡ǖ擂D化油葵的適宜條件為，花柱剪切1/2，質(zhì)粒濃度為50～100 ng/μl轉化效率最高。PCR結果顯示，油葵花粉管通道法轉胰島素基因總轉化率為3.2 %，溫室轉化率(5.20 %)高于大田轉化率(1.12 %)。獲得T1～T5代轉基因種子，播種為T1～T5代植株。獲得的1號轉基因株系T5代植株陽性/陰性植株為11∶1。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析和Western blot檢測結果顯示，融合蛋白約為23 kDa，重組人胰島素基因在油葵種子中得到了表達。本實驗建立了轉基因油葵油體表達系統(tǒng)，且該系統(tǒng)能夠成功表達重組人胰島素。

轉基因油葵；花粉管通道；重組人胰島素；融合表達

胰島素(Insulin)是治療糖尿病的主要藥物。為開發(fā)更安全高效的胰島素蛋白生產(chǎn)方式，利用植物生物反應器替代微生物發(fā)酵方法已被研究者廣泛重視[1]，而植物油體表達系統(tǒng)具有蛋白高表達且易分離的特點，可降低產(chǎn)物下游分離純化的生產(chǎn)成本[1-3]。

油葵，即油用向日葵(HelianthusannuusL.)，是我國主要油料作物之一。目前，向日葵基因轉化已有一些報道[4-7]，研究中大部分依賴農(nóng)桿菌介導的組織培養(yǎng)方法[8-12]。少數(shù)研究利用直接導入法進行轉化，但由于原生質(zhì)體再生困難或穩(wěn)定整合率低，未能達到理想效果[13-14]。利用向日葵表達重組蛋白的研究雖有涉及[15-17]，但利用油用向日葵成功完整表達重組藥用蛋白的研究，還未見報道。其主要原因之一在于，油葵是通過再生手段獲得轉基因植株較難的作物之一，再生和轉化效率很大程度受到基因型限制，且組織培養(yǎng)過程中常伴有“早花”現(xiàn)象。為避免這些不利因素，本研究將人胰島素基因與花生油體蛋白基因構建為融合基因，并獲得植物表達載體pBINOI，通過非組培再生的花粉管通道法對油葵進行轉化，利用油葵油體表達系統(tǒng)，實現(xiàn)重組人胰島素蛋白的表達，以期為利用基因工程技術依靠植物生物反應器生產(chǎn)重組蛋白開拓新的途徑，并為其它植物基因工程育種研究提供參考。

表1 引物序列

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗采用油葵羅馬尼亞“精選”恢復系為材料，由河北省半干旱研究中心提供。根 癌 農(nóng) 桿 菌 (Agrobacteriumtumefaciens) 菌株LBA4404由本實驗室保存，植物表達載體pBINOI由本實驗室構建。

1.2 試驗方法

1.2.1 質(zhì)粒提取方法 質(zhì)粒的提取方法參照文獻[18]。將質(zhì)粒溶于純水中，導入液終濃度約為10～300 ng/μl。

1.2.2 花粉管通道轉化法 采用柱頭滴加法進行轉化。在人工授粉后3～6 h，管狀花的羽狀柱頭萎蔫，表示授粉已經(jīng)完成。用剪刀減去已萎蔫的柱頭，用25 μl微量進樣器在花柱上滴質(zhì)粒DNA溶液3～5 μl。為了防止質(zhì)粒DNA液蒸發(fā)，可以重復滴加1次。操作時將質(zhì)粒DNA溶液置于冰浴中保存，以免被DNA酶降解。

柱頭剪切程度試驗中，授粉后6 h，分別設不剪切花柱(0)、剪掉萎蔫柱頭(約剪掉1/4花柱)、剪掉1/2花柱(1/2)和剪掉全部花柱(1)4個處理。質(zhì)粒濃度試驗中，取濃度為10～300 ng/μl質(zhì)粒分別注射油葵管狀花。每處理5個花盤，重復3次。收獲后統(tǒng)計結實率(結實率=結籽小花數(shù)/注射小花數(shù)×100 %)。將結實種子全部播種，長出植株取葉片提取基因組，經(jīng)PCR檢測，統(tǒng)計T1代植株陽性率(T1代植株PCR陽性率=T1代PCR陽性植株數(shù)/T1代植株總數(shù)×100 %)。

1.2.3 DNA提取和PCR檢測 DNA的提取采用SDS法 (參照賴相紅的方法[19])。根據(jù)目的基因胰島素序列，設計特異性引物(引物序列見表1)，擴增產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 油葵種子油體蛋白的提取 參照文獻[20]的方法，取轉化油葵種子，液氮研磨，加入提取液，4 ℃，10 000 g離心，取上層油層，得到沉淀加入20 mmol Tris-HCl(pH 8.0)和2 %SDS的混合提取液溶解，備用。

1.2.5 油葵種子油體蛋白SDS電泳檢測和Western blot 檢測 將提取的油體蛋白，進行15 %的SDS-PAGE電泳分析和Western blot分析。采用PVDF膜進行電泳轉膜，轉膜完畢后用TBST漂洗，10 min×5次，后用5 %的脫脂奶粉封閉1 h，再次漂洗3次，加入1∶1000比例稀釋的鼠抗人胰島素單克隆一抗，4 ℃過夜，次日室溫孵育1 h后，用TBST漂洗，10 min×5次，再加入1∶2000比例的羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，再用TBST漂洗10 min×5次。最后加入ECL發(fā)光液，在暗室中曝光，顯影5 min，定影5 min。觀察分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用Excel和DPS7.05軟件處理，顯著水平P=5 %。

2 結果與分析

2.1 載體的構建

采用PCR方法擴增了油菜油體蛋白基因啟動子(NOP)，將該啟動子插入pUC19的HindIII和BamH I酶切位點之間得到pUCN。同時依據(jù)人胰島素基因序列和油葵偏愛的密碼子設計并人工合成了人胰島素基因，并將該合成的基因插入花生油體蛋白基因(Ole)的3’末端，獲得花生油體蛋白和人胰島素融合基因，同時在花生油體蛋白基因和人胰島素基因之間添加了胰蛋白酶識別序列Klip27。進而將該融合基因插入pUCN的BamH I和SacI酶切位點之間得到pUCNOI，HindIII和SacI雙酶切pUCNOI，瓊脂糖凝膠回收1779 bp的外源片段，并將該外源片段插入植物雙元表達載體pBI121的HindIII和SacI酶切位點之間，獲得植物表達載體pBINOI[21]。pBINOI的表達盒為以油菜油體蛋白基因啟動子(NOP)驅動的Ole-Klip27-insulin融合基因，pBINOI結構如圖1所示。

1:油菜油體蛋白基因啟動子; 2:花生油體蛋白基因; 3:KLIP-27; 4:人胰島素基因圖1 pBINOI結構Fig.1 Structure of pBINOI

2.2 花粉管通道法轉化油葵的條件優(yōu)化

花粉管通道法轉化油葵過程中，質(zhì)粒濃度和管狀花花柱剪切程度對果實結實率和轉化效率有不同程度的影響。如圖2所示，當質(zhì)粒濃度逐漸升高，在10 和50 g/μl時結實率較高，為50 % 以上；而100和200 ng/μl時，結實率有所降低；至300 ng/μl時，結實率最低，僅為33.64 %。而質(zhì)粒濃度在50 和100 ng/μl時，轉化率較高，且與10和300 ng/μl的轉化率差異顯著。綜合考慮結實率和轉化率，并從經(jīng)濟的角度考慮，50～100 ng/μl是花粉管通道法轉化油葵的適宜質(zhì)粒濃度。

柱頭剪掉的程度會影響轉化效率，但剪掉過多會嚴重影響結實率。因此，比較了不剪柱頭、剪掉1/4、剪掉1/2和全部剪掉僅留子房對轉化和結實的影響(圖3)。結果表明，柱頭剪掉1/2對轉化最為有利，結實率較高，且轉化率最高，可達12. 89 %。

2.3 花粉管通道法轉胰島素基因油葵的獲得及其遺傳特性

同一指標不同字母表示差異顯著(P<5 %)圖2 質(zhì)粒濃度對花粉管通道法轉化油葵的影響Fig.2 Effect of plasmid concentration on gene transformation via pollen-tube pathway in Oil Sunflower

同一指標不同字母表示差異顯著(P<5 %)圖3 花柱剪切程度對花粉管通道法轉化油葵的影響Fig.3 Effect of shearing degree of the style on gene transformation via pollen-tube pathway in Oil Sunflower

攜帶胰島素基因的質(zhì)粒進行花粉管通道轉化。大田操作共轉化油葵30個花盤，每個花盤大約轉化小管狀花200朵，共得到T1代種子約2500粒。溫室操作共轉化油葵100個花盤，每個花盤大約轉化小管狀花20～30朵，共得到T1代種子1000粒。將這些種子播種，取T1代幼苗的幼嫩葉片提取基因組，經(jīng)PCR檢測共獲得80株PCR陽性植株，總轉化率為3.2 %。其中大田獲得28株，溫室獲得52株。轉化率分別為1.12 % 和5.2 %。單株收獲T1代植株結實的種子(T2種子)，從中選擇9個株系，每株系隨機選擇48粒進行播種。取T2植株幼嫩葉片進行基因組提取和PCR檢測，結果均檢測到陽性植株。但是這些株系T2代植株陽性與陰性的比例不盡相同(表2)。經(jīng)卡方適合性檢驗，除1號近似分比例分別為10∶1、1∶1、1∶2和1∶2。類似，隨機播種陽性株系后代，T4～T5代PCR數(shù)據(jù)顯示，各株系陽性植株與陰性植株的比例明顯不同，后代遺傳分離現(xiàn)象很明顯(表3)。有些T5代植株陽性/陰性高的可達11∶1，最低僅為1∶11。僅有少數(shù)株系能比例較大的遺傳胰島素基因。研究中還沒能確定轉胰島素基因純和株系,PCR檢測結果如圖4所示。

1,2 轉胰島素基因T1代陽性植株;3,4 轉胰島素基因T2代陽性植株;5,6 轉胰島素基因T3代陽性植株;7,8 轉胰島素基因T4代陽性植株;9,10轉胰島素基因T5代陽性植株;11,12 非轉基因植株;13陽性對照;14陰性對照離比例為3∶1外，其它編號轉基因后代的遺傳分離比例都不符合孟德爾遺傳規(guī)律，而且有的陽性比例很低，僅為1∶4。1-1號、2-1號、3-1號、9-1號為相應的1號，2號，3號和9號的陽性子代，其陽性/陰性圖4 花粉管通道轉化法轉胰島素基因油葵植株PCR檢測電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of insulin gene transgenic plants by PCR via pollen-tube pathway in Oil Sunflower

號碼No.播種數(shù)目Numberofsowing死亡數(shù)目Numberofdeath陽性植株數(shù)目Numberofpositiveplants陰性植株數(shù)目Numberofnegativeplants近似比例Approximateproportion148234123∶1248024241∶1348028201∶1448019292∶3548018302∶364008321∶4748016321∶2848012361∶3948023251∶1

表3 花粉管通道法轉化油葵后代植株PCR陽性/陰性分析

2.4 油葵轉化植株種子的SDS-PAGE和Western blot檢測

以植株后代PCR檢測陽性率較高的1號株系T5代種子提取油體蛋白，進行15 %的SDS-PAGE電泳檢測分析，可見23 kDa處有一明顯條帶，而非轉基因種子此處無條帶。該條帶大小與油體和胰島素形成的融合蛋白大小相一致。另外，轉化油葵的油體蛋白泳道在5 kDa左右有明顯條帶，該條帶與胰島素標準品位置近似，而非轉基因種子無此條帶(圖5)。經(jīng)用胰島素單克隆抗體對其免疫原性進行Western blot分析，結果顯示，泳道1的非轉基因油葵種子沒有看到雜交條帶，而泳道2、3的轉基因種子中表達的融合蛋白(23 kDa)具有胰島素的免疫原性，其大小與油體和胰島素形成的融合蛋白大小相一致，泳道4、5為胰島素蛋白標準品。證明重組胰島素基因融合蛋白在油葵轉基因種子中得到了表達(圖6)。

3 討論與結論

油葵是通過組織培養(yǎng)再生途徑較難實現(xiàn)轉化的植物。本研究利用油葵油體系統(tǒng)表達胰島素蛋白基因，通過花粉管通道轉化方法已得到PCR陽性植株，免除了組織培養(yǎng)過程中受到的低再生率和低轉化率的限制。

M：蛋白質(zhì)分子marker；1：胰島素蛋白標準品2：非轉化油葵種子油體蛋白；3：轉化油葵種子油體蛋白圖5 SDS-PAGE分析油葵種子油體蛋白的表達Fig.5 Expression of oil body protein in Oil Sunflower seeds by SDS-PAGE

花粉管通道轉化法導入外源DNA的關鍵因素在于精確掌握受體植物的受精過程及時間規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)，與大田操作相比，溫室操作更容易獲得陽性植株。原因可能是溫室條件容易控制，而油葵開花季節(jié)大田溫度較高，質(zhì)粒容易降解從而影響轉基因效率。此外，如果試驗中加大轉基因樣本，則推測篩選出純系的可能性會增大。外源基因的導入具有很大的隨機性，和染色體配對完全不同?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD化應采取導入植株的單株記錄，單株擴種檢驗，獲得含目的基因的后代[18]。筆者也遵循這一原則進行試驗和后代的統(tǒng)計分析。然而，花粉管通道轉化法得到的結果證明，只有1號株系T2代陽性/陰性符合3∶1，該株系T3代陽性比例很大(11∶1)但也依然沒有篩選到全陽株系。而其他編號的T2至T5代植株均不符合孟德爾遺傳規(guī)律，僅少數(shù)株系能比例較大的遺傳胰島素基因。原因可能是，花粉管通道法屬于種質(zhì)系統(tǒng)介導的轉化方法，其中有表現(xiàn)3∶1的分離方式，但是占總數(shù)中的比例較少。這可能由于外源DNA結構變異較大，整合位點相對較多，因此在有性繁殖過程傳遞的遺傳規(guī)律比較復雜，穩(wěn)定性也相對較差[18]。但是，研究中發(fā)現(xiàn)，有的株系上代陽性比例較高，后代陽性比例也相對較高。因而，轉基因純系的獲得還需要對T2代1號株系的其他后代播種進行跟蹤研究，分析遺傳組成；并播種新的轉基因后代種子，篩選其他T2代符合3∶1分離比例的株系，以期獲得陽性純合株系。另外，還可對轉基因植株進行基因整合，蛋白表達等相關研究，從而為后期胰島素蛋白的表達以及蛋白的提取純化的研究奠定基礎。

下游的提取和純化成本高是植物轉化系統(tǒng)生產(chǎn)藥用蛋白最主要的限制因素。利用油體系統(tǒng)表達重組蛋白，由于油體蛋白鑲嵌在油體上，利用油體親脂疏水的特性，將轉基因植物種子經(jīng)粉碎→液體抽提→離心處理，回收上層油相即可將融合蛋白與細胞內(nèi)其它組分分開，可去除90 %以上的種子蛋白。獲得油體后，利用內(nèi)切蛋白酶將目的蛋白與油體蛋白分開，通過再純化，分離獲得目的蛋白，從而顯著降低目的蛋白的分離純化成本。這是利用植物系統(tǒng)生產(chǎn)重組外源蛋白的有效途徑[2]。目前，國內(nèi)外研究中已有利用油體表達系統(tǒng)成功獲得重組蛋白的先例[1, 22-24]。本研究利用油葵油體系統(tǒng)表達重組人胰島素，實驗證明，胰島素基因導入油葵后，融合基因能夠在油葵中得到表達。但是胰島素蛋白的表達量，不同世代間蛋白表達的差異和穩(wěn)定性，以及重組胰島素蛋白的功能活性有待進一步研究。

1.非轉化油葵種子油體蛋白；2，3.轉化油葵種子油體蛋白(融合蛋白)；4，5.胰島素蛋白標準品圖6 Western blot 分析油葵種子中的胰島素融合蛋白的表達Fig.6 Expression of insulin fusion protein in Oil Sunflower seeds by Western blot

本試驗成功構建植物種子特異性胰島素融合蛋白表達載體pBINOI?；ǚ酃芡ǖ擂D化油葵的適宜條件為，花柱剪切1/2，質(zhì)粒濃度為50～100 ng/μl轉化效率最高。PCR結果顯示，油葵花粉管通道法轉胰島素基因總轉化率為3.2 %，溫室轉化率(5.20 %)高于大田轉化率(1.12 %)。獲得T1～T5代轉基因種子，播種為T1～T5代植株。獲得的1號轉基因株系T5代植株陽性/陰性植株為11∶1。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析和Western blot檢測結果顯示，融合蛋白約為23kDa，重組人胰島素基因在油葵種子中得到了表達。

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(責任編輯 陳 虹)

Establishment of Genetic Transformation System and Primary Expression of Recombinant Human Insulin in Oil Sunflower

JIAO Zhan1，AN Sheng-jun1*， SHAO Tie-mei1， WU Tao1， LI Xue1， LIU Pei1， GAO Wei-juan2， CHAI Xi-qing1

(1.Center of Bioreactor and Protein Drug Research and Development of Hebei Universities, Hebei Chemical &Pharmaceutical College, Hebei Shijiazhuang 050026,China; 2.Hebei University of Chinese Medicine, Hebei Shijiazhuang 050200, China)

In order to establish and study the expression of recombinant human insulin in Oil Sunflower oil body expression system, plant seed-specific expression vector was constructed by PCR technique, and recombinant human insulin gene was introduced into Oil Sunflower via pollen tube pathway. Insulin gene was detected by PCR, and the expression of insulin in Oil Sunflower was detected by SDS-PAGE and Western blot. The result showed that recombinant human insulin fusion gene was synthesized, and seed-specific expressed vector pBINOI was obtained. 1/2 shearing of the style and 50-100 ng/μl of plasmid concentration were the suitable conditions of genetic transformation via pollen tube pathway. The result of PCR indicated that the total transgene rate of the insulin genetic transformation in Oil Sunflower via pollen tube pathway was 3.2 % and the transgene rate in glassroom (5.20 %) was higher than that in field(1.12 %). The transgenic seeds of T1-T5generation were obtained, which grew into plants of T1-T5generations. The approximate proportion of positive plants/negative plants of T5generation of No.1 plant line was 11∶1. The results of SDS-PAGE and Western blot showed that fusion protein was estimated to be 23kDa, and recombinant human insulin gene was successfully expressed in Oil Sunflower seeds. It was concluded that the transgenic Oil Sunflower oil body system was established in this experiment. It could be used effectively for expressing recombinant human insulin.

Transgenic Oil Sunflower; Pollen tube pathway; Recombinant human insulin; Fusion expression

1001-4829(2016)11-2682-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.031

2015-11-11

河北省高等學?？茖W技術研究重點項目“利用轉基因亞麻懸浮細胞表達阿樸脂蛋白米蘭突變體”(ZD2014087)；河北省高等學?？茖W技術研究重點項目“植物生物反應器的方法生產(chǎn)Reteplase的研究與開發(fā)”(ZD2010216)

焦 展(1982-)，女，河北趙縣人，碩士，講師，研究方向：植物組織培養(yǎng)和轉基因研究,E-mail:jiaozhan959@126.com, *為通訊作者：安勝軍，教授，從事植物生物反應器與蛋白類藥物生產(chǎn)相關研究，E-mail:anshjun@yahoo.com。

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