陳仕勇，馬 嘯，張昌兵，陳智華，李世丹，鄭經(jīng)紅

(1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 611130；3. 四川省草原科學(xué)研究院，四川 成都 611731)

?

川西北牧區(qū)7個(gè)披堿草屬新品系遺傳變異分析

陳仕勇1，馬 嘯2*，張昌兵3，陳智華1，李世丹1，鄭經(jīng)紅1

(1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 611130；3. 四川省草原科學(xué)研究院，四川 成都 611731)

本研究采用RAPD標(biāo)記對(duì)來(lái)自川西北高寒牧區(qū)7個(gè)披堿草屬新品系共11份材料進(jìn)行遺傳多樣性和種間關(guān)系分析。試驗(yàn)篩選出的14條引物對(duì)11份供試材料進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，結(jié)果共擴(kuò)增出255條帶，其中多態(tài)性的條帶數(shù)為201條，多態(tài)性條帶比率為78.82 %。材料間的遺傳相似系數(shù)變幅為0.497～0.962，平均值為0.714。聚類分析結(jié)果能夠明顯將老芒麥和垂穗披堿草材料分開(kāi)，同時(shí)揭示了不同新品系之間的遺傳親緣關(guān)系。其中垂穗披堿草組中Z0056與其它垂穗披堿草材料間遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)；老芒麥組中的供試材料之間的遺傳關(guān)系都較近，其遺傳背景比較狹窄。本研究結(jié)果將為川西北優(yōu)良老芒麥和垂穗披堿草種質(zhì)的鑒定、新種質(zhì)創(chuàng)制及育種工作提供理論依據(jù)。

川西北；老芒麥；垂穗披堿草；RAPD；遺傳變異

川西北高原牧區(qū)位于青藏高原東緣，地處四川省的西北部，與甘肅、青海、西藏相鄰。它不僅是我國(guó)五大牧區(qū)之一，而且還是我國(guó)藏族等少數(shù)民族的主要聚居地區(qū)。草地畜牧業(yè)是川西北高寒牧區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)支柱，而牧草則是發(fā)展草地畜牧業(yè)的基礎(chǔ)。但是目前川西北牧區(qū)當(dāng)家的牧草如老芒麥、垂穗披堿草等品種相對(duì)較少，一些品種在推廣應(yīng)用中還出現(xiàn)了不同程度的退化，而新品種的育種進(jìn)程較慢，遠(yuǎn)不能滿足草地畜牧業(yè)發(fā)展與生態(tài)建設(shè)的需要，亟待加快老芒麥、垂穗披堿草等優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)飼草品種的選育工作。

老芒麥(ElymussibiricusL.)別名西伯利亞披堿草，是禾本科披堿草屬的模式種。同時(shí)它為多年生疏叢型的異源四倍體禾草，具有StStHH的染色體組構(gòu)成[1-2]。老芒麥一般生長(zhǎng)于濕潤(rùn)的草地、河灘、灌木叢中或森林邊緣地帶。在我國(guó)主要分布在青藏高原、內(nèi)蒙古以及新疆等地區(qū)[1,3]。因其具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗寒、粗蛋白高、易栽培等優(yōu)良特性，被用于建植人工草地，對(duì)退化草地改良和種草養(yǎng)畜具有重要意義[4]。垂穗披堿草(ElymusnutansGriseb.)又名鉤頭草、彎穗草也是禾本科披堿草屬的植物。它是多年生疏叢型的異源六倍體禾草，其染色體組構(gòu)成為StStYYHH，在我國(guó)主要分布于西北、西南、華北各省[1-2]。垂穗披堿草具有廣泛的生長(zhǎng)可塑性和極強(qiáng)的抗寒性和抗旱性，從灘地、溝谷、陰坡山麓地帶到灌叢草甸和高山草甸均能生長(zhǎng)[3,5-6]。它與老芒麥都是高寒牧區(qū)的重要的牧草，為生態(tài)恢復(fù)和草地畜牧業(yè)發(fā)展均有重要的意義。目前老芒麥和垂穗披堿草的育種工作落后，不能滿足生態(tài)和生產(chǎn)需要。同時(shí)育種手段單一，尤其對(duì)材料的遺傳背景和親緣關(guān)系等的了解較少。

表1 供試材料

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是利用人工合成的隨機(jī)引物(一般為10 bp)對(duì)供試的模板基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，以反映全基因組DNA的多態(tài)性，具有快速、簡(jiǎn)便、成本低的特點(diǎn)[7]。目前已廣泛應(yīng)用于品種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳圖譜構(gòu)建等方面[8-10]。本研究采用RAPD技術(shù)對(duì)川西北高寒牧區(qū)7個(gè)品系的11份材料進(jìn)行遺傳多樣性和種間關(guān)系研究，旨在為高寒牧區(qū)的優(yōu)質(zhì)老芒麥和垂穗披堿草的種質(zhì)鑒定及新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為來(lái)自于川西北高寒牧區(qū)的7個(gè)披堿草屬新品系，包括3份垂穗披堿草(Elymusnutans)新品系和4份老芒麥(E.sibiricus)新品系。另外包括國(guó)審品種甘南垂穗披堿草、川草2號(hào)老芒麥。供試材料由四川省草原科學(xué)研究院提供，供試材料的具體情況如表1所示。

1.2 RAPD分析

1.2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增 在試驗(yàn)地小區(qū)隨機(jī)采取10株植物的葉片混合在液氮中研磨成粉末，并采用改良的CTAB法[11]提取基因組DNA。對(duì)所提取的DNA樣品采用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行純度和濃度的檢測(cè)。

擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μl：0.2 mM dNTPs, 0.75 μM引物，2.5 mM Mg2+，10 ×Taqbuffer，1 UTaqDNA 聚合酶，20 ng模板DNA。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共45個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖凝膠(含有0.1 mg/mL的溴化乙錠)上用0.5 × TBE 緩沖液進(jìn)行電泳分離2.5 h，并用BIO-RAD自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 將RAPD實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的每一個(gè)條帶均視為一個(gè)位點(diǎn)，然后統(tǒng)計(jì)本研究中擴(kuò)增的總位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)。按照條帶的有、無(wú)分別進(jìn)行賦值，有帶的記為1，無(wú)帶的則記為0。本研究中供試材料間的遺傳相似系數(shù)(Genetic similarities，GS)則按照Nei-Li的方法進(jìn)行計(jì)算[12]。其相關(guān)的計(jì)算公式為：GS=2Nij/(Ni+Nj)，其中Nij為供試物種材料i和j中共有的擴(kuò)增位點(diǎn)的數(shù)目，Ni表示材料i中出現(xiàn)的擴(kuò)增位點(diǎn)的數(shù)目，Nj代表材料j中出現(xiàn)的擴(kuò)增位點(diǎn)的數(shù)目。另外，在分析軟件NTSYS 2.1中，根據(jù)不同材料間的遺傳相似系數(shù)GS值采用不加權(quán)成對(duì)群算術(shù)平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)進(jìn)行聚類分析和主成分分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性

從供試的RAPD引物中共篩選選出了14條條帶清晰且重復(fù)性好的的引物進(jìn)行進(jìn)一步地?cái)U(kuò)增，結(jié)果一共擴(kuò)增得到255條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為201條，多態(tài)性條帶比率為78.82 %。本研究中所擴(kuò)增的DNA片段大小均在2000～200 bp (圖1)。其中平均每個(gè)引物所獲得的條帶數(shù)為18.21條，變幅為15～26條；平均多態(tài)性的條帶數(shù)為14.35條，變幅為10～23條(表2)。這也表明在本研究中RAPD標(biāo)記能夠檢測(cè)出較多的遺傳位點(diǎn)。

表2 RAPD引物序列及擴(kuò)增結(jié)果

圖1 RAPD擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig.1 PCR amplification patterns

圖2 11份材料基于遺傳相似系數(shù)GS的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 11 materials based on genetic similarity coefficients

2.2 遺傳相似系數(shù)

對(duì)RAPD分子標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果采用Nei-Li遺傳相似系數(shù)(GS值)分析材料間的遺傳關(guān)系。供試的11份材料間的GS值在0.497～0.962，平均GS值為0.714。垂穗披堿草0056和老芒麥E03025之間的遺傳相似系數(shù)最小為0.497，遺傳距離最大。老芒麥E03044與E03025之間的遺傳相似系數(shù)最大為0.962，遺傳距離最小。從遺傳相似系數(shù)比較可以看出老芒麥和垂穗披堿草種間的遺傳相似系數(shù)差異較明顯，遺傳距離較大。在4份垂穗披堿草材料中，GS值在0.769～0.922，平均值為0.840。在7份老芒麥材料中，GS值在0.883～0.962，平均值為0.922。遺傳相似系數(shù)的分析結(jié)果表明了老芒麥和垂穗披堿草的各品系之間具有較高的遺傳相似系數(shù)，遺傳距離較近，親緣關(guān)系也較近。同時(shí)也可以看出不同物種的各個(gè)品系之間存在變異，但是變異程度較低，遺傳多樣性水平較低。

2.3 聚類分析和主成分分析

基于遺傳相似系數(shù)GS值對(duì)11份材料進(jìn)行UPGMA聚類分析。從聚類圖(圖2)上可以明顯將11份材料分成老芒麥和垂穗披堿草組兩類。垂穗披堿草組中Z0056與其它關(guān)系較遠(yuǎn)，其遺傳背景與其他垂穗披堿草材料的差異較大，這可能與它來(lái)自生態(tài)地理位置相對(duì)較遠(yuǎn)的稻城有關(guān)。這也表明Z0056可以作為雜交育種的備選親本材料。在老芒麥組中，各個(gè)材料都表現(xiàn)了很近的親緣關(guān)系，這也反應(yīng)了供試的老芒麥的遺傳背景差異不大，相似程度較高。這可能因?yàn)樗鼈兺瑏?lái)自紅原、若爾蓋生態(tài)地理環(huán)境都非常的相似，甚至有些材料來(lái)自同一地點(diǎn)。對(duì)11份材料基于遺傳相似系數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，主成分圖(圖3)更能直接表現(xiàn)各個(gè)材料的遺傳關(guān)系。在圖中位置較近的關(guān)系較密切，位置較遠(yuǎn)則關(guān)系較疏遠(yuǎn)。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

3 討 論

本研究采用14條引物共擴(kuò)增出255條帶，其中201條為多態(tài)性條帶，對(duì)老芒麥和垂穗披堿草2個(gè)物種11份材料的255個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)。這也體現(xiàn)出分子數(shù)據(jù)具有比形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記更多的信息和更高的標(biāo)記效率，是物種遺傳多樣性研究中最為有效的手段。本研究中RAPD揭示的多態(tài)性條帶比率為78.82 %，高于李小雷等[14]研究加拿大披堿草和肥披堿草及雜種關(guān)系的72.1 %，以及王樹(shù)彥等[15]研究加拿大披堿草和老芒麥及雜種關(guān)系的61.29 %，但低于周永紅等[2]對(duì)10個(gè)披堿草屬物種進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析的81.6 %，也低于楊瑞武等[16]對(duì)披堿草屬、鵝觀草屬和猬草屬模式種親緣關(guān)系分析的88.62 %。這與本研究選用的物種和材料較少而且親緣關(guān)系較近有關(guān)，同時(shí)也說(shuō)明RAPD標(biāo)記適合于披堿草屬物種遺傳多樣性及系統(tǒng)學(xué)的研究。

圖3 11份材料基于遺傳相似系數(shù)GS的主成分分析圖Fig.3 The principal coordinate analysis of 11 materials based on GS data

本研究中RAPD分析能明顯將老芒麥和垂穗披堿草按照倍性進(jìn)行區(qū)分。周永紅等[2]等同樣采用RAPD分析10個(gè)披堿草屬物種，聚類結(jié)果將供試材料按照倍性進(jìn)行了區(qū)分，與本研究得到了相似的結(jié)果。李永祥等[17]采用ISSR和SSR對(duì)披堿草屬的12個(gè)物種進(jìn)行分析，聚類分析結(jié)果將12份材料主要按照穗狀花序形態(tài)進(jìn)行了劃分，并沒(méi)有按照物種的倍性進(jìn)行區(qū)分。這可能是因?yàn)椴煌姆肿訕?biāo)記具有不同的特點(diǎn)，可以提供不同的材料間信息。這可能也說(shuō)明RAPD標(biāo)記在鑒定老芒麥和垂穗披堿草兩個(gè)物種上更具優(yōu)勢(shì)。由于老芒麥和垂穗披堿草兩物種的形態(tài)學(xué)特征非常相似很難區(qū)分，所以可以篩選出一些物種的特異分子標(biāo)記(如圖1箭頭處)加以鑒定[18]。因此，在以后的研究中應(yīng)該采用多種標(biāo)記對(duì)材料進(jìn)行分析，以求更全面、準(zhǔn)確得到材料間的遺傳信息，為材料間的雜交等育種工作提供有益的信息。

[1]郭本兆. 中國(guó)植物志(第9卷3分冊(cè))[M]. 北京:科學(xué)出版社, 1987.

[2]周永紅, 鄭有良, 楊俊良, 等. 10種披堿草屬植物的RAPD分析及其系統(tǒng)學(xué)意義[J].植物分類學(xué)報(bào), 1999, 37(5):425-432.

[3]陳默君, 賈慎修. 中國(guó)飼用植物[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2002.

[4]鄢家俊, 白史且, 張昌兵, 等. 川西北高原野生老芒麥種質(zhì)資源考察初報(bào)[J].草業(yè)與畜牧, 2006, 12:23-26.

[5]陸光平, 聶 斌. 垂穗披堿草利用價(jià)值評(píng)價(jià)[J].草業(yè)科學(xué), 2002, 19(9):13-15.

[6]嚴(yán)學(xué)兵, 汪 璽, 郭玉霞, 等.高寒牧區(qū)垂穗披堿草草地生物量及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值動(dòng)態(tài)研究[J].草業(yè)科學(xué)，2003, 20(11):14-18.

[7]Williams J G, Kubelik A R, Livak K J, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers [J]. Nucleic Acids Res, 1990, 18:6531-6535.

[8]毛培勝, 張 濤, 楊青川. 紫花苜蓿品種鑒定的RAPD分子標(biāo)記技術(shù)研究[J].草地學(xué)報(bào), 2007, 15(2):124-128.

[9]張志永, 陳受宜. 栽培大豆品種間RAPD標(biāo)記的多態(tài)性分析及聚類分析[J].大豆科學(xué), 1998, 17(2):1-7.

[10]張 露, 蔡友銘, 諸葛強(qiáng), 等.石蒜屬種間親緣關(guān)系RAPD分析[J].遺傳學(xué)報(bào), 2002, 29(10):915-921.

[11]周延清. DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005.

[12]Nei M, Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases [J]. Proc Nat Acad Sci. USA, 1979, 76:5269-5273.

[13]Rohlf F J. NTSYS-pc:Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (Version 2.0) [M]. New York:Exter Software, 1994.

[14]李小雷, 于 卓, 賀程鵬, 等. 加拿大披堿草、肥披堿草及其雜種F1代的RAPD分析[J].草地學(xué)報(bào), 2008, 16(1):23-27.

[15]王樹(shù)彥, 云錦鳳, 韓 冰, 等. 加拿大披堿草、老芒麥及其雜種F1代的RAPD分析[J].西北植物學(xué)報(bào), 2004, 24(9):1687-1690.

[16]楊瑞武, 周永紅, 鄭有良, 等. 利用RAPD分析披堿草屬、鵝觀草屬和猬草屬模式種的親緣關(guān)系[J].西北植物學(xué)報(bào), 2001, 21(5):865-871.

[17]李永祥, 李斯深, 李立會(huì), 等. 披堿草屬12個(gè)物種遺傳多樣性的ISSR和SSR比較分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 35:1522-1527.

[18]雷云霆, 竇全文. 青藏高原老芒麥和垂穗披堿草SSR分子標(biāo)記鑒定[J]. 草業(yè)科學(xué), 2012, 29(6):937-942.

(責(zé)任編輯 陳 虹)

Genetic Diversity of Seven New Cultivars ofElymusin Pasturing Area in Northwest Sichuan

CHEN Shi-yong1, MA Xiao2*, ZHANG Chang-bing3, CHEN Zhi-hua1, LI Shi-dan1, ZHENG Jing-hong1

(1.College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Sichuan Chengdu 610041，China; 2.Department of Grassland Science, Sichuan Agricultural University, Sichuan Chengdu 611130,China; 3.Sichuan Academy of Grassland Science, Sichuan Chengdu 611731，China)

The genetic diversity and interspecific relationships among 11Elymusspecies, collected from Northwest plateau Sichuan, were analyzed by RAPD markers. A total of 255 bands amplified by 14 primers were detected, of which a total of 201 bands were polymorphic. The genetic similarity (GS) values based RAPD data of 11 materials ranged from 00.497-0.962 with a mean of 0.714. The materials ofE.sibiricusandE.nutanscould be devided by cluster analysis based on RAPD data, which also revealed the phylogenetic relationships among the new lines ofElymus. TheE.nutansZ0056 showed a far genetic distance with otherE.nutans. However, the materials ofE.sibiricusshowed a narrow genetic background. The results of the study could supply the information for new materials innovation and new varieties breeding ofE.sibiricusandE.nutans.

Northwest Sichuan province;Elymussibiricus;Elymusnutans; RAPD; Genetic variation

1001-4829(2016)11-2549-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.007

2015-10-12

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(15ZA0388)

陳仕勇(1984-)，男，四川三臺(tái)人，博士，主要從事牧草種質(zhì)資源創(chuàng)新及育種研究，E-mail: chengshi8827@163.com，*為通訊作者，E-mail: maroar@126.com。

S543.9

A