張重梅，章振羽，姬紅麗，胡培松，彭云良, *

(1．四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3．中國(guó)水稻研究所，浙江 杭州 311404)

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小麥條銹病菌夏孢子在水稻葉片上的侵染動(dòng)態(tài)

張重梅1, 2，章振羽1，姬紅麗1，胡培松3，彭云良1, 3*

(1．四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3．中國(guó)水稻研究所，浙江 杭州 311404)

水稻是一種對(duì)已知所有銹菌免疫的重要糧食作物，從組織和細(xì)胞水平研究銹菌與水稻之間的互作關(guān)系對(duì)于利用水稻抗銹性機(jī)制具有重要意義。通過(guò)系統(tǒng)觀察小麥條銹病菌夏孢子在水稻品種麗江新團(tuán)黑谷葉片上的侵染過(guò)程，發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌混合菌株的夏孢子在水稻葉片上附著不穩(wěn)定。在靜置葉片上病菌夏孢子能夠萌發(fā)、侵入，并形成氣孔下囊、侵染菌絲、吸器母細(xì)胞、吸器、次生菌絲等結(jié)構(gòu)，但是自侵入起便受到麗江新團(tuán)黑谷對(duì)其侵染和擴(kuò)展的抵抗，表現(xiàn)在侵染各個(gè)環(huán)節(jié)成功率均顯著低于在小麥感病品種銘賢169葉片上的成功率。接種后5 d內(nèi)夏孢子芽管侵入氣孔并形成氣孔下囊、氣孔下囊產(chǎn)生初級(jí)侵染菌絲、初生侵染菌絲產(chǎn)生吸器母細(xì)胞和/或吸器的比率分別比在銘賢169葉片上低51.01 %、53.99 %和43.05 %；自接種后3 d開(kāi)始，侵染點(diǎn)便開(kāi)始逐漸出現(xiàn)越來(lái)越強(qiáng)烈的水稻氣孔細(xì)胞和/或葉肉細(xì)胞的壞死反應(yīng)；最終孢子床和孢子堆發(fā)育則完全未發(fā)生。研究結(jié)果表明，水稻對(duì)小麥條銹病菌的非寄主抗性涉及預(yù)成型抗性和誘導(dǎo)抗性等多種抗性機(jī)制。

水稻；小麥條銹病菌；夏孢子； 侵染結(jié)構(gòu)；非寄主抗性

由禾柄銹菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)引起的小麥條銹病是我國(guó)乃至全世界小麥生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一[1-2]。國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)實(shí)踐表明，選育和種植抗病品種是防治小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)、有效并對(duì)環(huán)境安全的措施。但是由于小麥條銹菌毒性生理小種和毒性類(lèi)型組成復(fù)雜，變異較快，抗性品種在大面積推廣3-5年后即喪失抗性，造成病害反復(fù)暴發(fā)流行，已成為抗病品種選育和利用中的瓶頸問(wèn)題[3-8]。選育具有持久抗性的品種，是小麥抗條銹病育種的主要努力方向[9-19]。目前所發(fā)現(xiàn)的小麥持久抗病品種均為在特定地區(qū)種植而長(zhǎng)期表現(xiàn)的抗病品種，未經(jīng)過(guò)真正長(zhǎng)期大面積的考驗(yàn)，國(guó)內(nèi)大面積生產(chǎn)品種中持久抗病品種尚未見(jiàn)報(bào)道[20]。非寄主抗性是植物對(duì)絕大多數(shù)潛在病原菌所表現(xiàn)出的最基本的抗病形式，能夠?qū)Σ≡N類(lèi)中所有個(gè)體表現(xiàn)出高抗至免疫程度抗性，因而利用非寄主抗性控制基因，被認(rèn)為是選育持久抗性品種的有效途徑[21-22]。水稻對(duì)已知的所有銹菌免疫，作為禾本科作物中的一個(gè)特例已引起廣泛注意，其對(duì)不同銹菌的非寄主抗性的研究近幾年來(lái)也取得了多方面進(jìn)展[21-26]。本研究系統(tǒng)觀察了小麥條銹病菌在水稻對(duì)稻瘟病等多種病害感病的品種麗江新團(tuán)黑谷以及小麥普感條銹品種銘賢169離體葉片上的侵染動(dòng)態(tài)，以期了解水稻對(duì)條銹病菌非寄主抗性的復(fù)雜程度并為分階段研究其非寄主抗性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試品種與菌株

水稻品種為麗江新團(tuán)黑谷(LTH)，對(duì)稻瘟病所有測(cè)試菌株、紋枯病、白葉枯病和水稻黑條矮縮病等病毒病均表現(xiàn)感病[27-29]，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存和繁殖。小麥品種銘賢169感染小麥條銹病菌所有菌株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所繁殖和提供。小麥條銹菌菌株CM42-12，分離自四川郫縣，屬貴農(nóng)22致病類(lèi)型[30]?；旌暇隇?012年分離自四川各地的小麥條銹病菌混合夏孢子。

1.2 菌株繁殖

條銹菌株在低溫室內(nèi)于感病品種銘賢169 上隔離繁殖，混合菌株在網(wǎng)室水泥池里種植的銘賢169上繁殖，分別收集其新鮮夏孢子進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)。

1.3 接種方法

當(dāng)LTH長(zhǎng)至3葉1心、銘賢169第1葉完全展開(kāi)時(shí)進(jìn)行接種。離體葉片接種時(shí)，先剪取健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的LTH心葉、銘賢169第1葉，正面向上貼于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，以0.02 %吐溫20配制2 mg/mL夏孢子懸浮液，采用噴霧法接種[31]。活體接種時(shí)，則用毛筆蘸取新鮮夏孢子粉并均勻的輕涂于LTH心葉和(或)銘賢169第1葉葉片正表面，用含0.02 %吐溫20溶液噴霧，黑暗保濕24 h后將接種幼苗轉(zhuǎn)移到低溫光照培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 條銹夏孢子附著動(dòng)態(tài)的觀察

銘賢169離體葉片接種條銹菌混合菌株后，于8～12 ℃黑暗保濕條件下靜置15 min、30 min、1 h、3 h和6 h，然后在含300 mL蒸餾水的500 mL試劑瓶中17 ℃、170 r/min振蕩10 min，經(jīng)蒸餾水中漂洗2次，每次5 s，最后在LEICA體視顯微鏡10倍目鏡下計(jì)數(shù)葉片中部3.5 cm葉段的夏孢子數(shù)目，每處理6個(gè)重復(fù)。根據(jù)銘賢169上條銹菌夏孢子附著動(dòng)態(tài)，在接種、靜置6 h后觀察病菌在LTH、銘賢169上附著差異：離體葉片于含300 mL蒸餾水的500 mL試劑瓶中17 ℃、160 r/min振蕩10 min，再于蒸餾水中漂洗2次，每次5 s，最后于在LEICA體視顯微鏡10倍目鏡下計(jì)數(shù)葉片中部噴霧接種區(qū)域2.5 cm葉段的夏孢子數(shù)目，對(duì)照組的LTH和銘賢169葉片不振蕩洗滌，靜置6 h后直接觀察，每處理9個(gè)重復(fù)。

1.5 夏孢子萌發(fā)、侵染和擴(kuò)展觀察

LTH和銘賢169葉片噴霧接種CM42-12新鮮夏孢子懸浮液后，于8～12 ℃黑暗保濕條件下靜置24 h后，立即鏡檢葉片中部4cm葉段表面的孢子數(shù)目和芽管數(shù)目，每處理3個(gè)重復(fù)。于接種后12 h, 1 d, 2 d, 3 d, 5 d, 7 d, 14 d, 22 d取樣，將接種的銘賢169、LTH葉片剪成 2 cm 的葉段，按康振生[32]等方法進(jìn)行整葉透明處理和熒光染色處理，每處理6個(gè)重復(fù)。夏孢子在葉片上的侵染動(dòng)態(tài)觀測(cè)在Nikon eclipse 80i熒光顯微鏡及Nikon DS-Ril 生物顯微鏡上進(jìn)行，觀測(cè)時(shí)調(diào)查并記載不同時(shí)間每葉段上夏孢子芽管抵達(dá)和侵入氣孔、產(chǎn)生氣孔下囊、形成初級(jí)侵染菌絲、吸器母細(xì)胞和吸器等結(jié)構(gòu)的比率，以及侵染點(diǎn)中發(fā)生可見(jiàn)壞死反應(yīng)的比率，

1.6 數(shù)據(jù)處理

用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS v7.05對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥條銹病菌夏孢子在LTH葉片上的附著

接種的銘賢169葉片靜置不同時(shí)間并經(jīng)振蕩漂洗處理后，鏡檢葉片上粘附的夏孢子數(shù)目，發(fā)現(xiàn)從15 min到6 h，附著孢子數(shù)隨著靜置時(shí)間的增長(zhǎng)而增多(圖1)，靜置15 min、30 min和1 h后，3.5 cm銘賢169葉段上經(jīng)震蕩漂洗后后平均殘留孢子數(shù)分別為 0.50、1.17、和 9.33，附著率分別為0.10 %、0.23 %、1.83 %。當(dāng)靜置3和6 h后，經(jīng)震蕩漂洗后葉段上平均殘留夏孢子數(shù)分別為 38.33和 61.67，顯著高于靜置時(shí)間1 h以下的附著夏孢子數(shù)，附著率分別為7.53 %和12.11 %。

圖1 小麥條銹病菌夏孢子接種銘賢169葉片上不同時(shí)間后穩(wěn)定附著的夏孢子數(shù)目Fig.1 Number of adhered urediniospores of Pucccinia striiformis f. sp. tritici on Mingxian 169 at different times after inoculation

圖2 小麥條銹病菌夏孢子在LTH葉片和銘賢169葉片上的附著Fig.2 Number of adhered urediniospores of Pucccinia striiformis f. sp. tritici 6h post inoculation of leaves of LTH and Mingxian 169

觀察條銹夏孢子分別在LTH和銘賢169葉片上接種后靜置6 h后，2.5 cm 長(zhǎng)LTH葉段上平均有295個(gè)夏孢子，銘賢169相同長(zhǎng)度的葉片上平均有518個(gè)孢子，經(jīng)過(guò)振蕩處理的LTH葉段上約有3個(gè)孢子，而銘賢169葉段上有121個(gè)孢子，差異均極為顯著(P<0.01)。靜置6 h后經(jīng)振蕩漂洗處理，小麥條銹夏孢子在LTH上的附著率僅有1.06 %，而在條銹病菌寄主銘賢169上的附著率則達(dá)23.26 %。

2.2 小麥條銹病菌夏孢子在LTH葉片上的萌發(fā)

直接在體視顯微鏡下觀察LTH和銘賢169葉片上夏孢子的萌發(fā)，發(fā)現(xiàn)接種后1 d，條銹病菌菌株CM42-12的夏孢子在LTH葉片上萌發(fā)率平均為5.07 %，而在銘賢169上的萌發(fā)率為6.88 %，兩者間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 小麥條銹病菌夏孢子在LTH葉片上侵染結(jié)構(gòu)的形成

分別于接種后 12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d和22 d 取樣進(jìn)行組織學(xué)觀察來(lái)了解Pst夏孢子在水稻LTH葉片上的生命發(fā)展過(guò)程(圖4)，在接種后12 h小麥條銹菌夏孢子即在LTH葉片上萌發(fā)產(chǎn)生芽管；在接種后1 d 芽管進(jìn)一步伸長(zhǎng)擴(kuò)展，僅有少數(shù)芽管侵入氣孔并形成氣孔下囊；在接種后2 d，有的侵染點(diǎn)的氣孔下囊已有初生侵染菌絲產(chǎn)生；在接種后3 d多數(shù)侵染點(diǎn)仍停留在氣孔下囊或氣孔下囊加初生侵染菌絲階段，并在侵染點(diǎn)開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞壞死，極少數(shù)侵染點(diǎn)有少量次生侵染菌絲和吸器母細(xì)胞形成；在接種后5 d多數(shù)侵染點(diǎn)仍停留在氣孔下囊或氣孔下囊加初生侵染菌絲階段，這些發(fā)育停滯的侵染點(diǎn)都發(fā)生了明顯的細(xì)胞壞死，極少數(shù)侵染點(diǎn)形成更多的次生侵染菌絲和次生吸器母細(xì)胞；在接種后7 d，除了多數(shù)發(fā)育停滯、細(xì)胞明顯壞死的侵染點(diǎn)外，少數(shù)侵染點(diǎn)形成較多次生侵染菌絲、次生吸器母細(xì)胞和少量吸器，并在LTH葉片上形成了小菌落；在接種后14 d，在LTH葉片上可以見(jiàn)到不同大小的侵染點(diǎn)，有的僅限制在氣孔區(qū)域(圖5,h-i)，有的則侵染氣孔周?chē)鷶?shù)十個(gè)葉肉細(xì)胞(圖5,b, d)，有的則形成較大的菌落侵染數(shù)百個(gè)葉肉細(xì)胞(圖5,k-l)，葉片上未有孢子床或夏孢子堆的形成；接種后22 d，在LTH葉片上，所有的侵染點(diǎn)都可見(jiàn)強(qiáng)烈的細(xì)胞壞死反應(yīng)，仍無(wú)孢子床或夏孢子堆的產(chǎn)生(圖6)。

圖3 小麥條銹病菌接種后1 d夏孢子分別在LTH葉片和銘賢169上的萌發(fā)率Fig.3 Percentage of germinated urediniospores of Pucccinia striiformis f. sp. tritici 1 dpi on leaves of LTH and Mingxian 169 1 day post inoculation

在觀察中還發(fā)現(xiàn)，有大量夏孢子在LTH葉片上萌發(fā)產(chǎn)生芽管后，經(jīng)過(guò)2個(gè)以上氣孔卻僅在氣孔上略微膨大而未能侵入氣孔(圖7,a-b)，有少量的夏孢子在LTH葉片上萌發(fā)后未侵入氣孔，而是直接在葉片表面形成類(lèi)似于附著胞、氣孔下囊、初級(jí)侵染菌絲甚至是吸器母細(xì)胞等侵染結(jié)構(gòu)(圖7,c-h)。

對(duì)小麥條銹菌在水稻品種LTH和小麥品種銘賢169上的侵染過(guò)程進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌夏孢子在LTH葉片上和在銘賢169葉片上侵染發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)存在差異。

如果將夏孢子芽管從氣孔上經(jīng)過(guò)或是芽管頂端抵達(dá)氣孔的狀態(tài)視為Pst定位了氣孔，則如表1所示，條銹菌夏孢子芽管在LTH和銘賢169葉片上定位氣孔的比率之間無(wú)顯著差異。

在接種后12 h，小麥條銹病菌夏孢子在LTH和銘賢169葉片上萌發(fā)產(chǎn)生芽管，未觀察到芽管已侵入LTH葉片氣孔，在銘賢169葉片上有部分芽管已侵入氣孔產(chǎn)生氣孔下囊(圖4,a-b)。

a和b為樣品經(jīng)苯胺藍(lán)染色在光學(xué)顯微鏡下觀察所得，c～p均為經(jīng)熒光增白劑染色在熒光顯微鏡下觀察所得圖4 小麥條銹菌分別在LTH和銘賢169上的侵染過(guò)程Fig.4 The infection process of urediniospores of Pucccinia striiformis f. sp. tritici on rice (LTH) and wheat (Mingxian 169, MX169) leaves

在接種后1 d，僅有約7.54 %定位了氣孔的夏孢子的芽管侵入LTH葉片氣孔并形成氣孔下囊，而有約59.53 %定位了氣孔的夏孢子的芽管侵入銘賢169葉片氣孔形成氣孔下囊，即此時(shí)Pst夏孢子萌發(fā)后侵入LTH和銘賢169氣孔的比率分別為3.75 %和30.36 %，夏孢子成功侵入LTH氣孔的比率極顯著低于侵入銘賢169氣孔的比率(P<0.01)，并且此時(shí)在LTH葉片上幾乎沒(méi)有初生侵染菌絲生成，在銘賢169葉片上已有少量的初生侵染菌絲甚至是初生吸器母細(xì)胞形成(圖4,c-d)。

在接種后2 d，在LTH和銘賢169上成功定位氣孔的夏孢子中，分別有23.17 %和55.19 %的夏孢子形成了氣孔下囊，差異極顯著(P<0.01)，而氣孔下囊下產(chǎn)生初生侵染菌絲的比率分別為55.28 %和88.27 %，兩者間無(wú)顯著差異。此時(shí)在LTH葉片上未觀察到侵染點(diǎn)有生成明顯的吸器母細(xì)胞，而在銘賢169葉片上已有較多侵染點(diǎn)有初生吸器母細(xì)胞形成(圖4,e-f)。

在接種后5 d，在LTH葉片上，少數(shù)侵染點(diǎn)開(kāi)始形成少量次生侵染菌絲及吸器母細(xì)胞，初生侵染菌絲形成了初生吸器母細(xì)胞的侵染點(diǎn)的比率約為28.33 %，約55.35 %的侵染點(diǎn)則停滯在形成氣孔下囊或初級(jí)侵染菌絲階段，這些發(fā)育停滯的侵染點(diǎn)都發(fā)生了明顯的細(xì)胞壞死，在銘賢169上，初生侵染菌絲形成了初生母細(xì)胞的侵染點(diǎn)的比率約為71.38 %，觀察到侵染點(diǎn)有更多的次生菌絲及吸器母細(xì)胞形成，未觀察到銘賢169組織有明顯的壞死反應(yīng)(圖4,i-j)。

在接種后7 d，Pst夏孢子萌發(fā)后侵入LTH和銘賢169的比率分別為18.14 %和56.96 %，產(chǎn)生初生侵染菌絲的比率分別約為9.00 %和47.15 %，產(chǎn)生吸器母細(xì)胞及吸器的比率分別為5.01 %和41.35 %，差異均極顯著(P<0.01)，此外在LTH葉片上約73.17 %的侵染點(diǎn)發(fā)生了細(xì)胞壞死，未觀察到銘賢169組織有明顯的壞死反應(yīng)(圖4,k-l)。

表1 小麥條銹病菌夏孢子萌發(fā)后在LTH和銘賢169離體葉片上芽管抵達(dá)氣孔、抵達(dá)氣孔后形成氣孔下囊、氣孔下囊產(chǎn)生初級(jí)侵染菌絲、侵染菌絲形成吸器母細(xì)胞/吸器的比例

Table 1 Accomplishment ratio of different infection stages ofPucciniastriiformisf. sp.triticion theinvitroleaves of rice (LTH) and wheat (Mingxian 169)

接種后時(shí)間Times(dpi)Timespostinoculation芽管抵達(dá)氣孔比例(%)Arrivalatstomata抵達(dá)后氣孔形成氣孔下囊(%)Penetrationandformingsub-stomatalvesicle氣孔下囊產(chǎn)生初級(jí)侵染菌絲(%)Primaryinfectinghyphaefromappresorium侵染菌絲形成吸器母細(xì)胞/吸器(%)HMC/HfrominfectinghyphaeLTH銘賢169LTH銘賢169LTH銘賢169LTH銘賢169159.78±8.1352.30±10.93ns1)7.54±10.7259.53±27.42**0±0.0036.51±33.25*--272.57±13.8861.26±10.10ns23.17±13.5055.19±16.70**55.28±34.1688.17±20.21ns--368.46±6.8969.07±6.86ns51.53±35.5379.34±22.44ns54.63±37.5385.82±17.46ns--571.06±12.5059.28±29.04ns29.61±12.1180.62±13.68**33.42±39.1587.41±19.52*28.33±40.2171.38±18.22*773.42±5.1466.43±17.48ns24.69±4.5685.90±9.81**50.22±24.1681.19±18.89*49.17±40.7983.13±23.02ns

注：1)利用t-檢測(cè)比較了小麥條銹菌分別在水稻LTH葉片和小麥銘賢169葉片上侵染的4個(gè)環(huán)節(jié)的完成率差異，其中*表示在P=0.05的水平上存在顯著差異，**表示在P=0.01的水平上存在極顯著差異，ns表示沒(méi)有顯著差異。 Note:1)t-tests were used to compare the accomplishment ratio of the infection stages on LTH and Mignxian169 leaves. *and **:respectively indicating the significant difference atP<0.05 andP≤ 0.01 level and ns indicate no significant difference.

表2 小麥條銹菌侵入LTH和銘賢169葉片后侵染點(diǎn)壞死比率

Table 2 The ratio of the infection sites with necrosis at different times after the inoculation ofPucciniastriiformisf. sp.triticion the laves of rice (LTH) and wheat (Mingxian 168)

接種后時(shí)間Times(dpi)侵染點(diǎn)壞死率(%)TheratioofinfectionsiteswithnecrosisLTH銘賢169555.35±36.690.00±0.00*1)773.17±29.480.00±0.00**1474.18±10.20-22100.00±0-

注：1)t-檢測(cè)用于比較水稻LTH葉片和小麥銘賢169葉片上侵染位點(diǎn)發(fā)生壞死的比率差異，其中*表示在P=0.05的水平上存在顯著差異，**表示在P=0.01的水平上存在極顯著差異。 Note：1)T-tests were used to compare the accomplishment ratio of rust infection stages at infection sites on rice and wheat leaves. *,**:Indicate the values of differ significantly atP<0.05 andP≤ 0.01 according tot-test, respectively. ns indicate no significant difference.

a～d 顯示LTH上的侵染位點(diǎn)伴隨較少/輕微的細(xì)胞壞死。e～i顯示LTH上的侵染位點(diǎn)伴隨相對(duì)較強(qiáng)的細(xì)胞壞死。j顯示在銘賢169上，條銹菌菌絲的擴(kuò)展不受維管束限制。k～l顯示在LTH上，條銹菌菌絲的擴(kuò)展受到維管束限制。a和g為L(zhǎng)TH葉片接種后7d經(jīng)熒光增白劑染色后在熒光顯微鏡下觀察所得，b～f、h～i及k～l為L(zhǎng)TH葉片接種后14d經(jīng)熒光增白劑染色后觀察所得，g為銘賢169葉片接種后14d經(jīng)熒光增白劑染色后觀察所得。GT ：芽管, SSV：氣孔下囊, PH：初生侵染菌絲, HMC：吸器母細(xì)胞, H：吸器. 標(biāo)尺：25 μm圖5 小麥條銹菌在LTH和銘賢169離體葉片上的侵染位點(diǎn)及侵染結(jié)構(gòu)Fig.5 Infection structures and infection sites of Puccinia striiformis f. sp. tritici on/in in vitro leaves of rice (LTH) and wheat (Mingxian 169, Mx169) leaves

在接種后14 d，在LTH葉片上可以見(jiàn)到不同大小的侵染點(diǎn)(圖5,b,d, h, i, k, l)，約74.18 %的侵染點(diǎn)發(fā)生了細(xì)胞壞死，不同的侵染點(diǎn)受到的LTH對(duì)其的抵抗程度也存在較大變化，表現(xiàn)不同的侵染點(diǎn)發(fā)生的細(xì)胞壞死程度不一(圖5,b-f, h-i, k-l)，此外還可以發(fā)現(xiàn)在各侵染點(diǎn)條銹菌菌絲的擴(kuò)展受到葉脈的限制(圖5,b, h, i)，在銘賢169葉片上，條銹菌菌絲大片糾結(jié)，并已形成大量的夏孢子堆或孢子床(圖4,m-n)。

在接種后22 d，在LTH葉片上，所有的侵染點(diǎn)都已發(fā)生較為強(qiáng)烈的細(xì)胞壞死反應(yīng)，各個(gè)侵染點(diǎn)的銹菌的進(jìn)一步擴(kuò)展和發(fā)育受阻，仍無(wú)夏孢子堆的產(chǎn)生(圖6)。在銘賢169葉片上則布滿夏孢子堆或孢子床，并且夏孢子堆中部分夏孢子已經(jīng)萌發(fā)并有較長(zhǎng)芽管生成(圖4,o-p)。

2.4 LTH葉片接種條銹菌夏孢子后的表觀特征

在LTH和銘賢169離體葉片上噴接新鮮夏孢子懸液，在接種后14d, 在LTH葉片上僅形成少量淡褐色微小壞死斑，此時(shí)在銘賢169葉片上已形成大量黃色夏孢子堆，在接種后22 d, LTH葉片上形成的少量比較明顯的壞死斑，呈深褐色細(xì)短條狀，但此時(shí)仍無(wú)夏孢子堆產(chǎn)生。

a和b顯示芽管從LTH葉片氣孔上經(jīng)過(guò)而不侵入(白色箭頭所示)。c～f顯示夏孢子在LTH葉表分化形成類(lèi)似氣孔下囊及初生侵染菌絲的結(jié)構(gòu)。g顯示夏孢子在LTH葉片氣孔上形成附著胞類(lèi)似結(jié)構(gòu)。h顯示夏孢子在LTH葉表形成類(lèi)似氣孔下囊、初生侵染菌絲以及初生吸器母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。S：夏孢子，GT：芽管，SL氣孔下囊類(lèi)似結(jié)構(gòu)，PL初生侵染菌絲類(lèi)似結(jié)構(gòu)，AL附著胞類(lèi)似結(jié)構(gòu)， HL吸器母細(xì)胞類(lèi)似結(jié)構(gòu)。標(biāo)尺：25 μm圖7 小麥條銹菌夏孢子在LTH葉片表面的發(fā)育分化現(xiàn)象Fig.7 The differentiation of Pst on the surface of in vitro leaves of rice (LTH)

a接種后14 d在LTH葉片上僅形成微小的淺褐色病斑而在銘賢169葉片上已形成了大量夏孢子堆。b接種后22 d僅在LTH葉片上形成一些深褐色病斑，而在銘賢169葉片上夏孢子堆幾乎占據(jù)了整個(gè)葉片圖8 LTH和銘賢169葉片接種小麥條銹菌后的宏觀特征Fig.8 The external symptoms on the in vitro leaves of rice (LTH) and wheat (Mingxian 169) infected by Pst

3 討 論

銹菌目真菌寄主廣泛，包括了裸子植物、被子植物中單子葉植物和雙子葉植物的眾多種類(lèi)，在長(zhǎng)期歷史進(jìn)化過(guò)程中，僅對(duì)水稻、煙草等少數(shù)植物未進(jìn)化出致病類(lèi)型。非寄主抗性具有廣譜高效、穩(wěn)定持久的特點(diǎn)，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，使非寄主抗性傳遞給病原菌寄主成為可能，因此人們對(duì)非寄主抗性分子機(jī)理研究的興趣日益增加。一般認(rèn)為植物對(duì)于真菌、細(xì)菌以及卵菌的非寄主抗病性可分為T(mén)ype I型和Type II型兩種。Type I型即無(wú)明顯癥狀型非寄主抗性，是指當(dāng)某種植物的病菌接種到另外一種植物時(shí)，表現(xiàn)出沒(méi)有明顯肉眼可見(jiàn)的癥狀(HR)的現(xiàn)象。此類(lèi)非寄主抗性主要是依靠植物細(xì)胞壁的物理強(qiáng)度、細(xì)胞骨架、產(chǎn)生和積累胼胝質(zhì)、酚類(lèi)、抗毒素、PR蛋白等抗菌物質(zhì)來(lái)抑制病原微生物的侵入與定殖，從而與植物預(yù)成型抗性關(guān)系密切。而Type II型則為過(guò)敏反應(yīng)型，其主要機(jī)理為植物識(shí)別了病原微生物的無(wú)毒蛋白、胞外蛋白、吸器等激發(fā)子，從而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生相應(yīng)的防御反應(yīng)，制止病原微生物的擴(kuò)展[33-37]。從組織細(xì)胞水平對(duì)小麥銹菌與其非寄主水稻互作關(guān)系的研究是水稻抗銹性機(jī)制研究的一個(gè)重要組成部分[21-22,26]。Ayliffe等報(bào)道[21-22]Pucciniagraminisf.sptritici，P.triticina,P.striiformis和P.hordei均能侵染水稻并形成包括吸器在內(nèi)的所有侵染必須結(jié)構(gòu)，而水稻則回應(yīng)以胼胝質(zhì)沉積、活性氧產(chǎn)生以及偶爾的細(xì)胞死亡等非寄主抗性反應(yīng)。李紅兵[24]發(fā)現(xiàn)接種1 d后，只有大約10 %的小麥葉銹病菌的芽管能夠抵達(dá)氣孔并在產(chǎn)生附著胞，接種3天后，水稻靠近附著胞的細(xì)胞積累過(guò)氧化氫，接種7 d，后大約3 %的附著胞在葉片內(nèi)產(chǎn)生短的菌絲，僅約0.2 %的穿透菌絲繼續(xù)在葉肉細(xì)胞間擴(kuò)展，在接種后22 d，極少量的侵染菌絲生長(zhǎng)橫跨幾個(gè)葉肉細(xì)胞形成侵染菌絲，然而，沒(méi)有觀察到吸器母細(xì)胞和吸器，接種后45 d，在侵染點(diǎn)周?chē)^察到片段化的菌絲并伴隨侵染點(diǎn)周?chē)碾蓦召|(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)的沉積，然而，自始至終沒(méi)有觀察到壞死斑和孢子堆。邢慧君[25]發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌可以在水稻品種日本晴葉片上正常萌發(fā)并長(zhǎng)出芽管，但是僅少量芽管可以識(shí)別并侵入水稻氣孔，形成氣孔下囊，多數(shù)夏孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管無(wú)法形成氣孔下囊，且部分芽管出現(xiàn)形態(tài)異?，F(xiàn)象；而小麥條銹菌侵入水稻品種9311葉片未見(jiàn)明顯抑制，但侵入后擴(kuò)展緩慢，且吸器形成極少，并引起細(xì)胞過(guò)敏性壞死反應(yīng)；Yang等人[26]而發(fā)現(xiàn)不同品種對(duì)條銹病菌非寄主抗性存在差異，小麥條銹病菌在秈稻型水稻品種上更易形成侵染結(jié)構(gòu)，H2O2積累僅在粳稻型水稻品種-小麥條銹病菌互作的早期發(fā)生。對(duì)于不同銹菌種類(lèi)，水稻所表現(xiàn)出的非寄主抗性也有差異。Ayliffe等[21,22]觀察到水稻對(duì)桿銹和葉銹的非寄主抗性效率存在遺傳差異，而亞麻的銹菌Melampsoralini因?yàn)槊黠@不能識(shí)別水稻產(chǎn)生的信號(hào)而很少能成功侵染單子葉的水稻，并且在水稻上產(chǎn)生一些異常的侵染結(jié)構(gòu)和與氣孔不匹配的附著胞。越來(lái)越多的研究表明，非寄主抗性是一種多基因控制的數(shù)量性狀，機(jī)理非常復(fù)雜，預(yù)成型抗性(胼胝質(zhì)、酚類(lèi)等)和誘導(dǎo)抗性在非寄主抗性中都發(fā)揮了重要作用[38-41]。而對(duì)于不同種類(lèi)的銹菌，水稻可能對(duì)應(yīng)以不同類(lèi)型非寄主抗性(Type I型或Type II型)，甚至同一片水稻葉片上的不同侵染點(diǎn)，對(duì)應(yīng)于同一種銹菌也表現(xiàn)不同程度或?qū)用娴姆羌闹骺剐訹21-26]。

在本研究中，麗江新團(tuán)黑谷在病菌侵入前就表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性。其一，夏孢子在麗江新團(tuán)黑谷葉片上不能穩(wěn)定地附著，其二在靜置麗江新團(tuán)黑谷葉片上條銹病菌夏孢子侵入氣孔的成功率也顯著低于銘賢169，許多芽管即便經(jīng)過(guò)2個(gè)以上的氣孔也不侵入氣孔，而只是在氣孔上略微膨大。前者可能是因?yàn)榉羌闹魉救~片表面的物理結(jié)構(gòu)(乳突、表皮毛、蠟質(zhì)等)與寄主小麥葉片間的差異造成的，后者的原因尚不清楚。值得注意的是，條銹病菌夏孢子在麗江新團(tuán)黑谷和銘賢169上抵達(dá)氣孔的比例沒(méi)有顯著差異。與其他研究者所獲結(jié)果相一致，小麥條銹病菌在麗江新團(tuán)黑谷葉片上即使成功侵染氣孔，其后的進(jìn)一步的侵染和擴(kuò)展也受到明顯抑制，接種后3 d部分侵染點(diǎn)即開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞壞死，但不同的侵染點(diǎn)發(fā)生的細(xì)胞壞死的時(shí)間和程度不一。研究中還發(fā)現(xiàn)，離體麗江新團(tuán)黑谷心葉接種Pst菌株在接種14 d后在葉片上形成少量小壞死斑，但接種活體麗江新團(tuán)黑谷心葉時(shí)卻沒(méi)有觀察到明顯的壞死斑，表明該活體麗江新團(tuán)黑谷存在比離體麗江新團(tuán)黑谷更為復(fù)雜的非寄主抗性。這與Yang等人[26]的研究結(jié)果相一致，他們發(fā)現(xiàn)麗江新團(tuán)黑谷葉片活體接種CR32孢子懸液10 d后未觀察到有氣孔下囊/侵染菌絲的形成?？梢?jiàn)，麗江新團(tuán)黑谷對(duì)小麥條銹病菌的非寄主抗性貫穿了自夏孢子附著葉片到次生菌絲形成、擴(kuò)展的全過(guò)程，預(yù)成型抗性和誘導(dǎo)抗性均起重要作用。多種抗性機(jī)制的交互作用，可能是水稻能夠在進(jìn)化過(guò)程中長(zhǎng)期保持對(duì)條銹病菌抗性的重要原因，值得進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Infection Process ofPucciniastriformisf. sp.triticiUrediniospores on Rice Leaves

ZHANG Zhong-mei1, 2, ZHANG Zhen-yu1, JI Hong-li1, HU Pei-song3, PENG Yun-liang1, 3*

(1. Institute of Plant Protection, Sichuan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southwest China, Ministery of Agriculture, Sichuan Chengdu 610066, China; 2. College of Plant Sciences & Technology of Huazhong Agricultural University, Hubei Wuhan 430070, China; 3. China National Rice Research Institute, Zhejiang Hangzhou 311404, China)

Rice is one of the most intensively cultivated cereal crops and feeds over 1/3 of the world population. It is also mysterious that rice is immune to all cereal and other plant rust pathogens. Researches on the interaction between rust and rice on the tissue and cellular level is an important part to elucidate and deploy the immune mechanisms of rice. The infection process of the urediniospores ofPucciniastriformisf.sp.tritici(Pst) was systematically observed on the Japonica rice variety Lijiangxintuanheigu (LTH) and susceptible wheat control variety Mingxian 169. The results had indicated that multiple mechanisms had been involved in the non-host resistance of LTH.Psturediniospores failed to adhere the rice leaves stably. On the stable, levelinvitroleaves of LTH, however,Pstcould germinate, penetrate the stomata and produce all the infection structures including sub-stomatal vesicle (SSV), primary infection hyphae (PIH), haustorium mother cell (HMC), haustorium (H) and secondary infection hyphae (SIH). But the complishment ratios ofPstto form SSV、PIH and HMC/H on in the leaves of LTH were respectively 51.01 %, 53.99 % and 43.05 % lower than that on Mingxian 169 at 5dpi. Necrosis around infection sites with stomata and different number of surrounding mesophyl cells were observed since 3dpi but the formation of uredium-bed and uredium were not observed in LTH.

Rice;Pucciniastriformisf.sp.tritici; Urediniospores; Infection structure；Non-host resistance

1001-4829(2016)11-2520-09

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.003

2015-12-23

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD19B04);四川省財(cái)政專(zhuān)項(xiàng)(2011JYGC06-021)

張重梅(1983-)，女，土家族，湖北恩施人，在讀博士，從事植物病理學(xué)研究，E-mail:zhongmeizhang12@163.com，*為通訊作者：彭云良，E-mail: pengyunliang@aliyun.com。

S511

A