王 鑫， 胡洋洋

(江南大學(xué) 教育部輕工過(guò)程先進(jìn)控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

?

基于熒光圖像的水華微囊藻濃度檢測(cè)*

王 鑫， 胡洋洋

(江南大學(xué) 教育部輕工過(guò)程先進(jìn)控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

通過(guò)熒光光譜儀分析了水華微囊藻葉綠素a的熒光激發(fā)特性，利用圖像處理技術(shù)，提出了基于藻類(lèi)熒光激發(fā)效應(yīng)的水華微囊藻濃度自動(dòng)檢測(cè)方法。利用430 nm熒光作為激發(fā)光源，得到波長(zhǎng)為680 nm的水華微囊藻熒光顯微圖像，利用紅色濾光片去除其它入射光的影響，使圖像中只包含水華微囊藻熒光特性；對(duì)得到的熒光圖像進(jìn)行灰度化、二值化、濾波，進(jìn)行計(jì)數(shù)以及藻液濃度測(cè)量。實(shí)驗(yàn)證明：此方法能夠很好地區(qū)分藻類(lèi)和雜質(zhì)，濃度測(cè)量結(jié)果精準(zhǔn)，計(jì)算速度快，為藻類(lèi)細(xì)胞濃度檢測(cè)提供了一種新的便捷方法。

濃度檢測(cè)； 水華微囊藻； 熒光特性； 自動(dòng)計(jì)數(shù)； 圖像處理

0 引 言

水華微囊藻[1]是形成太湖藍(lán)藻水華的優(yōu)勢(shì)藻種之一，檢測(cè)水體中藻細(xì)胞濃度對(duì)及時(shí)預(yù)測(cè)藍(lán)藻水華爆發(fā)具有很大的意義。傳統(tǒng)的生物量測(cè)定方法有：細(xì)胞計(jì)數(shù)法[2]、傳統(tǒng)葉綠素a測(cè)定法[3]和干重法[4]。葉綠素a測(cè)定法與干重法測(cè)量操作相當(dāng)繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，不利于多樣品的連續(xù)測(cè)定。目前實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞計(jì)數(shù)法主要靠細(xì)胞計(jì)數(shù)板，由于采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)需要人工的參與，當(dāng)待測(cè)水樣中的雜質(zhì)過(guò)多時(shí)，計(jì)數(shù)工作量大，存在人為因素影響，不僅耗時(shí)耗力，而且對(duì)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果造成的誤差較大。

針對(duì)以上問(wèn)題，本文提出一種新的便捷的水華微囊藻藻液濃度檢測(cè)方法。本文將水華微囊藻作為實(shí)驗(yàn)樣本，利用熒光光譜儀測(cè)量水華微囊藻葉綠素a的熒光激發(fā)特性，采集水華微囊藻熒光圖像，通過(guò)分析熒光圖像，依次進(jìn)行灰度化、二值化、濾波，最終對(duì)水華微囊藻的統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)，計(jì)算出藻液的細(xì)胞濃度。

1 熒光圖像的獲取

1.1 熒光特性

藻類(lèi)的熒光特性[5]是藻類(lèi)生物傳感器[6]研發(fā)制造的重要理論支撐之一。利用葉綠素a的熒光特性，藻類(lèi)形狀對(duì)計(jì)數(shù)精度的影響大大降低，根據(jù)藻類(lèi)熒光激發(fā)光波長(zhǎng)，選擇對(duì)應(yīng)的濾光片，可以很容易將目標(biāo)藻類(lèi)與雜質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)，且利用熒光圖像對(duì)藻類(lèi)進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)具有不同熒光激發(fā)光的藻類(lèi)區(qū)分效果明顯。水華微囊藻同時(shí)具有葉綠素a與藻藍(lán)蛋白兩種熒光物質(zhì)，已有的研究[7]表明：激發(fā)光在430 nm左右葉綠素a會(huì)產(chǎn)生660～690 nm的發(fā)射光(熒光)；激發(fā)光在615 nm左右藻藍(lán)蛋白會(huì)產(chǎn)生640～660 nm的發(fā)射光(熒光)。由于藻藍(lán)蛋白的激發(fā)光與發(fā)射光比較接近，導(dǎo)致接收到的熒光圖像會(huì)受到激發(fā)光較大的干擾，所以本文選取葉綠素的熒光特性。

為了確認(rèn)水華微囊藻的葉綠素a具體的熒光特性，在PTI穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀(QuantaMaster 400)上進(jìn)行了固定激發(fā)光波長(zhǎng)430 nm，掃描發(fā)射光(范圍從450～750 nm)得到結(jié)果如圖1所示：當(dāng)對(duì)水華微囊藻的激發(fā)光為430 nm時(shí)，產(chǎn)生的發(fā)射光在680 nm處最強(qiáng)，單位時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到光子數(shù)代表發(fā)射光的強(qiáng)度。

圖1 水華微囊藻中葉綠素a的熒光特性曲線Fig 1 Fluorescence characteristic curve of microcystis chlorophyll a

1.2 熒光圖像獲取

實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室培育的單一水華微囊藻試驗(yàn)液，水華微囊藻密度為140萬(wàn)個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)用顯微鏡選擇貝朗BL—001，放大倍數(shù)為400倍，激光發(fā)射器波長(zhǎng)為430 nm。水華微囊藻葉綠素a的熒光最強(qiáng)發(fā)射光波長(zhǎng)為680 nm，選用680 nm帶通濾光片，心波長(zhǎng)(680±5)nm，透過(guò)率T>70 %，半帶寬5 nm;計(jì)算機(jī)CPU主頻為2.7 G，2 G內(nèi)存，1 G顯存。實(shí)驗(yàn)軟件在VS2010平臺(tái)上開(kāi)發(fā)，基于Win7系統(tǒng)。

該裝置獲取的熒光圖像如圖2所示。

圖2 水華微囊藻熒光圖像Fig 2 Fluorescence image of microcystis flos-aquae

2 圖像處理

由于得到的RGB格式的熒光圖像中仍然含有較多的干擾噪聲，所以，對(duì)獲取到的熒光圖像依次進(jìn)行灰度化、灰度變換增強(qiáng)[8]、二值化以及濾波處理得到最終圖像。

2.1 灰度化

對(duì)讀取的RGB格式的熒光圖像通過(guò)加權(quán)平均法轉(zhuǎn)化為灰度圖像。首先藻類(lèi)壓片后存在分層現(xiàn)象，不在顯微鏡聚焦范圍內(nèi)的細(xì)胞熒光較弱，另外彩色圖像灰度化時(shí)，圖像對(duì)比度降低，損失了一定量的圖像特征信息，所以，會(huì)導(dǎo)致一些細(xì)胞區(qū)域灰度化以后較暗的現(xiàn)象，本文采用自適應(yīng)直方圖均衡化來(lái)解決這一問(wèn)題?；叶然蟮膱D像如圖3所示。

圖3 灰度化圖像Fig 3 Graying image

2.2 自適應(yīng)直方圖均衡化

為了不損失原始圖像中的細(xì)胞位置信息，本文通過(guò)自適應(yīng)直方圖均衡化[9]對(duì)得到的灰度圖像進(jìn)行灰度變換增強(qiáng)，讓熒光較弱的細(xì)胞區(qū)域與背景區(qū)域更加明顯，便于二值化閾值的選取。經(jīng)過(guò)自適應(yīng)直方圖均衡化后的增強(qiáng)圖像如圖4所示。

圖4 增強(qiáng)圖像Fig 4 Enhanced image

2.3 二值化

使用全局閾值將顯微細(xì)胞圖像進(jìn)行二值化處理，使細(xì)胞區(qū)域和背景區(qū)域分開(kāi)。本文使用的是著名的最大類(lèi)間方差法(Otsu算法[10])計(jì)算出最佳的全局閾值。Otsu算法將圖像分成前景和背景，當(dāng)取得最佳閾值時(shí)，前景和背景之間的方差最大，也就是區(qū)別最大。經(jīng)過(guò)二值化后的圖像如圖5所示。

圖5 二值化圖像Fig 5 Binarization image

2.4 濾 波

由于得到的熒光圖像本身的背景有很大的干擾噪聲，而二值化圖像是從灰度增強(qiáng)圖像二值化來(lái)的，會(huì)含有一些各種形式的噪聲，因此，本文依次對(duì)得到的二值化圖像進(jìn)行中值濾波[11]、形態(tài)學(xué)濾波[12]得到最終的預(yù)處理后的圖像，濾波操作將背景產(chǎn)生一些噪聲去除掉，使最終得到的圖像能準(zhǔn)確地表征細(xì)胞的位置信息。經(jīng)過(guò)濾波后的圖像如圖6所示。

圖6 濾波后圖像Fig 6 Filtered image

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

接下來(lái)，對(duì)濾波后的水華微囊藻二值圖像(圖7)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，即數(shù)出圖像中白色連通區(qū)域的數(shù)目。本文采用四鄰域標(biāo)記法，即將圖像按照從左向右，從上向下的順序掃描，如果遇到第一個(gè)白色像素區(qū)域，假設(shè)為A點(diǎn)，就進(jìn)行從左至右，從下到上和從右至左，從上到下兩次圖像掃描來(lái)搜索其連通區(qū)域，掃描完成后將此連通區(qū)域標(biāo)記為1，并將此連通區(qū)域內(nèi)所有點(diǎn)置為黑色，這樣一個(gè)連通區(qū)域標(biāo)記完畢。繼續(xù)從A點(diǎn)按照掃描順序?qū)ふ蚁乱粋€(gè)白色像素區(qū)域，找到其連通區(qū)域并標(biāo)記為2，如此反復(fù)，直到整幅圖像掃描完畢，最大的區(qū)域標(biāo)記值即為所計(jì)的藻類(lèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)。

本次實(shí)驗(yàn)共對(duì)20幅水華微囊藻壓片樣本圖片進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與人工精確計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1。采用本文中方法計(jì)算水華微囊藻個(gè)數(shù)，采用式(1)計(jì)算水華微囊藻細(xì)胞濃度，所需時(shí)間為程序運(yùn)行時(shí)間，平均每幅圖像小于100 ms，加上顯微鏡頭移動(dòng)以及圖像的獲取時(shí)間，整個(gè)藻液細(xì)胞濃度測(cè)量耗時(shí)大約5 min。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板的人工方法一個(gè)顯微鏡視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)耗時(shí)2～10 min，平均測(cè)量一次藻液細(xì)胞濃度耗時(shí)3～4 h，且隨著工作時(shí)間的增加，人工出現(xiàn)誤差的概率不斷加大，要得到實(shí)際的藻細(xì)胞濃度，必須重復(fù)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

每一個(gè)顯微視野的實(shí)際面積是0.3 mm×0.4 mm，厚度0.1 mm，取100個(gè)視野進(jìn)行計(jì)算，最終水華微囊藻濃度(個(gè)/ml)

(1)

本文通過(guò)對(duì)三個(gè)不同濃度的藻液分別進(jìn)行傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)板法人工計(jì)數(shù)以及本文提出的熒光圖像處理法測(cè)量藻液的細(xì)胞濃度(萬(wàn)個(gè)/ml)，結(jié)果如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1結(jié)果可以看出：通過(guò)熒光圖像法與人工的細(xì)胞計(jì)數(shù)板法進(jìn)行的水華微囊藻細(xì)胞濃度檢測(cè)得到的結(jié)果基本一致，但由于采用傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)板法對(duì)水華微囊藻的濃度進(jìn)行測(cè)量，需要人工參與，每次計(jì)數(shù)需要消耗大量的時(shí)間，而且當(dāng)濃度過(guò)大，藻液雜質(zhì)過(guò)多時(shí)，計(jì)數(shù)員容易出現(xiàn)視覺(jué)疲勞從而導(dǎo)致重復(fù)計(jì)數(shù)，最終導(dǎo)致濃度測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。而本文提出的熒光圖像法不僅能有效濾除雜質(zhì)的干擾，而且計(jì)數(shù)效率高，測(cè)量結(jié)果穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

本文以水華微囊藻葉綠素a的熒光特性為依托，提出一種基于圖像處理的藻類(lèi)熒光圖像細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)方法。首先利用藻類(lèi)熒光特性，區(qū)分藻類(lèi)和雜質(zhì)；然后對(duì)得到的水華微囊藻熒光圖像進(jìn)行一系列的圖像處理操作，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；最終計(jì)算出藻液的細(xì)胞濃度。對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)三種不同濃度的藻液進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果與傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)板法接近，單幅圖像的計(jì)數(shù)時(shí)間小于100 ms。本文提出的基于圖像處理的熒光圖像方法測(cè)量精度不受藻液濃度的影響，具有較高的穩(wěn)定性和精度，為藻細(xì)胞的濃度檢測(cè)提供了一種新的便捷方法。

[1] 許慧萍.氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)水華微囊藻群體的影響研究[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2014.

[2] 瞿唯鋼,魏方林,劉梅鳳，等.藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中藻細(xì)胞計(jì)數(shù)方法比較[J]. 農(nóng)藥, 2013(7): 497- 502.

[3] 馮 菁,李艷波,朱 擎，等.浮游植物葉綠素a測(cè)定方法比較[J].生態(tài)環(huán)境,2008(2):524- 527.

[4] 丁 振,賈士儒,譚 寧.液體懸浮培養(yǎng)發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌生物量測(cè)定方法的條件確定及比較[J].中國(guó)釀造,2011(12):20-22.

[5] 齊彩亞.生物毒性對(duì)藻熒光影響規(guī)律的研究[D].石家莊:河北科技大學(xué),2012.

[6] 馬莉萍,毛 斌,劉 斌，等.生物傳感器的應(yīng)用現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J].傳感器與微系統(tǒng),2009,28(4):1-4.

[7] 張 靜,韋玉春,王國(guó)祥，等.太湖水體中藻藍(lán)蛋白的紫外—可見(jiàn)吸收光譜特征分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2014(5):1297-1301.

[8] 高 赟.圖像灰度增強(qiáng)算法的研究[D].西安:西安電子科技大學(xué),2007.

[9] 尚 晉,楊 有,李曉虹.一種改進(jìn)的自適應(yīng)直方圖均衡化增強(qiáng)檔案圖像的方法[J].計(jì)算機(jī)科學(xué),2007(5): 237-239.

[10] 李 梅.基于Otsu算法的圖像分割研究[D].合肥:合肥工業(yè)大學(xué),2011.

[11] 吳玉蓮. 圖像處理的中值濾波方法及其應(yīng)用[D].西安:西安電子科技大學(xué),2006.

[12] 丁亞軍,謝可夫.改進(jìn)型中值濾波和形態(tài)學(xué)組合降噪方法[J].計(jì)算機(jī)與現(xiàn)代化,2007(2):41-42，45.

王 鑫(1981-), 男, 山西靜樂(lè)人，博士, 講師, 從事傳感器網(wǎng)絡(luò)與多源信息融合方向研究工作。

Concentration detection of microcapsules by fluorescence image*

WANG Xin, HU Yang-yang

(Key Laboratory of Advanced Process Control for Light Industry,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Analyze on fluorescence excitation characteristics of microcystis flos-aquae chlorophyll a using image processing techniques by fluorescence spectrometer,microcystis flos aquae concentration automatic detection method based on algae fluorescence excitation effect is proposed.Fluorescence 430 nm is used as excitation light source,wavelength 680 nm microcystis flos-aquae fluorescence microscopic image is obtained,remove influence of other incident light by red filter chip,the image contains only microcystis flos-aquae fluorescence characteristics;and grayscale,binarization,filtering,count and algae liquid concentration measurement are carried out on the obtained fluorescence image.Experiments show that this method can distinguish the algae and impurities very well,concentration measurement results is accurate and computation speed is fast and provides a new convenient method for the algae concentration detection.

concentration detection; microcystis flos-aquae; fluorescence properties; automatic counting; image processing

10.13873/J.1000—9787(2016)12—0146—03

2016—01—12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(61304264); 江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20140166); 江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

O 212.8

A

1000—9787(2016)12—0146—03