齊珂珂 孫雨晴 萬 晶 鄧 波 門小明 吳 杰 徐子偉

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310021)

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豬胰高血糖素樣肽-2通過細胞外信號調節(jié)激酶1/2調節(jié)仔豬空腸上皮細胞緊密連接蛋白表達

齊珂珂 孫雨晴 萬 晶 鄧 波 門小明 吳 杰 徐子偉*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310021)

本試驗以體外培養(yǎng)的仔豬空腸上皮細胞(IPEC-J2)為研究對象，研究了豬胰高血糖素樣肽-2(pGLP-2)對緊密連接蛋白表達的調節(jié)及其信號傳導機制。培養(yǎng)液中分別添加10-9mol/L pGLP-2(pGLP-2組)和10-9mol/L pGLP-2、10 μmol/L U0126(pGLP-2+U0126組)，對照組不添加以上試劑，每組3個重復，每個重復1個培養(yǎng)孔。測定IPEC-J2胞質緊密黏連蛋白-1(ZO-1)、occludin、claudin-1以及細胞外信號調節(jié)激酶1/2(ERK1/2)蛋白表達量。結果表明：與對照組相比，IPEC-J2細胞培養(yǎng)液中添加pGLP-2顯著增加了ZO-1、occludin、claudin-1以及p42-ERK1/2、p44-ERK1/2的蛋白表達量(P<0.05)；與pGLP-2組相比，在IPEC-J2細胞培養(yǎng)液中加入ERK1/2的抑制劑U0126，顯著降低了ZO-1、occludin、claudin-1以及p42-ERK1/2、p44-ERK1/2的蛋白表達量(P<0.05)。綜合得出，ERK1/2通路是pGLP-2調控腸道上皮細胞緊密連接蛋白表達的一條重要信號通路。

豬胰高血糖素樣肽-2；細胞外信號調節(jié)激酶1/2；緊密連接蛋白

胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2,GLP-2)能夠特異性地促進腸黏膜生長與損傷后修復，且作用強于以往發(fā)現(xiàn)的其他非特異的腸生長因子，為治療各種因素引起的仔豬腸道損傷和功能紊亂提供了可能[1]。豬胰高血糖素樣肽-2(porcine glucagon-like peptide-2,pGLP-2)通過C端延長，含有35個氨基酸，與人胰高血糖素樣肽-2(human glucagon-like peptide-2,hGLP-2)具有相似的腸道促生長作用，pGLP-2在體內(nèi)的半衰期非常短，極易被血液中大量存在的二肽酰肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)快速降解[2]。GLP-2通過作用于GLP-2受體(GLP-2 receptor,GLP-2R)來調節(jié)腸上皮細胞的增殖及抑制其凋亡，從而保護腸道細胞[3-4]。GLP-2促進細胞增殖、抑制細胞凋亡以及細胞保護等作用的調節(jié)涉及多種細胞信號傳導途徑，主要有環(huán)化-磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)或磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI-3K/Akt)途徑、無翅型MMTV整合位點/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)途徑、細胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular regulated kinase 1/2,ERK1/2)等信號通路，但是GLP-2作用的信號傳導機制存在爭議[5-8]。GLP-2功能的多樣性以及研究所用的細胞模型不同是研究結果存在差異的主要原因，目前研究GLP-2作用機制的體外模型主要有Caco-2細胞[5]、BHK成纖維細胞[6]、Hela細胞[7]和HEK293細胞[8]等。本試驗使用仔豬空腸上皮細胞(porcine small intestinal epithelial cell from jejunum,IPEC-J2)作為研究對象，為研究外源pGLP-2在仔豬腸道損傷和功能紊亂中的應用提供了腸源的細胞模型。本試驗在研究pGLP-2對緊密連接蛋白表達影響的基礎上，通過添加ERK1/2信號傳導通路中的抑制劑U0126，研究pGLP-2調控緊密連接蛋白表達的信號通路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

IPEC-J2細胞系由中國農(nóng)業(yè)大學動物科學院王軍軍博士惠贈。[Gly2]pGLP-2(肽序列HGDGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITDSL)由杭州中肽生化有限公司合成。主要試劑有：DMEM/F12(Gibco,C11330500BT)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco,10099133)、100×胰島素鐵硒傳遞蛋白(insulin-transferrin-selenium,ITS)(Sigma,I3146)、青-鏈霉素(Gibco,15140122)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)(Sigma,E4127)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco,25200056)、豬ERK1/2抗體(Cell Signaling,4376s)，β肌動蛋白(β-actin)抗體(Santa Cruz,Sc47778)、胞質緊密黏連蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)抗體(Santa Cruz,Sc10804)，occludin抗體(Abcam,Ab312721)，claudin-1抗體(Abcam,Ab15099)，U0126(Cell Signaling,9903)，羊抗小鼠辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G(IgG-HRP)(Pierce,PA128568)。其他常規(guī)試劑及試劑盒購置于華東醫(yī)藥集團有限公司。

1.2 試驗方法及分組

IPEC-J2培養(yǎng)于75 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃ 5% CO295%濕度，使用完全培養(yǎng)基(93% DMEM/F12，5% FBS，1%ITS，1%青-鏈霉素，10 ng/mL EGF)進行培養(yǎng)，隔天換液，待80%細胞融合時用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液，按1×105個/孔接種至6孔板。待80%細胞匯合時，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，試驗采用單因子設計，共設3個處理(對照組、pGLP-2組和pGLP-2+U0126組)，每個處理3個重復，每個重復1個培養(yǎng)孔。對照組和pGLP-2組中加入含0、10-9mol/L的pGLP-2的無血清培養(yǎng)液過夜，pGLP-2+U0126組加入10 μmol/L U0126預處理1 h后，加入含10-9mol/L pGLP-2的無血清培養(yǎng)液，24 h后棄去培養(yǎng)液，用預熱的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加RIPA裂解細胞。

1.3 Western blotting檢測

目的蛋白表達量=目的蛋白光密度值/β-肌動蛋白光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用SAS 6.12軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及Duncan氏法多重比較，測定結果以“平均值±標準差”表示。

2 結 果

2.1 pGLP-2對緊密連接蛋白及ERK1/2蛋白表達量的影響

由圖1可見，與對照組相比，培養(yǎng)液中添加pGLP-2后，IPEC-J2緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1以及p42-ERK1/2、p44-ERK1/2的蛋白表達量顯著增加(P<0.05)。

2.2 抑制劑U0126對緊密連接蛋白及ERK1/2蛋白表達量的影響

由圖1可見，與pGLP-2組相比，在使用ERK1/2抑制劑U0126預處理后的IPEC-J2中添加pGLP-2，緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1以及p42-ERK1/2、p44-ERK1/2的蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。

&：與對照組相比差異顯著(P<0.05)；#：與pGLP-2組相比差異顯著(P<0.05)。 &: significant difference compared with control group (P<0.05); #: significant difference compared with pGLP-2 group (P<0.05).

3 討 論

GLP-2能夠有效地促進腸上皮細胞緊密連接蛋白的表達，增強腸道屏障功能。Dong等[9]報道GLP-2能夠顯著提高小鼠空腸緊連接關鍵蛋白occludin、claudin-3、claudin-7基因的表達量。Moran等[10]研究發(fā)現(xiàn)，GLP-2不僅能夠顯著增加Caco-2細胞緊密連接關鍵蛋白occludin和ZO-1的蛋白表達量，還能有效抑制由腫瘤壞死因子α(TNF-α)應激造成的occludin和ZO-1的蛋白表達量的降低。Wu等[11]證明一次注射[Gly2]pGLP-2微球可有效抑制葡聚糖硫酸鈉鹽(DSS)引起的小鼠結腸occludin表達量的降低。以IPEC-J2為研究模型的研究表明，GLP-2能夠顯著地改善正常培養(yǎng)條件下IPEC-J2細胞形態(tài)結構，提高緊密連接關鍵蛋白occludin、claudin-1和ZO-1基因的表達量[12]；GLP-2還能有效的抑制脂多糖(LPS)應激造成的IPEC-J2細胞形態(tài)的破壞和緊密連接關鍵蛋白基因表達量的下降。與以上結果相一致，本試驗發(fā)現(xiàn)IPEC-J2中添加pGLP-2后，緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的蛋白表達量顯著增加。

在對緊密連接蛋白的調控研究中發(fā)現(xiàn)，眾多生長因子能夠通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路調控緊密連接蛋白的表達，實現(xiàn)對屏障功能的調節(jié)[13]。ERK1/2信號通路是經(jīng)典MAPK信號傳導途徑，GLP-2可通過ERK1/2信號通路直接促進上皮細胞增殖。Jasleen等[14]使用10 nmol/L GLP-2刺激人腸上皮細胞株Caco-2，細胞內(nèi)活化形式ERK1/2含量明顯增加，細胞的增殖反應增加了10倍；細胞外調節(jié)蛋白激酶(MEK)抑制劑PD98059以劑量依賴性方式阻斷GLP-2的促細胞增殖作用。隨后Jasleen等[15]再次證明GLP-2促進Caco-2細胞增殖伴隨著ERK磷酸化水平的瞬間升高，這種反應會被MEK抑制劑PD98059所阻斷。但是Yusta等[16]則報道20 nmol/L的GLP-2沒有增加乳倉鼠腎成纖維細胞(baby hamster kidney fibroblasts,BHK)ERK1/2的磷酸化水平，反而降低了ERK1/2的基礎磷酸化水平，認為GLP-2的信號傳導不與p44/p42 MAPK途徑相偶聯(lián)，這可能與研究使用的細胞為腎源細胞有關。關于試驗所用的細胞模型表達GLP-2R與否對GLP-2R的信號傳導機制的影響，Koehler等[7]在Hela細胞上的研究發(fā)現(xiàn)GLP-2介導ERK1/2的激活不會通過減少GLP-2R cDNA的轉染而消除。Li等[17]研究也證明，小鼠小膠質瘤BV-2細胞雖然不表達GLP-2R，可是GLP-2減弱LPS引起的BV-2細胞炎性反應也是通過抑制ERK1/2信號通路實現(xiàn)的。也就是說，研究GLP-2調節(jié)腸道功能信號傳導機制的細胞模型不同，是引起此方面研究結果存在爭議的主要原因。U0126是MAPK激酶MEK1/2的高效選擇性抑制劑，比PD98059的抑制活性高100倍。以非競爭性方式抑制MEK1/2激酶的活性從而阻止分別由ERK2和ERK1基因編碼的p42 MAPK和p44 MAPK被激活。本試驗中添加U0126后，p42-ERK1/2、p44-ERK1/2的蛋白表達量顯著降低，且研究使用的IPEC-J2細胞系是正常生理狀態(tài)下的新生仔豬空腸上皮細胞系，是最理想的研究豬源的GLP-2調節(jié)腸道屏障功能的細胞模型。本試驗結果表明，使用10-9mol/L的pGLP-2處理IPEC-J2，可顯著增加緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1以及p42-ERK1/2、p44-ERK1/2的蛋白表達量，而用ERK1/2抑制劑U0126預處理后再添加pGLP-2，顯著抑制緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1以及p42-ERK1/2、p44-ERK1/2的蛋白表達量，說明ERK1/2通路是pGLP-2調控腸道上皮細胞緊密連接蛋白表達的一條重要信號通路。

4 結 論

ERK1/2抑制劑U0126能顯著抑制pGLP-2引起的ZO-1、occludin、claudin-1以及p42-ERK1/2、p44-ERK1/2蛋白表達量的增加，說明ERK1/2是pGLP-2調控腸道上皮細胞緊密連接蛋白表達的一條重要信號通路。

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*Corresponding author, professor, E-mail: zjsnkyxzw@163.com

(責任編輯 王智航)

Porcine Glucagon-Like Peptide-2 Regulates Tight Junction Protein Expressions in Porcine Small Intestinal Epithelial Cell through Extracellular Regulated Kinase 1/2 Signaling Pathway

QI Keke SUN Yuqing WAN Jing DENG Bo MEN Xiaoming WU Jie XU Ziwei*

(InstituteofAnimalScience,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021,China)

Porcine small intestinal epithelial cell from jejunum (IPEC-J2) was used to study the regulation of porcine glucagon-like peptide-2 (pGLP-2) on protein expressions of tight junction and its signaling pathway. Culture mediums were supplemented without (control group) or with 10-9mol/L pGLP-2 (pGLP-2 group), and 10-9mol/L pGLP-2 and 10 μmol/L U0126 (pGLP-2+U0126 group)， respectively. Each group had 3 replicates with 1 culture pore per replicate. Protein expressions of zonula occludens-1 (ZO-1), occluding, claudin-1 and extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) in cytoplasm of IPEC-J2 were determined. The results showed as follows: compared with control group, the supplementation of pGLP-2 in culture medium of IPEC-J2 significantly increased protein expressions of ZO-1, claudin-1, occludin, p42-ERK1/2 and p44-ERK1/2 (P<0.05); compared with pGLP-2 group, the supplementation of U0126, an inhibitor of ERK1/2, in culture medium of IPEC-J2 significantly decreased protein expressions of the above proteins (P<0.05). The results suggest that ERK1/2 pathway is an important signaling pathway of pGLP-2 regulating tight junction protein expressions in intestinal epithelial cells.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(12)：3912-3916]

porcine glucagon-like peptide-2; extracellular regulated kinase 1/2; tight junction protein

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.12.024

2016-06-01

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-36)；浙江省自然科學基金項目(LY15C170002)

齊珂珂(1981—)，女，河南偃師人，助理研究員，博士，主要從事畜禽健康養(yǎng)殖研究。E-mail: nkyqkk@163.com

*通信作者：徐子偉，研究員，博士生導師，E-mail: zjsnkyxzw@163.com

S828

A

1006-267X(2016)12-3912-05