位 蘭，張自強(qiáng)，朱雪敏，柴 磊

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471003；2.河南省焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心，河南焦作 454003)

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三苯基錫對雄性SD大鼠性腺發(fā)育的影響

位 蘭1，張自強(qiáng)1，朱雪敏1，柴 磊2

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471003；2.河南省焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心，河南焦作 454003)

為研究三苯基錫(TPT)對雄性哺乳動物生殖的毒性作用，將20只雄性青春期Sparague Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為3個不同劑量的試驗組(0.5、5、50μg/kg)和1個對照組(生理鹽水)。每3d灌胃1次，暴露54d，末次灌胃24h后用100g/L水合氯醛麻醉并處死大鼠，取其睪丸和附睪。采用石蠟切片和HE染色方法觀察睪丸和附睪組織學(xué)；采用分光光度法測定睪丸中堿性磷酸酶(AKP)、總抗氧化能力(T-AOC)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)水平。結(jié)果顯示，大鼠睪丸內(nèi)曲精小管直徑隨藥物劑量的增加而減小，曲精小管生精細(xì)胞和管腔內(nèi)精子數(shù)量均有不同程度減少；低、中劑量組AKP高于對照組，高劑量組低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)；低劑量組γ-GT活力和T-AOC顯著高于對照組，中劑量組與對照組相比變化不明顯，高劑量組顯著低于對照組(P<0.05)。試驗證實了TPT在一定程度上影響了雄性大鼠性腺生長發(fā)育與精子發(fā)生，推測TPT對雄性哺乳動物具有生殖毒性。

三苯基錫；雄性大鼠；生殖毒性

有機(jī)錫主要是三丁基錫(tributyltin，TBT) 和三苯基錫(triphenyltin，TPT) ，廣泛應(yīng)用于海洋船只防污涂料的添加劑，由于其對海洋生物的毒性作用，特別是生殖毒性而被高度關(guān)注。盡管TPT 和TBT 在環(huán)境中經(jīng)常同時存在，但相對于TBT，對TPT 的毒性研究還較少[1]。TPT為無色或白色的固體或液體，通常幾乎不溶于水，廣泛用于催化化學(xué)、藥物化學(xué)、聚氯乙烯穩(wěn)定劑、木材及紡織品防腐劑、工農(nóng)業(yè)殺蟲劑和殺菌劑及日常用品的涂料和防霉劑等，除了對海洋生物造成毒性作用，其對陸生物種也具有毒性作用，因為其廣泛存在于人們的生活環(huán)境中。

有機(jī)錫化合物可導(dǎo)致海洋動物性畸變，致使其性別比例失調(diào)，威脅到它們的族群生存[2]。林春芳等[3]報道魚類生命早期階段暴露于TBT和TPT可引起胚胎發(fā)育畸形、孵化延遲或抑制、生育力下降、精子減少等生殖問題。另有報道TPT對細(xì)胞增殖具有一定影響[4]，而且環(huán)境水平的TPT可以調(diào)節(jié)海馬區(qū)神經(jīng)興奮傳導(dǎo)[5]。有研究表明，6mg/kg TPT影響青春期雄性大鼠性發(fā)育[6]；但是針對環(huán)境水平下的三苯基錫含量對雄性動物生殖的影響及機(jī)制還沒有比較全面的研究報道。因此本研究以青春期雄性SD大鼠為研究對象，采用經(jīng)口灌胃的方式進(jìn)行染毒，從TPT對大鼠睪丸組織標(biāo)志性酶的影響和組織結(jié)構(gòu)的變化特征的角度探討其生殖毒性作用機(jī)制，為分析預(yù)測環(huán)境水平的TPT污染對動物以及人類健康的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 選用健康的SPF級青春期SD雄性大鼠20只，約20日齡，體重約200g，購于鄭州大學(xué)實驗動物中心。在正常實驗環(huán)境下，每日連續(xù)光照12h，室溫20℃±1℃，自由取食飲水，飼養(yǎng)10d后隨機(jī)分為4組：3個不同劑量(TPT0.5、5、50μg/kg)處理組和對照組(生理鹽水)，每組5只。

1.1.2 主要試劑 三苯基錫(TPT)純度97%為Fluka公司產(chǎn)品，先用無水乙醇配置成一定濃度的儲備液，4℃避光保存；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒(批號20100409)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)測定試劑盒(批號20100926)、總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(批號20100409)、堿性磷酸酶(AKP)測定試劑盒(批號20101220)均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 手搖式組織切片機(jī)(202-1)為上海醫(yī)療器械四廠產(chǎn)品；Beckman高速離心機(jī)(J2-MC)為美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品；奧林巴斯顯微鏡(BH-1)購自杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；MIE顯微圖像處理軟件為山東易創(chuàng)電子有限公司產(chǎn)品；UV 300紫外分光光度計，202-AD電熱恒溫干燥箱，單孔六列恒溫水浴鍋，電子天平，數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，M2SPECTRAMAX酶標(biāo)儀，移液槍，烤片臺等。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物處理與取材 各TPT處理組均用配好的濃度液灌胃，對照組給予等量溶劑(生理鹽水和無水乙醇)，每3日1次，暴露54d。末次染毒24h后用100g/L的水合氯醛麻醉動物，眼眶采血后處死，取雙側(cè)睪丸和附睪。將一側(cè)睪丸和附睪放入多聚甲醛固定液中固定以制作石蠟切片用于組織學(xué)檢查；另一側(cè)睪丸和附睪放入-20℃冰箱中凍存，用于標(biāo)志性酶活性的測定。

1.2.2 血液生化指標(biāo)的測定 準(zhǔn)確稱取睪丸和附睪分別放入勻漿器中，加入9倍體積生理鹽水制成10%的勻漿液，3000r/min離心10min，取上清液放入4℃冰箱中備用。γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)、堿性磷酸酶(AKP)和總抗氧化能力(T-AOC)測定均按照試劑盒說明書進(jìn)行。原理：γ-GT催化底物反應(yīng)，游離出對硝基苯胺，與受體作用。酶促反應(yīng)產(chǎn)物對硝基苯胺在410nm處有強(qiáng)吸收峰，可直接比色測定吸光度值，從而計算出γ-GT的活力。AKP分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)出游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺可以測定酶活力的高低。機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲林類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過比色法可測出其抗氧化能力的高低。

2 結(jié)果

2.1 TPT暴露SD大鼠與對照組大鼠睪丸和附睪組織結(jié)構(gòu)

TPT暴露組和對照組SD雄性大鼠睪丸和附睪組織學(xué)研究結(jié)果見圖1。對照組睪丸精曲小管結(jié)構(gòu)清晰，基膜完整，支持細(xì)胞、生精細(xì)胞排列整齊，各級生精細(xì)胞由外到內(nèi)依次為精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、生精細(xì)胞、精子，腔內(nèi)可見較多精子。支持細(xì)胞呈不規(guī)則的高柱狀或錐狀，細(xì)胞底部附著在基膜上，頂部伸達(dá)腔面。睪丸間質(zhì)疏松，組織結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)組織內(nèi)血管周圍可見散在的間質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞較大，呈圓形或不規(guī)則狀，核圓形(圖1A1、圖1A2)；TPT暴露組大鼠睪丸組織均有不同程度的損傷，主要表現(xiàn)為曲細(xì)精管內(nèi)大量生精細(xì)胞出現(xiàn)不同程度壞死，細(xì)胞核固縮凝聚，并出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，基膜脫落不完整。低劑量組大多數(shù)曲精小管排列正常，基膜完整，支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，少數(shù)曲精小管內(nèi)生精細(xì)胞數(shù)量與對照組組相比有所減少(圖1B1、圖1B2)；中劑量組大多數(shù)曲精小管內(nèi)生精細(xì)胞排列較稀疏，且發(fā)生輕度腫脹、變形現(xiàn)象，管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少(圖1C1、圖1C2)；高劑量組曲精小管的基膜脫落，結(jié)構(gòu)不完整，生精細(xì)胞排列稀疏，且嚴(yán)重變形、腫脹，間質(zhì)結(jié)構(gòu)不清晰(圖1D1、圖1D2)。對照組大鼠的附睪管排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，腔內(nèi)精子豐富，分布均勻，管周結(jié)締組織豐富(圖1a)；TPT暴露組出現(xiàn)附睪管管壁變薄，管腔變得不規(guī)則，輸出小管和附睪管上皮明顯變薄，管間組織與對照組相比較稀疏，且組織間隙增大，對附睪損傷程度隨TPT暴露劑量的增加而逐漸加重，呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)(圖1b、圖1c、圖1d)。

2.2 TPT暴露后SD大鼠睪丸標(biāo)志性酶的變化

TPT暴露后，比較各暴露組與對照組標(biāo)志性酶結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量組大鼠睪丸γ-GT活力較對照組顯著增高，高劑量組大鼠睪丸γ-GT活力較對照組顯著降低，中劑量組與對照組無顯著差異(P<0.05)(圖2A)。低劑量組大鼠睪丸T-AOC較對照組顯著增高，高劑量組大鼠睪丸T-AOC較對照組顯著降低，中劑量組與對照組無顯著差異(P<0.05)(圖2B)。高劑量組大鼠睪丸AKP較對照組低，低、中劑量組較對照組沒有明顯變化，統(tǒng)計學(xué)分析均無顯著差異(P<0.05)(圖2C)。

3 討論

3.1 TPT對SD大鼠睪丸和附睪生長發(fā)育及精子發(fā)生的影響

有研究報道，在1.4mg/(kg·d)～20mg/(kg·d)的劑量范圍內(nèi)，TPT就能對大鼠生殖功能和性腺形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不良影響。較高劑量時，睪丸和卵巢組織均發(fā)生病理學(xué)變化，并能導(dǎo)致大鼠不育[2]。體重是綜合反映動物全身健康狀況的最基本指標(biāo)之一。本試驗結(jié)果表明，隨著TPT劑量的增加，雄性大鼠體重先升高后降低。染毒組體重的變化說明低劑量的TPT對大鼠生長有促進(jìn)作用，而高劑量的TPT對大鼠的生長會產(chǎn)生抑制作用。動物在不同年齡段，其臟器系數(shù)值有一定規(guī)律，當(dāng)受到有害物質(zhì)影響時，該比值將發(fā)生改變。本試驗中，低劑量和中劑量組的體重及睪丸系數(shù)較對照組大，高劑量組低于對照組；附睪系數(shù)變化不明顯。

A1.對照組睪丸組織(HE 100×)；A2.對照組睪丸組織(HE 400×)；B1.低劑量組睪丸組織(HE 100×)；B2.低劑量組睪丸組織(HE 400×)；C1.中劑量組睪丸組織(HE 100×)；C2.中劑量組睪丸組織(HE 400×)；D1.高劑量組睪丸組織(HE 100×)；D2.高劑量組睪丸組織(HE 400×)；a.對照組附睪組織(HE 400×)；b.低劑量組附睪組織(HE 400×)；c.中劑量組附睪組織(HE 400×)；d.高劑量組附睪組織(HE 400×)
A1.Testis tissue in control group(HE 100×)；A2.Testis tissue in control group(HE 400×)；B1.Testis tissue in low-dose group(HE 100×)；B2.Testis tissue in low-dose group(HE 400×)；C1.Testis tissue in middle-dose group(HE 100×)；C2.Testis tissue in middle-dose group(HE 400×)；D1.Testis tissue in high-dose group(HE 100×)；D2.Testis tissue in high-dose group( HE 400×)；a.Epididymis tissue in control group(HE 400×)；b.Epididymis tissue in low-dose group(HE 400×)；c.Epididymis tissue in middle-dose group(HE 400×)；d.Epididymis tissue in high-dose group(HE 400×)

圖1 TPT暴露后SD大鼠睪丸和附睪組織學(xué)變化
Fig.1 Histological changes in the testis and epididymis of SD rats exposed to TPT

精子發(fā)生包括從精原細(xì)胞到精子形成這一連續(xù)增殖分化的過程，對有害因素的作用十分敏感，環(huán)境化學(xué)物可在不同的階段干擾精子的發(fā)生過程。因此，評價精子的數(shù)量、活動能力和形態(tài)可以反映環(huán)境因素對雄性生殖最終的毒性效應(yīng)，是雄性生殖毒性評價不可缺少的觀察終點。環(huán)境中影響生殖的因素很多，有研究表明環(huán)境雌激素辛基酚可導(dǎo)致小鼠附睪管萎縮，管腔內(nèi)少見或沒有成熟的精子[7]。另有報道，乙烯雌酚處理后小鼠的曲精小管排列疏松、無規(guī)則，各種生精細(xì)胞的數(shù)量減少，有2層～3層細(xì)胞，精原細(xì)胞與初級精母細(xì)胞之間出現(xiàn)裂隙[8]。足夠的精子數(shù)量是維持正常生育力的重要前提，精子數(shù)量的減少常常是各種化學(xué)物質(zhì)對各級生精細(xì)胞生長與發(fā)育產(chǎn)生毒性作用的結(jié)果。精子形態(tài)是評價化學(xué)物質(zhì)對精子遺傳物質(zhì)產(chǎn)生不良的潛在性影響的間接指標(biāo)。精子形態(tài)的改變反映雄性生殖細(xì)胞的遺傳損傷，精子畸形率的高低，可反映該化學(xué)毒物的生殖毒性和對生殖細(xì)胞潛在的致突變性[9]。附睪是哺乳動物修飾來自睪丸的精子，使之達(dá)到生理和功能的成熟并貯存精子的器官。其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常變化將會影響精子品質(zhì)，甚至造成不育。本試驗結(jié)果表明TPT暴露后SD大鼠附睪管管壁變薄，管腔不規(guī)則，輸出小管和附睪管上皮明顯變薄，且附睪內(nèi)精子的畸形率呈上升趨勢，并且與TPT劑量有嚴(yán)格的依賴性，精子數(shù)量隨著藥物劑量的增加明顯減少，表明TPT干擾精子正常生長與成熟，對精子生成具有潛在的不利影響。

A.TPT暴露后睪丸內(nèi)γ-GT的變化；B.TPT暴露后睪丸內(nèi)T-AOC的變化；C.TPT暴露后睪丸內(nèi)AKP的變化
A.The change of γ-GT in SD rats exposed to TPT；B.The change of T-AOC in SD rats exposed to TPT；C.The change of AKP in SD rats exposed to TPT

上標(biāo)不同字母的組間示差異顯著(P<0.05)。
There is significant difference between groups with different letters(P<0.05).

圖2 TPT暴露后SD大鼠睪丸標(biāo)志性酶的變化
Fig.2 The changes of testicular marker enzymes in SD rats exposed to TPT

睪丸曲細(xì)精小管的支持細(xì)胞有多種功能，包括支持、營養(yǎng)生精細(xì)胞，參與血睪屏障的形成，分泌少量液體，有助于精子的運動等，而各級生精細(xì)胞是精子形成的前提。本試驗結(jié)果表明，隨著TPT染毒劑量的增加，曲精小管萎縮，間質(zhì)組織不同程度的增寬，各級生精細(xì)胞減少，管腔內(nèi)精子數(shù)降低，部分管腔內(nèi)精子缺失。有研究報道有機(jī)砷、有機(jī)鉛和有機(jī)汞等有機(jī)金屬化合物對小鼠精子的毒性很強(qiáng)，能明顯降低小鼠精子質(zhì)量。有機(jī)錫能引起小鼠睪丸萎縮，降低精子質(zhì)量，毒性強(qiáng)度與有機(jī)金屬化合物相似。其影響機(jī)理可能與其抑制實驗動物的生殖生理功能、酶系活性以及破壞生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。因此推測TPT產(chǎn)生毒性效應(yīng)的作用機(jī)制之一可能是TPT透過血睪屏障而作用于生精細(xì)胞，雄性生殖器官是TPT毒性作用的主要靶器官，通過影響睪丸正常的生精過程，從而干擾精子的生長、發(fā)育和能量代謝過程。

3.2 TPT對SD大鼠睪丸組織標(biāo)志性酶的影響

精子發(fā)生需要經(jīng)歷一系列復(fù)雜的變化過程，每個階段都依賴于能量的供應(yīng)。由于酶的催化是能量產(chǎn)生不可缺少的重要條件，因此正常的精子數(shù)量和質(zhì)量有賴于生精過程中各種酶活性的維持。闡明化學(xué)物質(zhì)對睪丸各類細(xì)胞標(biāo)志酶的影響，有助于解釋靶細(xì)胞的定位和精子發(fā)生障礙的機(jī)制。AKP主要存在于精原細(xì)胞、胚胎期初級精母細(xì)胞及各級生精細(xì)胞與支持細(xì)胞的交界面上，參與睪丸生殖細(xì)胞增殖、分裂與分化時的營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，生精細(xì)胞的分裂活動密切相關(guān)，并參與營養(yǎng)物質(zhì)向各級生精細(xì)胞的轉(zhuǎn)運，因此通過檢測AKP水平的變化可以反應(yīng)污染物對睪丸的損傷和毒性作用[10]，AKP活性下降勢必干擾各級生精細(xì)胞的營養(yǎng)和能量供應(yīng)，其活力在精原細(xì)胞和早期發(fā)育時期的初級精母細(xì)胞較強(qiáng)[11]。本試驗結(jié)果顯示，各暴露組AKP的活力與對照組相比變化不明顯。

γ-GT是睪丸支持細(xì)胞的特異標(biāo)志酶，主要存在于支持細(xì)胞上，它的活性與支持細(xì)胞的功能息息相關(guān)。支持細(xì)胞在精子發(fā)生過程中具有提供營養(yǎng)、支持和保護(hù)的作用，有利于生殖細(xì)胞順利發(fā)育成為成熟的精子，γ-GT活性的降低表明支持細(xì)胞機(jī)能受到了損傷[12-13]。本研究結(jié)果表明，低劑量暴露組γ-GT的活力出現(xiàn)代償性升高，高劑量組明顯降低，說明高劑量組對支持細(xì)胞受到了嚴(yán)重?fù)p傷。

抗氧化物是指與可氧化的底物相比以低劑量存在時，能顯著地延緩或阻止對底物氧化性損傷的物質(zhì)。正常機(jī)體內(nèi)存在一套有效的抗氧化防御系統(tǒng)，可以清除氧自由基及其代謝產(chǎn)物。組織T-AOC既可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力，也容易測其含量[14]。有研究通過檢測T-AOC的水平作為評價葡萄籽原花青素減輕砷致生殖毒性的能力[15]。本試驗表明低劑量處理組大鼠睪丸T-AOC較對照組高，中、高劑量組大鼠睪丸T-AOC低于對照組。通過以上睪丸內(nèi)酶含量的變化，表明TPT干擾了各級生精細(xì)胞的能量代謝過程，導(dǎo)致精子的發(fā)育和成熟過程中能量供應(yīng)障礙。

本試驗通過對不同劑量TPT暴露后SD大鼠的精子形態(tài)、睪丸和附睪組織形態(tài)和標(biāo)志性酶水平變化的研究，顯示了中、高劑量(5μg/kg和50μg/kg)TPT影響了睪丸正常的生精過程，干擾了精子的生長、發(fā)育和能量代謝過程，導(dǎo)致大鼠精子數(shù)量和活力下降，精子畸形率增加，對雄性大鼠的生精功能已經(jīng)產(chǎn)生了損害作用，提示一定劑量的TPT對雄性哺乳動物的生殖具有毒性作用。

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Influence of Triphenyltin Exposure on Gonad in Male SD Rats

WEI Lan1,ZHANG Zi-qiang1,ZHU Xue-min1,CHAI Lei2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang,Henan，471003，China；2.SurveillanceCenterofAnimalProducts，Jiaozuo，Henan，454003，China)

To study the effects of environment level triphenyltin (TPT) on mammalian male reproductive toxicity,20healthy SD adult male rats were randomly divided into four groups.Different doses of triphenyltin (TPT) (0,0.5,5and 50μg/kg) and a control group were administrated to the rats every 3days for 54days.The rats were killed when they were anesthetized with 10% chloral hydrate after the last test substance given for 24h.The changes of the testis and epididymis were observed by paraffin sections and HE staining; the level of alkaline phosphatase (AKP),total antioxidant capacity (T-AOC) and γ-glutamyl GGT (γ-GT) in testicular enzymes were determined by spectrophotometion.Compared with the control group,it showed that,rat testis seminiferous tubule diameter increased with increasing TPT,but seminiferous tubule germ cells and sperms decreased varying degrees; compared with the control group,the levels of AKP in testis of rats in low and middle dose groups increased but that decreased in high dose group,the difference was not significant (P>0.05); the levels of γ-GT and T-AOC in testis of rats in low dose increased significantly,that in middle dose group did not change significantly,that in high dose group was significantly decreased (P<0.05).This experiment confirmed TPT influences the growth and development of gonad and sperms,we presumed TPT may have reproduction toxicity to male mammals.

triphenyltin; male rat; reproductive toxicity

2015-07-06

位 蘭(1980-)，女，河南項城人，博士，主要從事畜禽解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)研究。

S857.2;O614.32

A

1007-5038(2016)01-0047-05