王建華，趙祥平，董志珍，肖 妍，王玉玲，張俊哲，陳小金，王乃福，陳本龍，趙 丹

(天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津 300456)

?

尼帕病毒與豬流感病毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立

王建華，趙祥平*，董志珍，肖 妍，王玉玲，張俊哲，陳小金，王乃福，陳本龍，趙 丹

(天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津 300456)

根據(jù)尼帕病毒(NiV)M基因和豬流感病毒(SIV)M基因序列設(shè)計引物和TaqMan-MGB探針，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了一種鑒別NiV和SIV的雙重實時熒光定量RT-PCR檢測方法，對該方法的定量線性范圍、敏感性、重復(fù)性和特異性進行了評價及初步應(yīng)用。結(jié)果顯示，用該方法檢測NiV M基因的RNA標準對照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA標準對照(SIV-M-RNA)，定量線性范圍分別為4.6×101copies /μL～4.6×108copies /μL和5.8×101copies /μL～5.8×108copies /μL，檢出限分別為46個拷貝和58個拷貝。該方法的組內(nèi)試驗和組間試驗的變異系數(shù)均小于1.6%，顯示其良好的可重復(fù)性。該方法僅對NiV-M-RNA和SIV呈現(xiàn)特異性擴增曲線，不與豬瘟病毒(CSFV)、豬流行腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)和偽狂犬病病毒(PRV)發(fā)生交叉反應(yīng)。用該方法對236份豬的鼻拭子樣品進行NiV和SIV的同時檢測，所有樣本的NiV檢測結(jié)果均為陰性，有1份樣本的SIV檢測結(jié)果為陽性。本研究建立的方法可為豬臨床樣本中NiV和SIV的鑒別檢測提供了一種快速、敏感和特異的技術(shù)手段。

尼帕病毒；豬流感病毒；TaqMan-MGB探針；雙重?zé)晒舛縍T-PCR

20世紀90年代末，在馬來西亞確定了一種以侵害人和豬的神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)為主要特征的新病毒——尼帕病毒(Nipah virus，NiV)[1]。該病毒的基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA，全長約18.2kb，含有6個轉(zhuǎn)錄單位，依次編碼核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、受體結(jié)合蛋白(G)和大蛋白(L)等6個結(jié)構(gòu)蛋白[2]。流行病學(xué)研究表明，狐蝠是尼帕病毒的自然宿主，尼帕病毒對蝙蝠不致病，對豬有一定的致病性，但對人的致病力很強，病死率可達40%～70%[3]。尼帕病毒可在感染豬體內(nèi)大量繁殖，病毒血癥持續(xù)時間較長，通過呼吸道、尿液、糞便等途徑向外界散播病原，人類通過與病豬及其樣本接觸可以感染尼帕病毒[3]。因此，對豬尼帕病毒感染的監(jiān)測是防控人類尼帕病毒感染的重要措施。在我國的華南地區(qū)和東南部沿海島嶼有著廣泛的果蝠分布且與人畜有重疊活動范圍，因此，在理論上我國存在自然發(fā)生人和豬的尼帕病毒感染的可能性[4-5]。豬流感 (Swine influenza，SI)是由豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的一種豬的急性、熱性和高度接觸性呼吸道傳染病，該病不僅給畜牧養(yǎng)殖造成了嚴重的經(jīng)濟損失，而且具有重要的公共衛(wèi)生意義[6-8]。SIV屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，為單股負鏈RNA病毒，其基因組約為13.6kb，由大小不等的8個獨立片段組成[6]。在我國豬群中存在H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等SIV感染，其中以H3N2和H1N1亞型流行和危害比較嚴重[9-10]。由于豬的尼帕病毒感染與豬流感病毒感染有相似的癥狀表現(xiàn)，僅憑臨床癥狀無法準確區(qū)分這2種動物疫病。在當前我國豬群普遍存在SIV感染的背景下，一旦出現(xiàn)疑似豬尼帕病毒感染疫情時，需要對臨床疑似發(fā)病豬進行NiV和SIV的鑒別檢測，為及早發(fā)現(xiàn)和迅速控制豬及人的尼帕病毒感染提供病原學(xué)依據(jù)。近年來，國內(nèi)外針對NiV和SIV建立了常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法[11-14]。本研究以NiV M基因和SIV M基因為靶序列，建立了一種鑒別NiV和SIV的雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株及質(zhì)粒載體 豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬流感病毒(SIV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)及E.coliDH5α，均由天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心反芻動物檢疫國家重點實驗室保存;克隆載體PCR2.1為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 TRIzol LS Reagent 為Invetrogent公司產(chǎn)品；TaKaRa ExTaqRDNA 聚合酶、PstⅠ 限制性內(nèi)切酶、One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖袨楸本┣f盟國際生物基因科技有限公司產(chǎn)品；Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 、RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System T7為Promega公司產(chǎn)品。

1.1.3 臨床樣本 總計為236份鼻拭子樣品，其中210份樣品采自進境隔離檢疫期間的美國進口種豬，26份樣品采自國內(nèi)某豬場的育肥豬。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針的設(shè)計與合成 選取NiV M基因和SIV M基因序列的保守區(qū)，用Beacon Designer7.0軟件設(shè)計分別引物和TaqMan-MGB探針，然后在GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上用Blast進行特異性和保守性的比較分析，最終確定的引物和探針序列見表1，預(yù)期擴增片段長度分別為70bp和74bp，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，針對NiV M基因的探針序列5′端用FAM標記，3′端用MGB標記，針對NiV M基因的探針序列5′端用VIC標記，3′端用MGB標記。

1.2.2 RNA標準對照的制備 根據(jù)NiV UMMC2株的M基因序列(AJ564623)和A/swine/Guangxi/NS1402/2012(H3N2)株(KM028482.1)各自設(shè)計4條寡核酸鏈，用于RNA標準對照的制備，序列見表2。以NIPAH-M -F1/ NIPAH-M -R1為模板、NIPAH-M -F2/ NIPAH-M -R2為引物按常規(guī)PCR方法進行擴增，將擴增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，與PCR2.1克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性重組克隆，由上海英駿生物技術(shù)有限公司測序鑒定。以經(jīng)PstⅠ酶切線性化的陽性重組質(zhì)粒DNA為模板，采用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7試劑盒按說明書進行體外轉(zhuǎn)錄，對獲得的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行RQ1DNA酶消化及純化后即制備成含有NiV M基因靶序列的RNA標準對照，命名為NiV-M-RNA。用核酸蛋白分析儀測定NiV-M-RNA的濃度，按公式y(tǒng)(copies/μL)= [x(g/μL)RNA/(transcript length in nucleotides × 340)]×6.02× 1023，換算其拷貝數(shù)為4.6×108/μL。以SIV-M-F1/ SIV-M-R1為模板、SIV-M-F2/ SIV-M-R2為引物按常規(guī)PCR方法進行擴增，按上述方法同樣制備含有SIV M基因靶序列的RNA標準對照，命名為SIV-M-RNA，拷貝數(shù)為5.8×108/μL。

表1 用于檢測NIV和SIV的引物與探針序列Table 1 Sequences of primers and probes for the detection of NIV and SIV

表2 用于制備RNA標準對照的寡核酸鏈Table 2 Oligonucleotides for preparation of RNA standard

1.2.3 雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 試驗采用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect real-time)試劑，在Light Cycler○R480熒光PCR(Rochi)儀上，在確定對NiV-M-RNA(4.6×106copies/μL)和SIV-M-RNA(5.8×106copies/μL)的單一熒光定量RT-PCR反應(yīng)的最適引物和探針濃度的基礎(chǔ)上，主要對25μL雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系下的混合引物和探針濃度，以及56℃～61℃范圍內(nèi)的退火延伸溫度做進一步優(yōu)化試驗，以確定最適的反應(yīng)條件。

1.2.4 標準曲線的繪制 對NiV-M-RNA和SIV-M-RNA進行10倍系列稀釋，使其濃度范圍分別為4.6×101～4.6×107copies/μL和5.8×101～5.8×107copies/μL。在優(yōu)化的25μL雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)條件下，對每個稀釋度的NiV-M-RNA吸取1μL為模板進行RT-PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后以Ct值為橫坐標、NiV-M-RNA模板起始拷貝數(shù)濃度的對數(shù)為縱坐標繪制定量標準曲線，按同樣方法繪制SIV-M-RNA的定量標準曲線。

1.2.5 敏感性、重復(fù)性和特異性試驗 對濃度范圍為4.6×101～4.6×108copies/μL的NiV-M-RNA和5.8×101～5.8×108copies/μL的SIV-M-RNA，分別吸取1μL為模板按優(yōu)化的雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)條件進行試驗，以確定該方法可以檢測NiV-M-RNA和SIV-M-RNA的最低拷貝數(shù)。對5個濃度的NiV-M-RNA和SIV-M-RNA分別取1μL為模板，分別進行組內(nèi)試驗和組間試驗，以確定該方法的重復(fù)性。以NiV-M-RNA、CSFV、PRRSV和SIV的基因組RNA以及PRV、PPV和PCV2的基因組DNA為模板，按優(yōu)化的雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)條件進行檢測，以確定該方法的特異性。

1.2.6 臨床樣本檢測 對2012年-2014年保存的210份進口豬和26份國內(nèi)某豬場豬的鼻拭子樣品，用常規(guī)的樣本處理和Trizol試劑方法提取樣品RNA，采用本研究建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法進行NIV和SIV核酸檢測，以評價該方法的適用性。

2 結(jié)果

2.1 雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

以NiV-M-RNA(4.6×106copies /μL)和SIV-M-RNA(5.8×106copies /μL)為模板，通過對不同濃度組合的引物和標記探針及對56℃～61℃范圍的退火延伸溫度的優(yōu)化試驗，最終確定的雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系為：在25μL反應(yīng)體系中，依次加入2×One Step RT-PCR bufferⅢ 12.5μL，TaKaRa ExTaqHS (5U /μL) 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5μL，NIPHA-M-F(15pmmol/μL)、NIPHA-M-R(15pmmol/μL)、NIPHA-M-P(5pmmol/μL) SIV-M-F(12pmmol/μL)SIV-M-R(12pmmol/μL)和SIV-M-P(5pmmol/μL)各0.5μL，模板適量，補足水至25μL 。反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 2min ；95℃ 10s，56℃ 10s ，60℃ 30s，45個循環(huán)；在每次循環(huán)的60℃延伸擴增結(jié)束前采集FAM通道和VIC通道熒光信號。在最適反應(yīng)條件下，對4.6×106copies /μL 濃度的NiV-M-RNA和5.8×106copies /μL 濃度的SIV-M-RNA進行擴增，呈現(xiàn)典型的S型熒光定量PCR反應(yīng)動力學(xué)擴增曲線，見圖1。

圖1 NiV-M-RNA(4.6×106copies /μL) (A)和SIV-M-RNA(5.8×106copies /μL)(B)的雙重?zé)晒舛縍T-PCR動力學(xué)曲線
Fig.1 The duplex real-time PCR dynamic curve of the NiV-M-RNA(4.6×106copies /μL) (A)and SIV-M-RNA(5.8×106copies /μL)(B)

2.2 標準曲線的繪制

對10倍系列稀釋的NiV-M-RNA和SIV-M-RNA，按優(yōu)化后的雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)條件進行檢測,擴增曲線見圖2A和圖2B，以起始模板濃度的對數(shù)為X軸，Ct值為Y軸繪制成的標準曲線見圖2C圖2D。對NiV-M-RNA的定量檢測的線性范圍為4.6×101～4.6copies/μL×108copies/μL，線性關(guān)系表達式為y=-3.417x+37.526，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9995。對SIV-M-RNA的定量檢測的線性范圍為5.8×101copies /μL～5.8×108copies /μL，線性關(guān)系表達式為y=-3.2618x+37.649，R2為0.9983。

2.3 方法的敏感性

對濃度范圍為4.6×101copies /μL～4.6×108copies /μL的NiV-M-RNA和5.8×101copies /μL～5.8×108copies /μL的SIV-M-RNA，按優(yōu)化后的雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)條件進行檢測,擴增曲線見圖2A和圖2B，由圖2可知該方法最低可檢出46拷貝數(shù)的NiV-M-RNA分子和58拷貝數(shù)的SIV-M-RNA分子。

2.4 方法的重復(fù)性

分別選取3個濃度的NiV-M-RNARNA (4.6×103copies /μL～4.6×105copies /μL)和SIV-M-RNA (5.8×103copies /μL～5.8×105copies /μL)的標準對照為模板，進行雙重?zé)晒舛縍T-PCR的組內(nèi)試驗和組間重試驗，每個稀釋度的Ct值的平均值(Mean±SD)及變異系數(shù)(CV)見表3，Ct值變異系數(shù)均小于1.6%，表明本試驗所建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測體系穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

A.NiV-M-RNA(4.6×101copies/μL～4.6×107copies /μL)的擴增曲線；B.SIV-M-RNA(5.8×101copies/μL～5.8×107copies /μL)的擴增曲線；C.NiV-M-RNA(4.6×101copies/μL～4.6×107copies /μL)的標準曲線；D.SIV-M-RNA(5.8×101copies/μL～5.8×107copies /μL)的標準曲線
A.The dynamic curve of NiV-M-RNA(4.6×101copies/μL-4.6×107copies /μL);B.The dynamic curve of SIV-M-RNA(5.8×101copies/μL-5.8×107copies /μL);C.The linear range of NiV-M-RNA(4.6×101copies/μL-4.6×107copies /μL);D.The linear range of NiV-M-RNA(5.8×101copies/μL-5.8×107copies /μL)

圖2 NiV-M-RNA和SIV-M-RNA的雙重?zé)晒舛縍T-PCR的敏感性試驗和線性范圍
Fig.2 Sensitivity and linear range of the duplex real-time RT-PCR assay for detection of NiV-M-RNA and SIV-M-RNA

表3 雙重?zé)晒舛縍T-PCR重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Reproducibility of the duplex real-time RT-PCR

2.5 方法的特異性

應(yīng)用本試驗建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法對NiV-M-RNA、CSFV、PRRSV和SIV的基因組RNA及PRV、PPV和PCV2的基因組DNA進行檢測，結(jié)果見圖3。由圖3可知，僅NiV-M-RNA和SIV出現(xiàn)典型的擴增曲線，而CSFV、PRRSV、PEDV和PRV、PPV和PCV-2均無擴增曲線出現(xiàn)，表明該方法檢測NiV和SIV核酸有良好的特異性。

A.NiV-M-RNA的特異性，a.NiV-M-RNA的擴增曲線;b.CSFV、PRRSV、PEDV、PRV、PPV和PCV2的擴增曲線
B.SIV的特異性，c.SIV的擴增曲線;d.CSFV,PRRSV、PEDV、PRV、PPV和PCV2的擴增曲線
A.Specficity of NiV-M-RNA.a.The dynamic curve of NiV-M-RNA; b.The dynamic curves of CSFV，PRRSV,PEDV,PRV,PPV and PCV2
B.Specficity of the SIV.c.The dynamic curve of SIV; d.The dynamic curves of CSFV,PRRSV,PEDV,PRV,PPV and PCV2

圖3 雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測NiV-M-RNA和SIV RNA的特異性
Fig.3 Specficity of the duplex real-time RT-PCR for detection of NiV-M-RNA and SIV RNA

2.6 臨床樣本檢測結(jié)果

對進口種豬和國內(nèi)某豬場的豬鼻拭子樣品，采用本研究建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法進行NIV和SIV核酸檢測，結(jié)果210份進口豬鼻拭子樣品的NIV和SIV核酸檢測結(jié)果均為陰性，26份國內(nèi)某豬場的豬鼻拭子樣品(B組)的NIV核酸檢測結(jié)果均為陰性，其中有1份鼻拭子樣品的SIV核酸檢測結(jié)果為陽性，其余25份樣品的SIV核酸檢測結(jié)果均為陽性。

3 討論

NiV感染是一種嚴重危害人類健康和養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的自然疫源性疾病[1-3]，盡管我國目前尚無人和豬的NiV感染的報道，但存在自然發(fā)生人和豬的NiV感染疫情的風(fēng)險[4-5]，應(yīng)引起足夠的重視。豬的尼帕病毒感染主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀和呼吸道癥狀[3]，與豬的其他常發(fā)傳染病如豬流感等具有相似的臨床表現(xiàn)，不易從臨床癥狀上加以區(qū)分。此外，人通過密切接觸感染豬可發(fā)生高致死率的NiV感染[1,3]，一旦發(fā)生豬尼帕病毒感染疫情未被及時發(fā)現(xiàn)而擴散的情況，不僅給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重沖擊，也會給我國社會公眾安全帶來巨大威脅。因此，建立一種能夠快速、敏感和特異地鑒別NiV與SIV方法，對于防范尼帕病毒感染的傳入及傳播具有重要意義。多重?zé)晒舛縋CR方法可同時檢測多種病原核酸，具有一次擴增反應(yīng)就能快速、經(jīng)濟、敏感地鑒別檢測多種病原的優(yōu)點。鑒于此，本研究建立了一種鑒別NiV與SIV的雙重TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法，為臨床樣本中NiV與SIV的鑒別檢測、流行病學(xué)調(diào)查與監(jiān)測提供技術(shù)手段。

引物及探針序列的特異性及保守性是決定熒光定量RT-PCR方法特異性和準確性的關(guān)鍵因素，本研究對基于NIV M基因和SIV M基因保守性較高的區(qū)域設(shè)計多套引物和探針，并通過GenBank數(shù)據(jù)庫的Blast序列比對選擇特異性及保守性最高的兩套引物和探針，其中針對NIV M基因的引物及探針完全覆蓋目前已公布的13條NIV毒株序列，盡管SIV存在眾多亞型且公布的毒株序列數(shù)量巨大，但針對SIV M基因設(shè)計的引物及探針仍可覆蓋絕大部分SIV毒株，具有很高保守性。特異性試驗結(jié)果表明，該方法僅對NIV M基因和SIV M基因的RNA標準對照呈現(xiàn)特異性擴增，不與PRRSV、PEDV、CSFV、PRV、PPV和PCV2發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。該方法對NIV M基因和SIV M基因的RNA標準對照的定量檢測顯示良好的線性范圍，檢出限分別為46個拷貝和58個拷貝，兩套引物和探針之間無干擾，而且重復(fù)性也很好，批內(nèi)試驗和批間試驗的變易系數(shù)均小于2.5%。通過體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒RNA模板，是目前在沒有病原條件下建立實時熒光RT-PCR方法的常用手段。由于NiV為生物安全4級水平(BSL-4)的病原體，凡是涉及操作NiV活毒的試驗活動均須在BSL-4實驗室條件下進行。采用寡核苷酸鏈PCR擴增、PCR產(chǎn)物克隆和DNA體外轉(zhuǎn)錄策略，本研究制備了包含靶序列的NIV M基因和NIV M基因的RNA標準對照。用這種方法制備的RNA標準對照具有高穩(wěn)定性并可以定量，完全可以用于最適引物及探針的篩選、反應(yīng)條件優(yōu)化和標準曲線建立等試驗。本研究采用的是TaqMan-MGB探針，在保證高退火溫度和降低本地?zé)晒夥磻?yīng)的條件下，該型探針允許使用較短序列長度的探針，從而可以提高探針對檢測靶序列的特異性和保守性。此外，受樣本和毒株來源的限制，本研究僅對部分臨床樣本和毒株進行了檢測，需要在今后工作中進一步擴大對臨床樣本與毒株的檢測數(shù)量，以期對該方法做進一步的驗證和改進。

[1] Escaffre O,Borisevich V,Rockx B,et al.Pathogenesis of hendra and nipah virus infection in humans[J].J Infect Dev Ctries,2013,7(4):308-311.

[2] Liu Qian,Birgit Bradel-Tretheway A,Abrrey I A,et al.Nipah virus attachment glycoprotein stalk C-terminal region links receptor binding to fusion triggering[J].J Virol,2015,89(3):1838-1850.

[3] Luby S P.The pandemic potential of Nipah virus[J].Antiviral Res,2013,100(1):38-43

[4] 張海林.我國蝙蝠攜帶新發(fā)現(xiàn)病毒的研究進展[J].中國媒介生物學(xué)及控制雜志,2015(3):223-227.

[5] 仇松寅,林祥梅,劉 建,等.尼帕病毒病的風(fēng)險分析與防控措施[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2013(9):7.

[6] 楊 帥,朱聞斐,舒躍龍.豬流感病毒概述[J].病毒學(xué)報,2013(3):330-336.

[7] Zu Rongqiang,Dong Libo,Qi Xian,et al.Virological and serological study of human infection with swine influenza A H1N1virus in China[J].Virology,2013,446(1-2):49-55.

[8] Piralla A,Moreno A,Orlandi M E,et al.Swine influenza A(H3N2) virus infection in immunocompromised man,Italy,2014[J].Emerg Infect Dis,2015,21(7):1189-1191.

[9] 陳 櫻,於慶雄,銀鳳桂,等.2009-2013年廣西H1N1和H3N2亞型豬流感病毒血清學(xué)調(diào)查[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015(1):155-159.

[10] 孟慧芝,孫 濤,岳志芹,等.一株H1N1亞型豬流感病毒全基因克隆及遺傳特性分析[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2015,36(6):48-53.

[11] Guillaume V,Lefeuvre A,Faure C,et al.Specific detection of Nipah virus using real-time RT-PCR (TaqMan)[J].J Virol Meth,2004,120(2):229-237.

[12] Zhang J,Harmon K M.RNA extraction from swine samples and detection of influenza A virus in swine by real-time RT-PCR[J].Meth Mol Biol,2014,1161:277-293.

[13] 劉好朋,胡京京,唐 續(xù),等.H1亞型豬流感病毒一步法實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī),2014(11):63-68.

[14] 陳勝鋒,徐振娜,王丙云,等.SIV、PCV-2、PRRSV 三重 PCR 檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2013,34(12)：42-45.

Development of a Duplex Real-time RT-PCR for the Differential Detection of Nipha Virus and Swine Influenza Virus

WANG Jian-hua,ZHAO Xiang-ping,DONG Zhi-zhen,XIAO Yan,WANG Yu-ling,ZHANG Jun-zhe,CHEN Xiao-jin,WANG Nai-fu,CHEN Ben-long,ZHAO Dan

(AnimalandPlantandFoodInspectionCenterofTianjinEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Tianjin,300456，China)

By optimization of reacting conditions,a duplexTaqMan-MGB probe real-time RT-PCR was developed with specific primers and probes targeting the Nipha virus(NiV)M gene and swine influenza virus (SIV) M gene.The linear range，diagnostic sensitivity and specificity,inter- and intra-assay variation were evaluated for the assay.The performance of the assay was linear ranging from 4.6×101copies /μL to 4.6×108copies /μL for the RNA standard contol of NiV M (NiV-M-RNA) and from 5.8×101copies /μL to 5.8×108copies /μL for the RNA standard control of SIV M gene (SIV-M-RNA),and detection limits of the assay were 46copies for the NiV-M-RNA and 58copies for the SIV-M-RNA ,respectively,The coefficients of variation (CVs) of both inter-assay and intra-assay reproducibility were less than 1.6%,showing good reproducibility.The assay was capable of NiV and SIV-specific detection without cross-reaction with classical swine fever virus (CSFV),porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),pseudorabies virus(PRV),porcine parvovirus(PPV) and porcine circovirus type 2(PCV2).236samples from pigs tested for both NiV and PRRSV detection by the assay,all the samples were negative for NiV,1was SIV positive.In short,the development of this assay offers a useful approach for the differential detection of NiV and SIV in clinical specimens from the pigs.

Nipha virus; Swine influenza virus;TaqMan-MGB probe; duplex real-time RT-PCR

2015-07-31

天津市濱海新區(qū)科技計劃項目(2013-BK15H013);天津市科技支撐項目(13ZCZDNCO1300)

王建華(1965-)，男，黑龍江林口人，高級獸醫(yī)師，農(nóng)學(xué)博士，主要從事動物疫病檢測與診斷試劑研制。*通訊作者

S855.3

A

1007-5038(2016)01-0011-06