黃加濱，韋 瑩，洪紹鋒，林思遠，何榮祥，陳 櫻，黃偉堅，韋祖樟*

(1．廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物傳染病研究室，廣西南寧 530005；2.廣西陸川縣陸透水庫管理所，廣西陸川 537700)

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研究論文

廣西PRRSV分離株GXNN1396全基因序列分析

黃加濱1，韋 瑩1，洪紹鋒1，林思遠1，何榮祥2，陳 櫻1，黃偉堅1，韋祖樟1*

(1．廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物傳染病研究室，廣西南寧 530005；2.廣西陸川縣陸透水庫管理所，廣西陸川 537700)

前期我們實驗室分離鑒定了一株nsP2蛋白缺失49個氨基酸(aa)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GXNN1396株。為了進一步對該毒株全基因組序列特性進行分析，將GXNN1396株病毒在Marc-145細胞上傳至第3代，收集細胞上清，抽提該病毒RNA。用RT-PCR檢測方法對GXNN1396基因組進行分段擴增、克隆、序列比較和遺傳進化分析。結(jié)果表明，GXNN1396全長15263核苷酸(nt),不包括5′ 帽子結(jié)構(gòu)和3′Poly A 尾。其中，5′非翻譯區(qū)(5′UTR)長為189nt，3′UTR長151nt，ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7分別為7422、4382、771、765、537、603、525nt和372nt。與國內(nèi)外的PRRSV毒株核苷酸序列的同源性進行了比較顯示，GXNN1396與歐洲經(jīng)典毒株LV和VR2332株的同源性分別為61%和88.8%，與TJ、JXwn06、JXA1在全基因上的同源性高達97.2%～97.3%，說明GXNN1396株是一株典型的美洲型PRRSV毒株。遺傳進化分析表明美洲型PRRSV主要分為3個亞群，GXNN1396與高致病性PRRSV毒株屬于同一分支。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；全基因序列分析；同源性分析；遺傳進化分析

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的仔豬呼吸困難、體重下降、生長緩慢及母豬繁殖障礙為特征的一種接觸性傳染病，俗稱“豬藍耳病”。該病于1987年在北美首次暴發(fā)，現(xiàn)在已呈世界性分布。PRRSV為有囊膜、不分節(jié)段、單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約有15kb,5′非翻譯區(qū)(untranslated region,5′UTR)長約為190核苷酸(nucleotide,nt)，3′UTR長約151nt。病毒編碼區(qū)至少有9個開放閱讀框(open reading frame,ORF)。左端(上游)占基因組總長3/4的開放閱讀框1(open reading frame 1,ORF1)編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)等13個推測的非結(jié)構(gòu)蛋白(nsP)。PRRSV基因組3′端結(jié)構(gòu)蛋白基因區(qū)可編碼至少8個ORF，其中,ORF2a、ORF3、ORF4和ORF5分別編碼 GP2a、GP3、GP4和GP5等囊膜糖蛋白。ORF2b、ORF5a、ORF6和ORF7分別編碼病毒非糖基化囊膜E蛋白、ORF5a蛋白、膜基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N[1]。

在前期研究中，利用Marc-145細胞對從廣西南寧市某豬場采集的RT-PCR檢測PRRSV為陽性的肺臟組織進行病毒分離，分離到1株病毒，并命名為NN1396株[2]。同時，鑒定了GXNN1396為1株nsP2含有49aa缺失的PRRSV毒株；在與其他國內(nèi)外的高致病性豬藍耳病毒株在nsP2區(qū)除了1+29aa缺失外，上游還缺失了19個氨基酸(57nt)。由于RNA病毒易于發(fā)生抗原突變,近年來在世界各地出現(xiàn)了致病力增強的PRRSV變異株,表現(xiàn)為PRRSV感染懷孕母豬更加嚴重的流產(chǎn)和仔豬高病死率[3]。GXNN1396株在廣西養(yǎng)豬業(yè)如此密集的區(qū)域是否為優(yōu)勢流行毒株的研究有重要意義，因此本研究對GXNN1396毒株的全基因組、核苷酸同源性和遺傳進化了比較和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞和菌株 PRRSV毒株GNNN1396為廣西大學(xué)傳染病實驗室分離、鑒定和保存;Marc-l45細胞、大腸埃希菌DH5α由本實驗室保存;pMD18-T 載體為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 新生胎牛血清、MEM為GIBCO公司產(chǎn)品；Taq Mix、dNTP 、Mixture、RNase Inhibitor、M-MLV、LA Taq酶等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA 凝膠回收試劑盒為Axyden Scientific，Inc產(chǎn)品。

1.1.3 引物設(shè)計 本研究使用的引物參考已發(fā)表文獻引物[4]，其中PF1/PR1203、PF1154/PR2379、PF2108/PR4238、PF4070/PR5373、PF5349/PR6663、PF6574/PR7976、PF7894/PR9232、PF9122/PR10481、PF10378/PR11569、PF11322/PR12186、PF11759/PR13401、PF13138/PR14371、PF14231/PR15300作為引物進行PCR擴增。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組的提取和RT-PCR擴增與克隆 第3代的病毒感染細胞后的上清液，并抽提病毒基因組RNA，以病毒RNA作為模板，用隨機引物，分段進行反轉(zhuǎn)錄，合成與RNA模板互補的cDNA鏈。cDNA(2μL)用H2O(14.2μL)、buffer(2.5μL)、dNTP(4μL)，在LATaq酶(0.3μL)的作用下，以各段P1/P2(1/1μL)為引物，配成25μL體系進行PCR反應(yīng)，同時設(shè)陰性對照。PCR擴增條件：94℃ 1min；95℃ 0.5min，55℃ 0.5min，72℃ 1.5min，30個循環(huán)；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物進行電泳，對所獲得正確的PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T 載體4℃連接過夜、轉(zhuǎn)化。孵育完成后，涂板到LA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h。挑取5個～7個單個菌落LB培養(yǎng)試管中，37℃搖床中培養(yǎng)12h～16h。最后用菌液PCR鑒定，條帶正確的菌液抽取1mL送上海杰李生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 生物信息分析 對測序結(jié)果用基因序列應(yīng)用生物軟件Lasergene進行序列的拼接和比較，用MEGA4.1對病毒進行遺傳進化分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒全基因組的克隆和序列分析

將GXNN1396感染Marc-145細胞，72h后收集上清，提取上清病毒RNA。使用引物(本文1.1.3引物設(shè)計)進行RT-PCR對GXNN1396的基因組進行分段擴增，電泳鑒定PCR產(chǎn)物條帶大小(數(shù)據(jù)未顯示)。接著，將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體中，提取陽性克隆進行測序。用Lasergene軟件包中的Seq Man對擴增的片段進行拼接，獲得病毒的全長序列。

2.2 病毒基因組結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)表1在分離地區(qū)、年份和GenBank登陸號所獲得9株P(guān)RRSV毒株核苷酸序列(1株經(jīng)典型美洲株VR2332和8株國內(nèi)的分離毒株CH-1a、BJ-4、HB-2(sh)2002、HN1、TJ、JXwn06、S1、JXA1)。如表2所示，對獲得PRRSV分離株GXNN1396全長序列進行分析發(fā)現(xiàn)，GXNN1396全基因株序列全長為15263bp，比其他參考毒株的序列都短，說明該毒株的基因組存在核苷酸的缺失。在各參考PRRSV中，ORF1a的長度的變化是最大的，其中經(jīng)典毒株VR2332、S1和CH-1a ORF1a為7512nt，BJ-4的ORF1a為7509nt，比VR2332少3nt。HB-2比VR2332少36nt。高致病性PRRSV毒株JXA1、JXwn06等在ORF1a比經(jīng)典毒VR2332株少90nt，這是由于高致病性PRRSV的nsP2高變區(qū)不連續(xù)缺失了1+29aa所致，成為高致病性PRRSV獨特的遺傳標志。而本分離株的ORF1a為7365nt，說明了該毒株除了高致病性PRRSV 特征性的90nt缺失外，還有別的位點缺失。對各個毒株的nsP2蛋白進行比較，如圖1所示，各個毒株ORF1a長度不一，主要體現(xiàn)在nsP2高變區(qū)存在不同程度的氨基酸缺失，與標準株VR2332相比，所有的高致病性PRRSV毒株如TJ、JXwn06和JXA1缺失了29+1aa。而HB-2(sh)2002毒株，也缺失了12aa。GXNN1396除了缺失在1+29aa外，在其上游，還缺失19aa。然而，GXNN1396株在ORF1b 和ORF 2～7的長度與其他毒株一致，分別為4383、771、765、537、603、525、372nt。

表1 本研究分析所用的PRRSV毒株Table 1 The strains of PRRSV used for analysis in this study

表2 GXNN-1396株與9株P(guān)RRSV毒株全基因組的長度比較Table 2 The full-length genome comparision between GXNN-1396stain and 9PRRSV strains bp

圖1 GXNN-1396株與9株P(guān)RRSV毒株在nsP2高變區(qū)氨基酸序列比較：與VR2332氨基酸不同的氨基酸涂黑，缺失的氨基酸用“-”表示
Fig.1 Comparision of amino acid sequences of highly variable nsP2region between GXNN-1396and 9PRRSV strains:aa that differ with VR2332are shaded with black,aa deletion indicates as "-"

2.3 PRRSV-GXNN1396株和其他9株的全基因比較分析

對GXNN1396株全基因與國內(nèi)外發(fā)表的部分毒株(JXA1、JXwn06、TJ、CH-1a、HB-2(sh)2002、HN1、S1、BJ-4、VR2332)序列進行比較，如表3所示，GXNN1396全基因組序列的相似性與JXwn06、TJ和JXA1等最高，為97.3%，與國內(nèi)經(jīng)典毒株BJ-4、S1和HN1毒株相似性為88.4%，與美洲型經(jīng)典株VR2332相似性為88.8%。對非編碼區(qū)和各個ORF進行比對發(fā)現(xiàn)，GXNN1396株在5′端UTR和3′端UTR的基因序列中，與高致病性PRRSV毒株JXwn06、JXA1相似性最高，為97.4%，與經(jīng)典毒株VR2332和BJ-4只有91.5%，GXNN1396株與各株P(guān)RRSV之間在3′端UTR的相似性也有91.1%～97.3%。nsP2是PRRSV基因組中變異最大的基因，GXNN1396株與這些毒株最低相似性也有82%，ORF3、ORF4和ORF5的變異也較大，與HN1的相似性分別為88.8%、88.8%和87.1%；而ORF6和ORF7的保守性相對較高，分別高達93.9%和93.8%。

2.4 GXNN1396毒株全基因進化樹分析

將GXNN1396株序列與9株參考毒株構(gòu)建遺傳進化樹，如圖2所示，PRRSV主要分成兩大分支，以美洲型經(jīng)典株VR2332為2型的PRRSV毒株和歐洲型經(jīng)典株LV為代表1型的PRRSV毒株。而在2型PRRSV毒株中，可分為3個亞群，以VR2332、S1和HN1等經(jīng)典株分為一群。而GXNN1396株則與高致病性PRRSV毒株JXA1、JXwn06和TJ分在同一亞群。經(jīng)典株和高致病性亞群之間一個群則是Ch-1a和HB-2為代表。

表3 GXNN1396株與其他9個毒株部分核苷酸同源性比較Table 3 Comparison of nucleotide identity between GXNN1396and other 9PRRSV strains %

圖2 GXNN1396株在部分PRRSV流行毒株的全基因遺傳進化樹
Fig.2 The phylogenetic tree of GXNN1396full-length genome in partial epidemic PRRSV strains

3 討論

本研究中對PRRSV-GXNN1396全基因組進行擴增、同源性比較和進化樹的分析，確定了GXNN1396毒株的核苷酸的長度、基因組結(jié)構(gòu)特性和毒株進化情況。

本研究對GXNN1396毒株通過RT-PCR的方法進行全長序列分段擴增，通過克隆后進行測序，最后拼接得到病毒的全長序列。在與國內(nèi)外高致病性PRRSV全基因序列比較中，與TJ、JXwn06、JXA1等核苷酸的同源性高達97.2%～97.3%。PRRSV有2個基因型，即VR2332株為代表的美洲型2型和以Lelystad virus(LV)株為代表歐洲1型，但這兩者的基因序列的同源性僅為60%左右[7]，而GXNN1396與歐洲經(jīng)典毒株LV和VR2332株的核苷酸同源性分別為61%和88.8%。通過序列比對和遺傳進化分析，確定了所分離的毒株是2型PRRSV毒株，并且與高致病性PRRSV毒株(JXA1、JXwn06和TJ)處于同一分支。目前為止，我國分離鑒定的毒株也多為2型的PRRSV毒株。有研究表明，以JXA1株為代表的美洲型HP-PRRSV株已成為我國PRRSV流行優(yōu)勢毒株[8-9]。顯然，廣西分離的毒株也是以高致病PRRSV 毒株為主，該毒株的致病性如何，還需進一步研究。我國自2006年以來，在nsP2有1+29aa的缺失已經(jīng)證實是HP-PRRSV毒株的分子特性[10-11]，但接著的研究表明，1+29aa的缺失與病毒毒力強弱沒有關(guān)系[12],值得注意的是，國內(nèi)著名藍耳病專家楊漢春教授在尋找我國HP-PRRSV毒力決定區(qū)發(fā)現(xiàn)ORF1b在豬藍耳病強毒與弱毒間替換，發(fā)現(xiàn)毒力發(fā)生反向變化[6]。盡管我們之前的研究確定了nsP2高變區(qū)存在著1+29aa的缺失，與其他高致病性PRRSV(如TJ、JXwn06、JXA1)缺失的部位一樣，但不同是在上游還有19aa缺失。本研究對GXNN1396株的nsP2序列測通并比對發(fā)現(xiàn)，除了高變區(qū)缺失了49aa外，nsP2沒有別的位點缺失。該毒株在nsP2中1+29aa的缺失有著何種病毒生物學(xué)特性還需進一步研究。對各個基因組序列比對結(jié)果顯示，序列差異較大的基因有ORF1a、ORF3、ORF4和ORF5，而相對保守的基因為ORF6和ORF7,這與其他的研究結(jié)果相一致。值得注意的是，在本研究部分PRRSV流行毒株的全基因遺傳進化樹的分析中，GXNN1396株屬于美洲型PRRSV中的一個亞型，雖然在與美洲型經(jīng)典株VR2332不同屬于一進化亞型。但在與當(dāng)前我國流行優(yōu)勢毒株中，如JXA1、TJ、JXwn06等在同一個亞型進化分支中，這對研究GXNN1396株進化過程中是否存在由其他毒株基因的重組和變異，進而形成毒株來源提供了研究依據(jù)，也為日后候選為理想疫苗株奠定基礎(chǔ)。

總之，在本研究中，我們實驗室分離到的PRRSV毒株GXNN1396進行了全基因序列分析、同源性比較和遺傳進化分析，確定了該毒株的來源與遺傳變異情況，同時也豐富了PRRSV分離株的全基因組序列數(shù)據(jù)庫，這對日后該病的流行病學(xué)調(diào)查提供了必要的數(shù)據(jù)，同時對研究PRRSV的致病力和遺傳變異情況提供了理論依據(jù)。

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Full-length Genome Sequence Analysis of PRRSV Isolate GXNN1396in Guangxi

HUANG Jia-bin1,WEI Ying1,HONG Shao-feng1,LIN Si-yuan1,HE Rong-xiang,2CHEN Ying1,HUANG Wei-jian1,WEI Zu-zhang1

(1.AnimalInfectiousDiseaseLaboratory,CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530005,China; 2.AdministrativeOfficeofLuchuanResevior,Luchuan,Guangxi,537700,China)

Previously,we isolated and identified a novel PRRSV strain (GXNN1396) with 49amino acids deletion in nsP2.In this study,to further characterize the full length genome of GXNN1396,Marc-145cells were inoculated with GXNN1396.The supernatant of infected cells was collected and used for virus RNA extraction.A set of primers were designed for RT-PCR to amplify the full-length genome of GXNN1396.The nucleotide sequence of GXNN1396was compared with the reference PRRSV strains retrieved from GenBank.The phylogenic tree of GXNN1396and the reference strains was constructed based on the full-length genome.The results showed that the complete genome of GXNN1396consists 15263nt,excluding the 5′cap and 3′poly A tail.The 5′UTR has 189nt and 3′UTR has 151nt.ORF1a,ORF1b,ORF2,ORF3,ORF4,ORF5,ORF6and ORF7contain 7422,4382,771,765,537,603,525and 372nucleotides,respectively.The complete genome of GXNN1396shares 88.8% identity with VR2332,and shares 97.2%-97.3% identity with highly pathogenic PRRSV strains TJ,JXwn06,JXA1,but only has 61% identity with type 1PRRSV stain LV,suggesting GXNN1396belongs to type 2PRRSV.The phylogenic analysis based on the full length genome revealed that PRRSV strains were classified into 3clades and GXNN1396was distributed with highly pathogenic PRRSV strains TJ,JXwn06,JXA1.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; full-length sequence analysis；homology analysis; phylogenetic analysis

2015-07-11

國家自然科學(xué)基金項目(31372444);廣西大學(xué)科研基金項目(XGZ130959)

黃加濱(1989-)，男，浙江溫州人，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2016)01-0001-06