鄭春松，嚴培晶，付長龍，葉蕻芝，劉獻祥

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；

2.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學院，福建福州350002；

3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

·理論探討·

從網(wǎng)絡藥理學角度探討骨關(guān)節(jié)炎方證對應研究的思路與方法

鄭春松1，嚴培晶2，付長龍3，葉蕻芝1，劉獻祥1

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；

2.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學院，福建福州350002；

3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

目的建立骨關(guān)節(jié)炎（OA）方證對應的網(wǎng)絡藥理學研究策略。方法通過基因芯片、代謝組學等得到臨床骨關(guān)節(jié)炎氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證、氣血虛弱證患者與無上述證候、無慢性骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)外傷患者比較的差異基因和代謝物，構(gòu)建和分析證候分型的分子網(wǎng)絡；查閱膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識（2015年版），運用計算模擬與數(shù)據(jù)建模平臺，構(gòu)建和分析證候分型代表方與骨關(guān)節(jié)炎靶基因、靶蛋白、生物通路的作用網(wǎng)絡，找到其關(guān)鍵化合物和靶標，并進行實驗驗證。結(jié)果形成了OA證候分型的分子網(wǎng)絡研究思路，詮釋證候分型的實質(zhì)；形成了證候分型代表方的分子網(wǎng)絡研究思路，詮釋各代表方在治療骨關(guān)節(jié)炎的藥理途徑異同點；建立了網(wǎng)絡中關(guān)鍵化合物和靶標的驗證方法，詮釋各代表方對相應證候分型治療中的優(yōu)勢。結(jié)論骨關(guān)節(jié)炎方證對應的網(wǎng)絡藥理學新方法，將為骨關(guān)節(jié)炎的個體化診療提供幫助。

骨關(guān)節(jié)炎；方證對應；網(wǎng)絡藥理學；中醫(yī)藥療法；個體化診療

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為主要特征的慢性常見病，是中醫(yī)骨傷科治療的優(yōu)勢病種［1-2］。2015年中國中醫(yī)藥研究促進會骨傷專業(yè)委員會以及中國中西醫(yī)結(jié)合學會骨傷科專業(yè)委員會關(guān)節(jié)工作委員會形成了膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識，認為OA分為氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證和氣血虛弱證，分別可以用血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯等加減治療［2］。然而，這種中醫(yī)臨床的辨證用藥及各種治療方法，以經(jīng)驗為基礎，缺乏現(xiàn)代的語言，難以被人們普遍理解和接受，阻礙中醫(yī)藥成為OA主流療法的可能［3］。網(wǎng)絡藥理學是借助“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡平臺，從系統(tǒng)的角度探索藥物對疾病網(wǎng)絡的干預與影響，具有整體性和系統(tǒng)性特點，為中醫(yī)藥復雜體系的現(xiàn)代醫(yī)學詮釋提供新途徑［4-5］。因此，在膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識基礎上，本文首次提出了從網(wǎng)絡藥理學角度開展OA方證對應研究的的思路與方法。

1 理論基礎

方證對應，源于東漢醫(yī)家張仲景的《傷寒論》，是探討方藥與病證之間一一對應關(guān)系的學說，是作為中醫(yī)辨證論治中的一個重要概念［6-7］。分析不同證下的網(wǎng)絡藥理學特征有助于深入研究中醫(yī)藥［8］，闡明方藥的藥效物質(zhì)基礎及機制，篩選出方藥的最佳適應人群，為開展OA的精準醫(yī)療提供幫助。

OA屬于中醫(yī)的“痹癥”范疇［1，9］，《素問·逆論調(diào)篇》曰：“骨痹，是人當攣節(jié)也。”《中藏經(jīng)》曰：“骨痹者，乃食欲不節(jié)，傷于腎也。腎氣內(nèi)消，則不能關(guān)禁……?！薄端貑枴らL刺節(jié)論篇》曰：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹?！薄端貑枴っ}要精微論》曰：“膝者，筋之府，屈伸不能，行則僂俯，筋將憊矣?！薄端貑枴ち?jié)臟象論》曰：“肝者，其充在筋?！薄端貑枴け哉摗吩唬骸帮L寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風氣勝者為行痹；寒氣勝者為著痹也?！栽谟诠莿t重，在于脈則血凝而不流，在于筋則屈不伸，在于肉則不仁，在于皮則寒。”《諸病源候論·風病諸候》曰：“亦有血氣虛，受風邪而得之者”?！毒霸廊珪吩唬骸帮L痹之證，大抵因虛者多，惟氣血不充，故風寒得以入之，惟陰邪留滯，故經(jīng)脈為之不利。”又曰：“蓋痹者閉也，以血氣為邪所閉，不得通行而病也?！薄缎l(wèi)生寶鑒》曰：“老年腰膝久痛，牽引少腹兩足，不堪步履，奇經(jīng)之脈，隸于肝腎為多?！币虼?，OA多為“本虛標實”“本痿標痹”之證，臨床上將其分為氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證和氣血虛弱證，應采取不同的方藥進行治療。

網(wǎng)絡藥理學是由2007年由University of Dundee的Hopkins AL首次提出［10］，是一種基于網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫、計算模擬和各組學技術(shù)等平臺的新藥發(fā)現(xiàn)、藥效物質(zhì)基礎及作用機制研究方法，系統(tǒng)地揭示了藥物對疾病的干預與影響，具有整體性與動態(tài)性的特點，與中醫(yī)理論的系統(tǒng)觀和整體論思想不謀而合［11］。中藥復方是中醫(yī)預防和治療疾病的主要形式，其物質(zhì)基礎為四氣五味。一般來說，一種藥物只有一種藥性，但可以有一種或多種氣味。氣味相近，則功效相近。氣味相異，則功效不同。功效不同，則作用機體的靶標也不同，即中藥復方具有多靶點的作用特征［12］。而且，證候是有許多因素組成的復雜系統(tǒng)，難以用單一的生物學指標來表達，其與生物網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)機制具有關(guān)聯(lián)性［13-14］。因此，借助網(wǎng)絡藥理學，可以從分子層面觀察方與證的內(nèi)在整體性對應情況，有助于證候客觀化和個體化診療。

2 實驗設計

2.1 選擇與證對應的方藥

2.1.1 OA氣滯血瘀證與血府逐瘀湯OA氣滯血瘀證病人的典型臨床表現(xiàn)：①關(guān)節(jié)疼痛如刺，休息后痛反甚；②面色黧黑；③舌質(zhì)紫暗，或有瘀斑，脈沉澀。治法是活血化瘀、通絡止痛，方劑用清代醫(yī)家王清任著作《醫(yī)林改錯》中的血府逐瘀湯［2］。

2.1.2 OA寒濕痹阻證與蠲痹湯OA寒濕痹阻證病人的典型臨床表現(xiàn)：①關(guān)節(jié)疼痛重著，遇冷加劇，得溫則減；②腰身重痛；③舌質(zhì)淡，苔白膩，脈沉。治法是溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈，方劑用清代醫(yī)家程鐘齡著作《醫(yī)學心悟》中的蠲痹湯［2］。

2.1.3 OA肝腎虧虛證與左歸丸OA肝腎虧虛證病人的典型臨床表現(xiàn)：①關(guān)節(jié)隱隱作痛；②腰膝酸軟無力，酸困疼痛，遇勞更甚；③舌質(zhì)紅，少苔，脈沉細無力。治法是滋補肝腎，方劑用明代醫(yī)家張景岳著作《景岳全書》中的左歸丸［2］。

2.1.4 OA氣血虛弱證與八珍湯OA氣血虛弱證病人的典型臨床表現(xiàn)：①關(guān)節(jié)酸痛不適；②少寐多夢，自汗盜汗，頭暈目眩，心悸氣短，面上少華；③舌淡，苔薄白，脈細弱。治法是補氣養(yǎng)血，方劑用元朝醫(yī)家朱震亨著作《丹溪心法》中的八珍湯［2］。

2.2 證候分型的OA疾病網(wǎng)絡構(gòu)建與分析OA組的血樣、關(guān)節(jié)液、軟骨組織、滑膜組織分別取自行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證和氣血虛弱證OA病人，正常組的血樣、關(guān)節(jié)液、軟骨組織、滑膜組織取自無慢性關(guān)節(jié)炎、無上述證候分型健康人群中僅因關(guān)節(jié)外傷引起的病人［15-16］。通過基因芯片技術(shù)、蛋白組學和代謝組學技術(shù)等，與正常組比較，得到OA組病人中軟骨組織中軟骨細胞、滑膜組織中滑膜細胞的差異基因和蛋白，以及關(guān)節(jié)液、血樣中差異代謝物，綜合Biological General Repository for Interaction Datasets（BioGRID，http：// www.thebiogrid.org）、Database of Interacting Proteins（DIP，http：//dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/Main.cgi）和STRING 10.0（http：//string-db.org/）等數(shù)據(jù)庫信息及來自文本挖掘的數(shù)據(jù)［17-18］，在Cytoscape 2.8.3軟件平臺上［19］，直觀顯示OA組證候分型相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。通過ClueGO、KEGG和REACTOME分析［18，20］，預測其對應的作用通路，建立蛋白質(zhì)-通路網(wǎng)絡。利用Cytoscape 2.8.3軟件中Plugins面板下的Network analysis，比較OA證候分型的差異性。

2.3 OA“方-證”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡構(gòu)建與分析以血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯為研究對象，利用“PubChem”“中藥原植物化學成分手冊”“中國知網(wǎng)”等檢索上述方藥的各組成中藥成分，通過Discovery Studio計算模擬與數(shù)據(jù)建模平臺［21］，構(gòu)建上述方藥的分子數(shù)據(jù)庫。以2.2項下的蛋白為靶標，若其有晶體結(jié)構(gòu)，從pdb數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/），采用分子對接技術(shù)［21］，研究方藥分子數(shù)據(jù)庫中化合物與靶標的作用；若其無晶體結(jié)構(gòu)，采用藥效團搜索或機器學習方法［22-23］，辨識出作用于靶標的化合物。將化合物、靶標和通路視為節(jié)點，相互作用視為邊，在Cytoscape 2.8.3軟件平臺上［19］，構(gòu)建證候分型對應方藥的化合物-靶標-通路作用網(wǎng)絡。利用Cytoscape 2.8.3軟件中的Network analysis，分析不同方藥對OA證候分型病人所起到的作用，找到不同方藥作用的關(guān)鍵靶標和化合物。

2.4 實驗驗證

2.4.1 關(guān)鍵靶標的驗證

2.4.1.1 體內(nèi)實驗以改良Hulth造模法復制大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎為模型［24］，設立血府逐瘀湯組、蠲痹湯組、左歸丸組、八珍湯組和和生理鹽水組，按照藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算［25］，分別給予相應的藥物干預4周后，用戊巴比妥鈉麻醉下腹主動脈采血［26］，并取膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)液、軟骨組織和滑膜組織［27-28］，借助免疫組化、Elisa和Western blot方法，分析各方藥治療后對應關(guān)鍵靶標蛋白表達的變化，證實其作用的關(guān)鍵靶標。

2.4.1.2 體外實驗利用2月齡的雄性大鼠，制備大鼠血府逐瘀湯組、蠲痹湯組、左歸丸組、八珍湯組和生理鹽水組的含藥血清。以白細胞介素1β誘導大鼠軟骨細胞建立體外模型，實驗分為血府逐瘀湯組、蠲痹湯組、左歸丸組、八珍湯組和和生理鹽水組，分別給予含10%血府逐瘀湯血清、蠲痹湯血清、左歸丸血清、八珍湯血清、生理鹽水組血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，收集其培養(yǎng)液和軟骨細胞［29］。借助免疫組化、Elisa和Western blot方法，分析各方藥含藥血清干預退變軟骨細胞后對應關(guān)鍵靶標蛋白表達的變化，證實其作用的關(guān)鍵靶標。

2.4.2 關(guān)鍵化合物的驗證在關(guān)鍵靶標驗證的基礎上，采取固定化藥物靶標方法和分子烙印方法［31-32］，辨識方藥的有效成分，驗證預測的關(guān)鍵活性化合物。固定化藥物靶標方法，即將已經(jīng)驗證的靶標固定在球狀載體上，制備親和色譜，利用靶標對血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯中化合物親和力的差異，運用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過質(zhì)譜的選擇離子流圖來分析數(shù)據(jù)，根據(jù)化合物在親和色譜柱保留時間的長短，確定化合物對靶標的結(jié)合能力，從方藥中篩選和鑒定出活性成分。若難以得到藥物靶標，我們可以通過這個靶標的已知活性配體制備這個靶標的模擬物進行篩選，即分子烙印方法。首先，選擇一個活性分子作為模板分子，然后，選擇合適的功能高分子與之聚合，最后從聚合物中除去模板分子即得到靶標的模擬物，用聚合物作為液相色譜的固定相直接用于方藥血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯活性成分的篩選。

3 結(jié)語

不同方劑對機體疾病狀態(tài)的改善作用會因證候分型不同而具有差異性，通過網(wǎng)絡藥理學，可以更好揭示疾病與證候、證候與方劑之間的關(guān)系。本文提出了OA方證對應研究新思路，即以OA的常見證候分型氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證、氣血虛弱證為切入點，以各分型對應的代表方血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯為示范藥物，采用網(wǎng)絡藥理學方法，觀察OA各證候分型的差異蛋白，以及對應方藥作用的靶標。結(jié)合實驗驗證，從微觀角度將方藥和證候有機地對應起來，揭示不同方藥對OA各證候分型網(wǎng)絡的作用情況及方藥中組分間的相互作用規(guī)律，從而闡釋OA方證對應模式的科學內(nèi)涵，使得OA的證候分型研究更具可操作性，促進OA中醫(yī)精準治療的發(fā)展，對中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究方法體系和中藥新藥的研發(fā)都具有重要的實際意義。

［1］劉獻祥.基于陳可冀學術(shù)思想之骨性關(guān)節(jié)炎研究［J］.康復學報，2016，26（1）：2-5.

［2］中國中醫(yī)藥研究促進會骨科專業(yè)委員會，中國中西醫(yī)結(jié)合學會骨傷科專業(yè)委員會關(guān)節(jié)工作委員會.膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識（2015年版）［S］.中醫(yī)正骨，2015，27（7）：4-5.

［3］陳衛(wèi)衡.探索建立系統(tǒng)的膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)臨床科研范式和理論體系［J］.中醫(yī)正骨，2015，27（7）：1-3.

［4］劉志華，孫曉波.網(wǎng)絡藥理學：中醫(yī)藥現(xiàn)代化的新機遇［J］.藥學學報，2012，47（6）：696-702.

［5］ZHENG C S，XU X J，YE H Z，et al.Network pharmacologybased prediction of the multi-target capabilities of the compounds in Taohong Siwu decoction，and their application in osteoarthritis［J］.Exp Ther Med，2013，6（1）：125-132.

［6］張仲景.傷寒論［M］.6卷.貴陽：貴州教育出版社，2010：163.

［7］王階，熊興江，何慶勇，等.方證對應內(nèi)涵及原則探討［J］.中醫(yī)雜志，2009，50（3）：197-199.

［8］何小娟，李健，陳杲，等.基于病證結(jié)合的中藥網(wǎng)絡藥理學研究與新藥研發(fā)策略［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2011，17（11）：1271-1273.

［9］鞏鳳梅，谷文龍，劉英才，等.近3年來針灸治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎概況［J］.湖南中醫(yī)雜志，2015，31（12）：209-211.

［10］HOPKINS A L.Network pharmacology［J］.Nat Biotechnol，2007，25（10）：1110-1111.

［11］WANG J，LI X J.Drug targets discovery based on dynamic signal transduction networks［J］.Yao Xue Xue Bao，2010，45（1）：1-8.

［12］劉麗寧.傳統(tǒng)中藥臨床用藥優(yōu)勢之一多靶點探討［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，21（3）：745-746.

［13］LIU A L，DU G H.Network pharmacology：new guidelines for drug discovery［J］.Yao Xue Xue Bao，2010，45（12）：1472-1477.

［14］李梢.中醫(yī)證候生物分子網(wǎng)絡標志的構(gòu)想與研究［J］.中醫(yī)雜志，2009，50（9）：773-776.

［15］朱錦宇，史曼，張偉，等.基因芯片法篩選膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜相關(guān)差異表達基因［J］.國際骨科學雜志，2010，31（6）：384-386.

［16］唐欣，呂猛，王洪，等.老年骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織的基因芯片分析［J］.中華關(guān)節(jié)外科雜志（電子版），2010，4（4）：511-515.

［17］李健，郭洪濤，牛旭艷，等.治療類風濕關(guān)節(jié)炎中藥方劑作用原理的網(wǎng)絡藥理學研究策略［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（6）：267-270.

［18］NAIR J，GHATGE M，KAKKAR V V，et al.Network analysis of inflammatory genes and their transcriptional regulators in coronary artery disease［J］.PLoS One，2014，9（4）：e94328.

［19］SMOOT M E，ONO K，RUSCHEINSKI J，et al.Cytoscape 2.8：new features for data integration and network visualization［J］. Bioinformatics，2011，27（3）：431－432.

［20］滕文靜，周超，孫長崗，等.基于蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡探索慢性粒細胞白血病相關(guān)分子復合物生物學通路［J］.白血病.淋巴瘤，2015，24（8）：487-492.

［21］鄭春松，林潔，付長龍，等.基于計算機模擬烏頭湯治療疼痛的藥效物質(zhì)基礎與分子作用機制［J］.康復學報，2016，26（1）：33-37.

［22］邵鑫，衣倩穎，楊春蕾，等.基于藥效團模型及虛擬篩選方法發(fā)現(xiàn)EphB4全新抑制劑［J］.中國藥科大學學報，2006，47（1）：38-47.

［23］YU H，CHEN J，XU X，et al.A systematic prediction of multiple drug-target interactions from chemical，genomic，and pharmacological data［J］.PLoS One，2012，7（5）：e37608.

［24］劉獻祥，李西海，周江濤，等.改良Hulth造模法復制膝骨性關(guān)節(jié)炎的實驗研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（12）：1104-1107.

［25］黃繼漢，黃曉暉，陳志揚，等.藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算［J］.中國臨床藥理學與治療學，2004，9（9）：1069-1072.

［26］李太極，葉鵬，黃俊卿，等.通經(jīng)蠲痹膠囊對大鼠實驗性膝骨關(guān)節(jié)炎血清中IL-1β、MMP-3含量的影響［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12（6）：11-13.

［27］譚力銘，王宏強，仇成風，等.大蒜素對SD大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13、TIMP1和CollagenⅡ表達的影響［J］.中南藥學，2016，14（2）：128-130.

［28］周小莉，茍曉燕，李榮亨.復元膠囊對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨細胞凋亡及增殖的影響［J］.中國老年學雜志，2014，34（11）：6111-6114.

［29］鄭春松，葉蕻芝，李西海，等.獨活寄生湯含藥血清對白細胞介素1β誘導的退變關(guān)節(jié)軟骨細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶和環(huán)氧化酶2表達的影響［J］.中醫(yī)正骨，2015，27（12）：1-6.

［30］李希斌，葉娟，趙磊，等.黃管秦艽中總裂環(huán)烯醚萜苷對白細胞介素-1β誘導下大鼠軟骨細胞的影響［J］.中國藥學雜志，2014，49（13）：1121-1125.

［31］謝建春，朱麗荔，徐筱杰.分子烙印親和色譜與質(zhì)譜聯(lián)用實現(xiàn)中草藥活性成分分離鑒定一體化［J］.化學學報，2002，60（3）：385-388.

［32］李德強，肖媛媛，戴榮源，等.靶分子親和－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥活性成分篩選中的應用進展［J］.中國臨床藥理學雜志，2015，31（21）：2164-2169.

R275.9

：A

：1000-338X（2016）06-0049-03

2019-09-15

福建省自然科學基金項目（2015J01338）；福建省中青年教師教育科研項目（JA14152）

鄭春松（1982—），男，助理研究員，醫(yī)學博士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合骨傷科研究。

劉獻祥（1963—），男，教授，博士生導師。

E-mail：liuxianxiang@163.com