葉 南 劉 飛

(長江委水文局長江下游水環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210011)

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高效液相色譜概況及其在水質監(jiān)測中的應用

葉 南 劉 飛

(長江委水文局長江下游水環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210011)

介紹了高效液相色譜的方法，原理及其在水質監(jiān)測中的應用，通過甲萘威重復性測試、平行性測試以及質控樣測試，經(jīng)過精密度偏性驗證后得出高效液相色譜儀的精密度和準確度符合規(guī)范要求，可應用于水質監(jiān)測分析。

水質監(jiān)測；高效液相色譜儀；測試監(jiān)測分析

1 液相色譜基本原理及其特點

1.1 液相色譜理論的發(fā)展

色譜法最早是由俄國植物學家茨維特(Tswett)在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。

液相色譜法開始階段是在室溫和常壓下通過大直徑的玻璃管柱用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，該方法柱效低、時間長(常有幾個小時)、高效。

液相色譜法(LC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎上，于20世紀60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(HPLC)。同時，因分析速度快而被稱為高速液相色譜法(HSLP)，還稱現(xiàn)代液相色譜。

1.2 高效液相色譜基本原理

HPLC又稱高效液相色譜法，是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方法的高效能分離手段。20世紀70年代開始，廣泛應用于化工、食品、飲料，生物技術、醫(yī)藥、環(huán)境等領域。

HPLC的分離原理就是利用待分離的各種物質在兩相中的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來進行分離。HPLC主要由進樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成。HPLC技術的發(fā)展趨向于高速化、高效化、自動化、智能化等。HPLC分離度可用下式表示：

(1)

式中，tr2,tr1為保留時間；W2,W1為組分峰底寬。當R=0.75時，兩峰不能分離；當R=1.0時，達到一般定量分析要求，每峰純度達到96%；當R=1.5時，兩峰完全分離。

通過色譜學的基本理論——塔板理論可知，這些塔板實際是不存在的，只是一種假設，用來幫助描述色譜柱里所發(fā)生的一切。在這些塔板里面，固定相和流動相之間存在著一種平衡分析物。這種平衡里存在一種平衡系數(shù)K，定義K=C固定相/C流動相。K值越大，分析物流出時間就越長，即分析物在色譜柱中的保留時間就越長。

理論塔板數(shù)(N)用來衡量色譜柱質量好壞。理論塔板數(shù)越高，柱效越高；理論塔板高度(H)越大，柱效越低。高柱效色譜柱比低柱效色譜柱在同一保留時間峰更窄，理論塔板數(shù)越高，柱效越高。

有效塔板數(shù)可用下式表示：

(2)

有效板高可用下式表示：

(3)

不同物質在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質。

1.3 高效液相色譜的結構

高效液相色譜儀器的基本結構包括泵(含脫氣機)、自動進樣器、色譜柱(放于柱溫箱中)、檢測器、系統(tǒng)控制軟件(電腦)，如圖1所示。

圖1 高效液相色譜儀器的基本結構

1.4 技術指標及主要特點

高效液相色譜技術指標主要有：①檢測器參數(shù)(紫外檢測波長，靈敏度)；②固定相(色譜柱及內徑、長短)；③流動相(種類及配比，等度或梯度)；④流動相輸送系統(tǒng)參數(shù)(流速)；⑤溫度控制；⑥進樣量等。

高效液相色譜主要特點為，可對世界上80%左右的有機化合物進行分離和分析，特別適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物以及生物活性物質的分離和分析，且可做制備，不同的分析對象選擇不同的色譜柱，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學、化工和環(huán)保等領域。

2 檢測方法

HPLC檢測器可以分為溶質性質檢測器(選擇型)和整體性質檢測器(通用型)。選擇型是對溶質的物理或化學性質響應，一般不反映流動相的變化。通用型是不管是否有溶質，對流動相任何物理性質的變化均能作出響應。

HPLC檢測器選擇依據(jù)主要包括：①靈敏度(信號與噪音的比值，即峰高與基線噪音的比值(S/N)檢測線(LOD)∶S/N=3 定量限(LOQ)∶S/N=10，好的信噪比有利于更好的色譜峰確認，更好定量，更好地完成色譜峰純度/均一性)；②分離的化合物/樣品的化學特性(化學結構、分子量及紫外光譜等)；③流動相的影響(溶劑、緩沖鹽改性劑等)；④梯度還是等度；⑤靈敏度需求；⑥采樣頻率；⑦是否有雙檢測的需求。HPLC檢測器的原理及優(yōu)缺點見表1。

表1 HPLC檢測器的原理及優(yōu)缺點

3 在水質監(jiān)測中的應用

3.1 比測方案確定

選定濃度為100 μg/mL 甲萘威標準溶液配制標準曲線(分別取50，100，150，200，250，500 μl稀釋到1 000 μl；配制 0.0，5.0,10.0,15.0,20.0,25.0，50 μg/mL)；選取規(guī)格Thermo C184.6 mm×250 mm色譜柱；選擇甲醇：水=(3+2)為流動相；設定流動相流量為1.0 mL/min；檢測波長為280 nm；柱溫為35 ℃；選取重蒸餾水為空白試樣；以江西省九江市湖口水文站斷面的水作為天然水樣，并對天然水樣做雙加標處理，具體做法是分別加入100 μl和200 μL甲醇中甲萘威標準溶液,并用天然水稀釋到1 000 μl。

3.2 標準樣品檢驗

選用水利部水環(huán)境監(jiān)測評價研究中心GBW(E)082072的甲醇中甲萘威(西維因)，批號為20140129，其標準值為101 μg/mL，不確定度為±5%，依據(jù)《高壓液相色譜法-紫外檢測器》(GB/T5750.9—2006)標準分析方法，對該標準樣品稀釋了10倍進行了測試，12次測試結果的誤差均在不確定度±5%的范圍內。可見儀器的準確度很高，滿足相關要求，結果詳見表2。

表2 標準樣品檢驗測試結果

注：標準值為101，不確定度為5%。

3.3 重復性測試

使用上述標準樣品重復測試12次，測試甲萘威，絕對偏差范圍在-2.27 μg/mL～2.19 μg/mL之間；相對偏差圍在-2.25%～2.17%之間，平均偏差為-0.05，相對平均偏差為-0.04%；標準偏差為1.18，相對標準偏差為1.16%。由此可見，儀器的重復性很好，滿足相關要求，詳見表3。

3.4 平行性測試

仍然選取甲萘威，將湖口水樣品，等分成10份，對每份樣逐一測試，絕對偏差、相對偏差、相對平均偏差、標準偏差和相對標準偏差均為零，可見儀器的平行性很好，滿足相關要求。

4 質量控制

4.1 質量控制基礎實驗

4.1.1 標準曲線繪制及線性檢驗

標準系列應在線性范圍內選取至少6個濃度點進行測定，扣除空白值后，以響應值的數(shù)據(jù)為縱坐標，濃度值為橫坐標，繪制校準曲線，見圖2，并計算下列參數(shù)。

表3 重復性測試成果及其標準偏差

圖2 甲萘威的標準曲線

(1) 相關系數(shù)γ為 0.999 7，滿足γ≥0.999的規(guī)范要求。

(2) 列出回歸方程y=a+bx，對截距a進行t檢驗，要求截距與零無顯著性差異，否則找原因重做。檢測結果t=0.003<2.776，說明截距與零無顯著性差異。

4.1.2 準確度(回收試驗)

進行加標回收試驗，計算回收率P%，經(jīng)計算回收率的平均值為104.4%，滿足規(guī)范要求。標準曲線試驗數(shù)據(jù)，湖口斷面天然水樣雙加標樣品試驗數(shù)據(jù)以及質控樣品試驗數(shù)據(jù)見表4。

4.1.3 精密度偏性分析質量控制試驗

用標準水樣、天然水樣及加標天然水樣，以隨機次序每天一批，每次2份，高壓液相色譜法-紫外檢測器共6批[5]。計算批內變異MS批內、批間變異MS批間和批內、批間變異分析等參數(shù)，并將結果填入表5。

表4 加標回收試驗數(shù)據(jù)表

表5 精密度偏性檢驗

總標準差小于被測濃度的5%可以接受，當5%濃度低于方法給定的檢測限時，即用檢測限作為衡量標準。

通過加標回收試驗可得出以下結論，即加標回收率檢驗和分析批內批間變異，檢驗總標準差等2種檢驗均合格，滿足規(guī)范要求。

5 結 語

通過對高效液相色譜儀的學習、研究、比測和考核，可得出以下主要認識和結論：

(1) 高效液相色譜是一項非常成熟的現(xiàn)代化分析方法；

(2) 通過實驗證明，儀器滿足水質監(jiān)測分析所要求精密度和準確度；

(3) 方法檢出限適合長江水質分析的需求；

(4) 彌補和提高了實驗室對于有機化合物分析的不足。

綜上所述，該儀器及方法均滿足相關規(guī)范技術要求，可以投入生產(chǎn)應用。

[1] 張華，王英鋒，施燕支.高效液相色譜及聯(lián)用技術在砷形態(tài)分析中的應用[J].光譜學與光譜分析，2007,27(2)：386-390.

[2] 任晉，黃翠玲，趙國棟.固相萃取-高效液相色譜-質譜聯(lián)用機在線分析水中痕量除草劑[J]. 分析化學，2001,29(8)：876-880.

[3] 曹磊，趙潔麗.超高效液相色譜(UPLCTM)的優(yōu)點及其在環(huán)境監(jiān)測中的應用[J]. 環(huán)境科學與管理，2009,34(9)：124-127.

[4] 張麗娟，陳縣發(fā)，糜松元，等.UltiMate3000DGLC培訓教材[R].上海：賽默飛世爾公司，2012.

[5] 中國環(huán)境監(jiān)測總站，環(huán)境水質監(jiān)測質量保證手冊(第二版)[M].北京：化學工業(yè)出版社，2003.

(編輯：唐湘茜)

2016-09-15

葉南，男，長江委水文局長江下游水環(huán)境監(jiān)測中心，工程師.

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