朱 娉，馮 波，徐智斌，樊小莉，王 濤

(1.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都 610041； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

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小麥籽粒蛋白含量相關(guān)基因NAM新等位變異的挖掘

朱 娉1,2，馮 波1，徐智斌1，樊小莉1，王 濤1

(1.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都 610041； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

NAM基因是NAC基因家族的成員之一，該基因能加速植株葉片衰老，增加籽粒蛋白質(zhì)積累，并促進(jìn)鋅、鐵等微量元素吸收。為選育高蛋白和高微量元素含量的小麥品種，用NAM共顯性標(biāo)記Xuhw89對(duì)858份小麥材料進(jìn)行了篩選，并進(jìn)一步擴(kuò)增全長序列。結(jié)果表明，有3個(gè)栽培二粒小麥含有功能性NAM基因，其中，F(xiàn)37與F40來源的NAM基因分別與已公布的 TaNAC2基因和 TtNAM-A1基因(GenBank登錄號(hào)分別為HQ872050和DQ869672)相同；F34來源的NAM基因(命名為TdNAM，GenBank登錄號(hào)為KU529317)與已公布的 TtNAM-B2基因(GenBank登錄號(hào)為DQ869676)相似度最高，共有5處核苷酸差異，1處發(fā)生在內(nèi)含子，另外4處發(fā)生在外顯子區(qū)，導(dǎo)致了3個(gè)氨基酸殘基的變化，預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)這種差異不會(huì)對(duì)蛋白功能產(chǎn)生影響。因此，本研究篩選獲得的NAM基因新等位變異可為進(jìn)一步選育高蛋白、高微量元素含量的小麥品種提供材料和基因資源。

小麥；NAM基因；新等位變異；分子標(biāo)記；序列分析

谷物是人類攝取蛋白質(zhì)和微量元素的主要來源。世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示，超過20億的人口缺乏鋅、鐵等主要微量元素，超過1/3的世界人口處于蛋白質(zhì)缺乏的亞健康狀態(tài)[1-2]。小麥作為世界主要的糧食作物之一，提高其蛋白質(zhì)及鋅、鐵等微量元素含量對(duì)改善人類健康至關(guān)重要。

前人的研究表明，控制籽粒蛋白質(zhì)含量(Grain protein contents,GPC)的數(shù)量性狀位點(diǎn) Gpc-B1位于野生二粒小麥(Triticumturgidumvar.dicoccoides)6BS染色體上，該位點(diǎn)具有多效性，在開花期，增加可溶性蛋白和氨基酸在旗葉中的積累，提高氮同化效率，并最終影響籽粒大小與蛋白質(zhì)含量[3]。Uauy等[4]進(jìn)一步將 Gpc-B1位點(diǎn)上控制籽粒蛋白質(zhì)含量的關(guān)鍵基因圖位克隆，命名為 NAM-B1，并采用RNA干擾技術(shù)降低 NAM-B1基因表達(dá)水平，植株衰老時(shí)間延遲3周，籽粒中的蛋白質(zhì)、鋅、鐵元素含量下降30%。然而，六倍體小麥中 Gpc-B1位點(diǎn)上的 NAM-B1基因中1個(gè)堿基的插入導(dǎo)致移碼框突變，NAC結(jié)構(gòu)域丟失，蛋白無功能，籽粒蛋白及鋅、鐵微量元素含量明顯偏低[4]。因此，篩選具有功能性NAM基因的材料是小麥品質(zhì)改良的另一途徑。

NAM轉(zhuǎn)錄因子是NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。此類轉(zhuǎn)錄蛋白的N端為高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域(含A、B、C、D和E五個(gè)亞基)，含有蛋白質(zhì)和DNA結(jié)合位點(diǎn)；C端為轉(zhuǎn)錄激活域，具有高度多樣性[5-8]。Jamar等[9]發(fā)現(xiàn)不同大麥品種的 HvNAM-1多態(tài)性明顯，其編碼蛋白的C亞基中脯氨酸代替丙氨酸可能影響蛋白質(zhì)構(gòu)像或轉(zhuǎn)錄過程中的DNA結(jié)合能力[10]，結(jié)合籽粒蛋白含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，新等位變異的品種籽粒蛋白含量偏高。Wang等[11]在大麥中發(fā)現(xiàn)HvNAM- 1基因編碼區(qū)544位堿基的變異(脯氨酸→丙氨酸)，造成籽粒蛋白含量降低?？梢?，NAM基因的多態(tài)性會(huì)影響籽粒性狀。然而，目前小麥中還沒有報(bào)道影響籽粒蛋白質(zhì)含量的NAM等位變異。

Mesfin等[12]和Khan等[13]將野生二粒小麥 Gpc-B1基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入面包小麥中，獲得了Glupro穩(wěn)定高蛋白品種。隨后，Khan等[13]開發(fā)出限制性長度多態(tài)性標(biāo)記用于篩選 Gpc-B1位點(diǎn)，然而這些標(biāo)記的PCR產(chǎn)物需要酶切處理才能判斷基因型。Distelfeld等[14]開發(fā)的共顯性標(biāo)記Xuhw89為特異性標(biāo)記，可直接檢測(cè)到低蛋白含量的四倍體硬粒小麥LDN和高蛋白含量的野生二粒小麥DIC的 Gpc-B1位點(diǎn)中4 bp大小的差異，從而高效篩選出功能性NAM基因。因此，本研究利用標(biāo)記Xuhw89對(duì)858份小麥材料進(jìn)行篩選，以期檢測(cè)含有 Gpc-B1位點(diǎn)的籽粒高蛋白含量品種，并通過同源克隆獲得NAM基因，以期獲得新的等位變異，為進(jìn)一步培育高蛋白和高微量元素的小麥新品種提供種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用材料包括含 Gpc-B1基因的高蛋白小麥品種Glupro(陽性對(duì)照)、LDN(陰性對(duì)照)及供試的858份小麥材料(人工六倍體小麥345份、四倍體小麥100份、中國小麥微核心種質(zhì)222份及地方品種小麥191份)。Glupro由美國農(nóng)業(yè)部提供，人工六倍體材料由SIMMTY提供，四倍體由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所王道文課題組提供，微核心種質(zhì)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院賈繼增課題組提供，地方品種來自本實(shí)驗(yàn)室。

2×TaqPCR MasterMix和DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司(北京)；KOD-Plus-Neo高保真酶、10×Buffer、dNTPs和MgSO4均購自TaKaRa公司(大連)；pEASY-Blunt Cloning kit、Trans-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由成都擎科梓熙生物有限公司合成。

1.2 Xuhw89標(biāo)記的檢測(cè)

采用CTAB方法提取基因組DNA[19]。利用共顯性標(biāo)記Xuhw89[14](F:5′-TCTCCAAG AGGGGAGAGACA-3′; R:5′-TTCCTCTCCC ATGAATCTAGCA-3′)對(duì)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及供試的858份小麥材料DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(10 μL)：2×TaqPCR Master Mix 5 μL，上下游引物各0.1 μL，DNA模板(100 ng·μL-1)1 μL，加ddH2O至10 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯影，拍照分析。

1.3 NAM基因的同源克隆

以1.2中篩選到的與陽性對(duì)照Glupro擴(kuò)增到的片段大小一致的材料DNA為模板，采用用于擴(kuò)增山羊草NAM基因的引物P1/P2[5](P1：5′-AGATCTGATGAGGTCCATGGG-3′；P2：5′-ATGCCCGTATGTGGTGTTCATAT-3′)進(jìn)行NAM基因全長擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(20 μL)：10×Buffer 2 μL，2 mmol·L-1dNTPs 2 μL，25 mmol·L-1MgSO41 μL，上下游引物各0.2 μL，KOD-plus-Neo酶0.4 μL，100 ng·μL-1模板DNA 1 μL，加ddH2O至20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性40 s，55.3 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min 20 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的片段回收后克隆，每個(gè)樣品3次重復(fù)，最后交由北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.4 NAM基因的生物信息學(xué)分析

用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)分析；用BLASTn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索同源序列；用New GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析基因結(jié)構(gòu)及氨基酸組成；用NCBI的CD-search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/) 預(yù)測(cè)蛋白功能位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Xuhw89標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果

利用共顯性分子標(biāo)記Xuhw89對(duì)供試的858份小麥材料進(jìn)行篩選，結(jié)果(圖1)表明，有3個(gè)栽培二粒小麥材料F34、F37和F40的擴(kuò)增帶型與Glupro一致，獲得大小為122 bp的擴(kuò)增條帶，其余材料帶型與LDN一致，獲得大小為126 bp的擴(kuò)增條帶。

2.2 3個(gè)二粒小麥NAM基因的克隆及其核酸序列分析

利用引物P1/P2對(duì)3個(gè)栽培二粒小麥材料 F34、F37和F40的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小約1.5 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)。測(cè)序后分析發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)材料的NAM基因序列均含有一個(gè)完整的開放閱讀框。NCBI在線BLASTn表明，F(xiàn)37來源的NAM基因序列與已公布的 TaNAC2基因序列(GenBank登錄號(hào)為HQ872050)一致；F40來源的NAM基因序列與已公布的 TtNAM-A1基因序列(GenBank登錄號(hào)為DQ869672)一致；F34來源的NAM基因序列與已公布的 TtNAM-B2基因序列(GenBank登錄號(hào)為DQ869676)相似度最高。因此，推測(cè)F34來源的NAM基因序列為小麥NAM基因的一個(gè)新等位變異類型，將其暫命名TdNAM，同時(shí)將其提交至GenBank，得到序列登錄號(hào)為KU529317。

M:pUC18 DNA/MspⅠ Marker; G:Glupro; 1:F34; 2:F37; 3:F40; L:LDN; 4:F38; 5:F42; 6:S64; 7:S81; 8:h45.

圖1 標(biāo)記Xuhw89擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

Fig.1 Polyacrylamide gel of the amplified

products of molecular marker Xuhw89

進(jìn)一步對(duì)TdNAM基因核酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，TdNAM基因序列包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。與其相似度最高的 TtNAM-B2基因序列相比發(fā)現(xiàn)，TdNAM基因核酸序列共有5處核苷酸變異，其中，1處發(fā)生在第一個(gè)內(nèi)含子第311位(C→T)；另外4處發(fā)生在外顯子區(qū)，分別為第一個(gè)外顯子第181位(A→G)及第三個(gè)外顯子第897位(C→G)、第1 027位(G→A)和第1 322位(G→C)(圖3)。

M:DL5000 DNA Marker; G:Glupro; 1:F34; 2:F37; 3:F40.

圖3 TtNAM-B2基因與 TdNAM基因的結(jié)構(gòu)比對(duì)圖

A～E:NAM亞結(jié)構(gòu)域；△表示蛋白結(jié)合位點(diǎn)；*表示核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。

A-E:NAM sub-domains; △ indicates the protein-binding region; * indicates the polynucleotide-binding region.

圖4NAM基因編碼氨基酸序列的比對(duì)分析圖

Fig.4 Sequence analysis ofNAMtranscription factors

2.3 推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列分析

TaNAC2基因和 TtNAM-A1基因編碼405個(gè)氨基酸殘基，TdNAM基因編碼396個(gè)氨基酸殘基。通過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白序列的N端均有一個(gè)典型的NAC結(jié)構(gòu)域，A、B、C、D和E五個(gè)亞基高度保守；C端為轉(zhuǎn)錄激活域。野生二粒小麥中的NAM等位基因在功能區(qū)域均高度保守，以 TtNAM-B2(GenBank登錄號(hào)為ABI94355)作為參考序列，TdNAM有3處氨基酸殘基差異，包括位于B亞基的第61位(Thr→Ala)及位于TAR結(jié)構(gòu)域的第197位(Ala→Gly)和第339位(Gly→Arg)。通過PredictProtein軟件分析發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的TdNAM基因編碼的氨基酸殘基變異沒有發(fā)生在轉(zhuǎn)錄因子的核酸結(jié)合位點(diǎn)及蛋白結(jié)合位點(diǎn)，且通過SNAP2預(yù)測(cè)，該3個(gè)堿基差異不會(huì)對(duì)蛋白功能產(chǎn)生影響。

3 討 論

NAM轉(zhuǎn)錄因子作為NAC家族成員，能調(diào)控植物的生長及籽粒品質(zhì)性狀。野生型 NAM-B1在栽培條件下容易發(fā)生突變，因此培育品種中含有功能性的 NAM-B1基因較少[15]。Asplund等[20]在63份瑞典小麥中僅篩選到4份六倍體材料含有野生型 NAM-B1。Hagenblad等[15]利用SSR標(biāo)記從367份來自世界各地的面包小麥品種中僅篩選到5份小麥材料(4份春小麥和1份冬小麥)含有野生型 NAM-B1基因。Hu等[16]研究表明，能擴(kuò)增出Xuhw89特征條帶的小麥材料籽粒蛋白含量明顯高于其他品種。本研究通過共顯性標(biāo)記Xuhw89在858份小麥材料中篩選，得到3個(gè)栽培二粒小麥含有控制籽粒高蛋白含量的NAM基因，可作為籽粒高蛋白含量候選材料進(jìn)一步研究。

Ooka等[6]發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子的A、C和D亞基高度保守，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合核苷酸或蛋白質(zhì)相關(guān)； B、E亞基則與生長發(fā)育或組織特異表達(dá)相關(guān)。本研究獲得的3個(gè)NAM基因均含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，與山羊草中NAM基因結(jié)構(gòu)一致[5]。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)NAM轉(zhuǎn)錄因子N端均含有一個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域，保守性較高；C端為激活結(jié)構(gòu)域，多態(tài)性較明顯。TdNAM基因與已公布的 TtNAM-B2基因同源性最高，其編碼蛋白僅有3處氨基酸差異，B亞基中精氨酸代替蘇氨酸，其A、C和D亞基保守，可能影響植物生長。在蛋白序列中丙氨酸的替換容易影響蛋白質(zhì)構(gòu)像，大麥中HvNAM1、HvNAM2在102位丙氨酸到脯氨酸的差異，其籽粒蛋白含量上升[17]，本實(shí)驗(yàn)獲得的TdNAM也有丙氨酸的替換現(xiàn)象，可能影響蛋白結(jié)構(gòu)。史紅飛等[18]克隆得到的 TaNAC2基因編碼的蛋白預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核中，可能調(diào)節(jié)籽粒性狀。Uauy等[4]克隆得到的 TtNAM-B1、 TtNAM-B2、 TtNAM-A1位于染色體不同的位置，三者表達(dá)模式相近，均能不同程度地促進(jìn)籽粒中蛋白和鋅、鐵等微量元素的積累。通過PredictProtein預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TdNAM與TtNAM-B2在功能位點(diǎn)無差異，TdNAM應(yīng)具有促進(jìn)籽粒蛋白含量積累的功能。下一步將通過構(gòu)建遺傳群體來驗(yàn)證其在提高籽粒中蛋白含量及Zn、Fe等微量元素含量方面的功能。

本研究從858份小麥材料中篩選獲得3份含有功能性NAM基因的栽培二粒小麥，其中1個(gè)為新等位變異，為下一步選育高蛋白、微量元素含量的小麥品種提供材料和基因資源。

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Exploring New Alleles ofNAMGene Related with Grain Protein Content in Wheat

ZHU Ping1,2,FENG Bo1,XU Zhibin1,FAN Xiaoli1,WANG Tao1

(1.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Science,Chengdu,Sichuan 610041,China;2.University of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China)

NAMgene is a member of the NAC family.It can accelerate leaf senescence,and increase the protein remobilization to grains and promote absorption of zinc,iron and other trace elements.To select the excellent quality wheat with the high protein content and high trace elements,858 wheat lines were screened by co-dominant marker Xuhw89 and the full-length ofNAMgene were amplified.Our results showed there were threeTriticumdicoccumvarieties possess the functionalNAM.The nucleotides sequences analysis showed thatNAMof F37 and F40 were respectively consistent with the TaNAC2(GenBank No.HQ872050) and TtNAM-A1(GenBank No.DQ869672).TheNAMof F34 had the closest homology with the TtNAM-B2(GenBank No.DQ869676).Compared to TtNAM-B2,five variation sites were found in F34,including one difference in intron and four in exons,resulting in three amino acid variations.The prediction analysis showed that the variation had no effect on the protein function.This new allelic variation ofNAMgene was named asTdNAM(GenBank No.KU529317).In this study,the new allele ofNAMcould provide the materials and gene resources for breeding wheat varieties with high protein and trace elements content.

Wheat;NAMgene; New allele; Molecular marker; Sequence analysis

時(shí)間：2016-07-07

2016-02-25

2016-04-12

國家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)(2016ZX08009003)

E-mail：849429995@qq.com

馮 波(E-mail:fengb2600@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)07-0866-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160707.1530.012.html