張玉彪， 柳云恩， 施 琳， 佟昌慈， 叢培芳， 史秀云， 劉學磊，劉 穎， 佟 周， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室 遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

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·災(zāi)難醫(yī)學·

極寒環(huán)境對小鼠心肌組織凋亡蛋白表達影響

張玉彪， 柳云恩， 施 琳， 佟昌慈， 叢培芳， 史秀云， 劉學磊，劉 穎， 佟 周， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室 遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

目的 研究極寒環(huán)境對小鼠心臟損傷的機制。方法 將30只小鼠分為正常室溫組(15只)與-20℃實驗組(15只)兩組。將-20℃實驗組小鼠放入-20℃溫控箱內(nèi)，每日4 h，持續(xù)1周，進行HE染色與MASSON染色觀察心臟的病理學變化及纖維化，分別運用RT-PCR與Western-blot技術(shù)檢測Bad、Bax、Col-3及Bcl-xl基因與蛋白水平表達量。結(jié)果 -20℃實驗組小鼠在溫控箱內(nèi)呼吸急促，伴有顫抖，飲食飲水少于正常室溫組，毛發(fā)無光澤，心臟有一定的損傷。RT-PCR與Western-blot結(jié)果顯示，-20℃實驗組Bad、Bax、Col-3與Bcl-xl基因與蛋白表達量均升高。結(jié)論 -20℃的極寒環(huán)境對小鼠心臟細胞凋亡具有一定的損傷作用。

極寒； 凋亡； 纖維化； 小鼠

DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2016.06.07

溫度對機體具有非常重要的作用，是決定生物多樣性的一個因素。人體的正常溫度在36.4℃～37.3℃；非外傷性低溫癥是指體溫在32℃～35℃；如果受傷，人體的核心溫度將降到35℃以下[1-2]。機體對溫度的變化具有一定的調(diào)節(jié)能力，當外界溫度變化時，會刺激神經(jīng)發(fā)生一定的反應(yīng)，中樞神經(jīng)會根據(jù)相關(guān)變化調(diào)節(jié)機體的溫度。溫度降低到一定程度時，會導(dǎo)致機體發(fā)生一系列的反應(yīng)，機體的能量存儲和相關(guān)物質(zhì)的代謝均會發(fā)生改變，對器官造成一定的損傷[3-4]。本研究旨在探討-20℃低溫暴露對小鼠心臟損傷的作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明小鼠30只，6～8周齡，雄性，體質(zhì)量為23～25 g，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物醫(yī)學實驗科提供。動物自由飲食、飲水(飼料購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司)。MASSON染色試劑盒購于北京索萊寶公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TAKARA公司，熒光定量試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，Bcl-xl抗體、Bad抗體、Col-3抗體及Bax抗體購于美國Abcam公司，二抗山羊抗兔抗體購于美國Abcam公司。

1.2 方法 30只昆明小鼠隨機分為兩組：正常室溫組(15只)與-20℃實驗組(15只)。購買小鼠后，將小鼠置于室溫下，12 h白晝交替，正常飲食飲水，適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周。正常室溫組小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)1周；-20℃實驗組小鼠每日置于-20℃溫控箱內(nèi)4 h，其余時間置于室溫下，飼養(yǎng)1周。1周后對兩組小鼠進行解剖，分別留取7只為病理標本、8只為凍存標本；病理標本放入4%多聚甲醛待HE與MASSON染色，凍存標本放入-80℃冰箱內(nèi)待測基因及蛋白表達。

1.3 檢測指標

1.3.1 生理學變化 觀察兩組小鼠被毛、飲食飲水、精神狀態(tài)及體質(zhì)量的變化。

1.3.2 病理學變化 心臟標本固定24 h后進行取材，梯度脫水17 h，然后包埋、切片，進行HE染色，封片。取一空白切片，按照MASSON試劑盒說明書進行染色。顯微鏡下觀察心臟病理學變化及纖維化情況并拍片。

1.3.3 基因表達的檢測 取心臟組織，在液氮下研磨，按照Trizol提取RNA步驟進行操作，對所提RNA進行定量，然后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，行SYBR Green實時熒光定量PCR，以β-actin為內(nèi)參，對β-actin、Bad、Col-3、Bax及Bcl-xl進行擴增并分析，計算實驗組小鼠基因相對表達量。

1.3.4 蛋白表達的檢測 Western-blot法檢測蛋白表達。采用勻漿機將心臟組織制成勻漿，加入蛋白裂解液，以12 000 r/min的速度離心5 min，吸取上清液，運用酶標儀制作標準曲線。然后蛋白質(zhì)定量，垂直電泳，膠體內(nèi)的藍色條帶至分離膠底部時，完成電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印，加入β-actin、Bad、Col-3、Bax及Bcl-xl一抗，置于4℃過夜，加入二抗室溫孵育，顯影定影，拍照。以β-actin為內(nèi)參，進行灰度值分析，計算相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 生理學變化 正常室溫組小鼠的飲食飲水等情況均正常，體質(zhì)量增長正常；-20℃實驗組小鼠在溫控箱內(nèi)呼吸急促，伴有顫抖，飲食飲水少于正常室溫組，毛發(fā)無光澤，體質(zhì)量增長緩慢，個別小鼠不增長。

2.2 HE與MASSON染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，-20℃實驗組小鼠與正常室溫組小鼠比較，-20℃實驗組小鼠心臟細胞具有明顯的心肌細胞肥大、纖維化改變，并伴有炎癥細胞產(chǎn)生(圖1a、1b)。MASSON染色結(jié)果顯示，正常室溫組小鼠心臟細胞正常，無纖維化產(chǎn)生；-20℃實驗組小鼠心臟組織具有明顯的纖維化改變(圖1c、1d)。

圖1 心肌染色結(jié)果(a.實驗組HE×200;b.對照組HE×200;c.實驗組MASSON×200;d.對照組MASSON×200)

2.3 基因表達的結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示，與正常室溫組小鼠比較，-20℃實驗組小鼠心臟組織促進凋亡因子Bad、Bax及抑制凋亡因子Col-3、Bcl-xl表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 Bad、Bax、Col-3及Bcl-xl基因相對表達量

2.4 蛋白表達的結(jié)果 Western-blot結(jié)果顯示，與正常室溫組小鼠比較，-20℃實驗組小鼠心臟組織促進凋亡因子Bad、Bax及抑制凋亡因子Col-3、Bcl-xl表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2，表2。

圖2 Bad、Bax、Col-3、Bcl-xl蛋白相對表達量

組別BadBaxCol-3Bcl-xl正常室溫組(n=8)1111-20℃實驗組(n=8)3.95±0.353.46±0.283.25±0.225.62±0.45P值<0.05<0.05<0.05<0.05

3 討論

很多關(guān)于寒冷環(huán)境的研究并不局限于病情的對癥治療，更重視診治靶點的發(fā)現(xiàn)。Jain等[5]發(fā)現(xiàn)，寒冷刺激可提高成年大鼠心肌組織中GRP78、HIF-1α的蛋白表達。Su等[6]研究表明，寒冷條件下大鼠肝臟組織中TUG1高表達，TUG1可作為治療極寒環(huán)境致肝臟損傷的新靶標。Farghaly等[7]研究發(fā)現(xiàn)，寒冷條件下大鼠血清中IL-6、TNF-α的表達顯著降低，炎癥反應(yīng)被抑制。Joo等[8]發(fā)現(xiàn)，寒冷能加重小鼠急性肺損傷的炎癥反應(yīng)，IL-12、IL-17及干擾素誘導(dǎo)的單核因子的表達升高。循環(huán)系統(tǒng)在極寒環(huán)境中的早期改變有心率加快、心輸出量增多、平均動脈壓升高，隨著體溫的持續(xù)下降，心率減慢、心肌收縮力減弱、低血壓等癥狀開始出現(xiàn)，嚴重時可出現(xiàn)心房顫動、心室顫動、心臟驟停[9-11]。此外，極寒還可以使心肌細胞凋亡率顯著增加[12]。

寒冷環(huán)境不僅對身體造成了一定的損傷，對軍事作戰(zhàn)也有一定的影響。我國寒區(qū)地處國防戰(zhàn)略重地，寒區(qū)惡劣的自然環(huán)境是我國寒區(qū)部隊非戰(zhàn)斗減員的最主要原因。在朝鮮戰(zhàn)爭中，寒冷引起的我軍非戰(zhàn)斗人員傷亡占我軍傷亡總?cè)藬?shù)的20%。此后，我軍對寒冷條件下機體的保護研究進行了多種有益探索，包括開展凍傷原因調(diào)查分析、救治技術(shù)改良、凍傷防治等多項寒區(qū)專項課題攻關(guān)等，這些研究對極寒地域部隊預(yù)防并治療寒冷致機體損傷起到了積極作用。

細胞凋亡時會導(dǎo)致一系列凋亡因子發(fā)生變化，凋亡發(fā)生會使線粒體外面形成多聚的Bax孔道，使線粒體內(nèi)的色素、smac等從線粒體內(nèi)流出，從而達到細胞凋亡的作用[13-15]。Bad蛋白作為Bcl-2家族的促進凋亡因子，能夠在細胞受到凋亡刺激后從線粒體外側(cè)進入線粒體內(nèi)側(cè)，促進細胞色素的產(chǎn)生及釋放，從而達到促進凋亡的作用。Bcl-xl蛋白作為Bcl-2家族的抑制凋亡因子，當過氧化氫誘導(dǎo)H9C2凋亡時，能夠從細胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，從而發(fā)揮抑制凋亡作用。Bad蛋白能夠在凋亡時轉(zhuǎn)移到線粒體上，與Bcl-xl相互結(jié)合，形成促進凋亡的復(fù)合體，進而釋放與Bcl-xl結(jié)合能夠促進細胞凋亡的蛋白Bax，從而發(fā)揮促進凋亡作用[16-18]。

本研究中，-20℃實驗組小鼠在溫控箱內(nèi)呼吸急促，伴有顫抖，飲食飲水少于正常組，毛發(fā)無光澤，體質(zhì)量增長緩慢，個別小鼠不增長；HE染色結(jié)果中，-20℃實驗組小鼠心臟細胞具有顯著的心肌細胞肥大、纖維化改變，并伴有炎癥細胞產(chǎn)生；MASSON染色結(jié)果中，-20℃實驗組小鼠心臟組織具有明顯的纖維化改變；RT-PCR、Western-blot結(jié)果中，與正常室溫組小鼠比較，-20℃實驗組小鼠心臟組織促進凋亡因子Bad、Bax及抑制凋亡因子Col-3、Bcl-xl基因與蛋白相對表達量均升高。實驗結(jié)果表明，-20℃時，小鼠心臟細胞內(nèi)的Bad、Bax表達量升高，導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡，由于機體在低溫環(huán)境下會發(fā)揮一定的保護作用，因而Col-3、Bcl-xl表達量升高，在一定程度下對機體起到保護作用。

綜上所述，-20℃的極寒環(huán)境對小鼠心臟細胞凋亡具有一定的損傷作用。極寒環(huán)境對心臟具體凋亡機制尚需進一步研究完善。

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Effect of cold stress on the heart expression of apoptosis protein in mice

ZHANG Yu-biao,LIU Yun-en,SHI Lin,TONG Chang-ci,CONG Pei-fang,SHI Xiu-yun,LIU Xue-lei,LIU Ying,TONG Zhou,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao

(Department of Emergency Medicine,Laboratory of PLA Wound and Trauma Center,The General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Objective To explore the mechanism of cardiac injury in mice.Methods A total of 30 mice were divided into two groups the normal temperature room group(n=15) and the -20℃ experimental group(n=15),the experimental mice were placed in-20 ℃ temperature control box for 4 hours a day,Bad,Bax,Col-3 and Bcl-xl were detected by RT-PCR and Western-blot,respectively.The expression levels of Bad,Bax,Col-3 and Bcl-xl were detected by HE staining and MASSON staining in the pathological changes and fibrosis of the heart.Results In the experimental group,the heart of mice in experimental group had some damage,such as shortness of breath,shivering,drinking water less than normal group,dull hair,etc.Ruslts of RT-PCR and Western blot showed that Bad,Bax,Col-3 and Bcl-xl were increased the expression of genes and proteins.Conclusion Under the condition of -20℃,the cardiomyocyte apoptosis of mice is damaged.

Arctic; Apoptosis; Fibrosis; Mice

2014年總后衛(wèi)生部重大新上(AWS14L008)；2013年全軍十二五面上延續(xù)項目(CSY13J003)；全軍十二五面上項目(CUS11J295)

張玉彪(1987-)，男，黑龍江齊齊哈爾人，技師，博士

金紅旭，E-mail:hongxuj@126.com； 侯明曉，E-mail:houmingxiao188@163.com

2095-5561(2016)06-0347-04

R541

A

2016-10-25