龔 霞，胡瑩瑩，尤祥宇，谷 晶，鄧教宇，謝衛(wèi)紅

(1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068;

2.中國科學院武漢病毒研究所 中國科學院農(nóng)業(yè)與環(huán)境微生物學重點實驗室，湖北 武漢 430071)

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核殼型單磷酸腺苷分子印跡聚合物的制備

龔 霞1，胡瑩瑩1，尤祥宇1，谷 晶2，鄧教宇2，謝衛(wèi)紅1

(1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068;

2.中國科學院武漢病毒研究所 中國科學院農(nóng)業(yè)與環(huán)境微生物學重點實驗室，湖北 武漢 430071)

以聚苯乙烯微球(CP)為內(nèi)核、單磷酸腺苷(AMP)為模板、丙烯酰胺(AM)為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑，制備了核殼型單磷酸腺苷分子印跡聚合物(AMP-MIP)，討論了不同洗脫方式、洗脫溶劑和聚合時間對AMP-MIP吸附性能的影響，通過掃描電鏡、水中懸浮實驗和吸附實驗對AMP-MIP的形貌和性能進行了表征，得到最佳工藝條件：洗脫方式為超聲、洗脫溶劑為甲醇-乙酸(4∶1，體積比)、聚合時間為30 min。分子印跡聚合物不僅對小分子模板有吸附作用，而且對大分子ADP-核糖基化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapA)具有識別作用，吸附量可達3.9μg·mg-1。

聚苯乙烯;單磷酸腺苷;核殼聚合;分子印跡技術(shù);甘油醛-3-磷酸脫氫酶

ADP-核糖基化是一種蛋白質(zhì)的翻譯后修飾過程。研究發(fā)現(xiàn)，ADP-核糖基化蛋白質(zhì)參與多種細胞活動[1-3]，如DNA修復、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞信號傳導和細胞凋亡，還與癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心力衰竭等疾病[4-10]有關(guān)，是臨床診斷的標志物。常規(guī)檢測這類蛋白質(zhì)主要是應用以酶或抗體為接受器的生物傳感器，這類天然生物分子往往價格昂貴、處理復雜。而分子印跡聚合物(MIP)能夠模擬天然生物分子的識別作用，是生物分子的潛在替代物。與天然生物分子相比，MIP在高或低的pH值、溫度、壓強時較穩(wěn)定，制備簡單，能在有機溶劑中操作，可抗生物腐敗，儲存時間更長，更穩(wěn)定，可重復利用。

MIP的制備分為3步：(1)在合適的分散介質(zhì)中，將模板分子與合適的功能單體混合，依靠官能團之間的共價鍵或非共價鍵結(jié)合形成復合物；(2)加入適當?shù)闹驴讋⒔宦?lián)劑和引發(fā)劑，在熱或光的作用下，形成高度交聯(lián)的聚合物，而在空間排列和空間定向上，功能基團被固定；(3)通過化學或物理方法，洗脫模板分子，這樣就在MIP中留下一個在空間構(gòu)象和功能基團上與模板分子相匹配的三維空穴。當與模板分子重新結(jié)合時，MIP對模板分子具有專一性、特異性的識別作用。分子印跡技術(shù)已在膜分離、仿生傳感器[11-12]、模擬酶[13]、選擇性催化、固相萃取和色譜分離等方面取得了極大的進步，并且應用于食品安全分析[14-16]、制藥工業(yè)[17-20]、環(huán)境監(jiān)測和疾病診斷上。

作者以帶有雙硫酯基團的聚苯乙烯微球(CP)為內(nèi)核、單磷酸腺苷(AMP)為模板、丙烯酰胺(AM)為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑，采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合法(RAFT)制備了核殼型單磷酸腺苷分子印跡聚合物AMP-MIP(圖1)，擬為大分子蛋白質(zhì)的識別和富集提供一個新的策略。

圖1 核殼型分子印跡聚合物的合成路線

1 實驗

1.1 試劑與儀器

單磷酸腺苷(AMP)、偶氮二異丁腈(AIBN，純度99%)，上海源葉生物科技有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，純度98%)，Sigma公司；二乙基二硫代氨基甲酸芐酯(BDC)，分析純，武漢大學；丙烯酰胺(AM)、苯乙烯、二甲亞砜(DMSO)、乙腈、甲醇、乙酸均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

JSM-6390LV型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；UV-Lambda 35型紫外可見分光光度計，Perkin-Elmer公司；VP30型真空抽濾泵，北京萊伯泰科儀器公司；G:BOX Chemi XL1.4型凝膠成像系統(tǒng)，基因有限公司。

1.2 聚苯乙烯微球(CP)的制備

向圓底燒瓶中加入200 mL乙腈，向其中加入一定量的聚合單體苯乙烯、交聯(lián)劑EGDMA、鏈轉(zhuǎn)移劑BDC和引發(fā)劑AIBN，在磁力攪拌器上攪拌幾分鐘，再超聲混勻。反應體系抽真空完畢后，置于70 ℃油浴鍋中加熱反應4 h后，停止加熱，快速取出圓底燒瓶，浸入冰水浴冷卻至室溫。反應液真空抽濾，用50 mL甲醇洗滌白色粉末。反復洗滌5次后，于50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得帶雙硫酯基團的聚苯乙烯微球(CP)。

1.3 單磷酸腺苷分子印跡聚合物(AMP-MIP)的制備

1.3.1 模板洗脫方式的優(yōu)化

稱取模板AMP 604.2 mg、功能單體AM 123.7 mg、CP 180.0 mg置于樣品瓶中，加入25 mL致孔劑DMSO，超聲混勻。在30 ℃的水浴鍋中攪拌30 min后，再加入交聯(lián)劑EGDMA 1.310 mL、引發(fā)劑AIBN 4.2 mg、DMSO 25 mL，再次超聲混勻。將上述混合液分裝在4支小試管中，用真空抽濾泵抽真空12 min。將小試管置于65 ℃油浴鍋中，反應30 min。浸入冰水浴冷卻至室溫，抽濾，收集聚合物，均分為3份，加入50 mL甲醇-乙酸(9∶1，體積比)，第一份在磁力攪拌器上攪拌洗脫，第二份超聲洗脫，第三份索氏提取洗脫。直至UV檢測上清液在258 nm處無吸收峰，再用50 mL去離子水洗滌一次，最后用50 mL甲醇洗滌一次，真空干燥，得AMP-MIP。

非分子印跡聚合物(NIP)制備除了不加模板AMP外，其它步驟一樣。

1.3.2 模板洗脫試劑的優(yōu)化

將1.3.1所制備聚合物按表1所示洗脫試劑進行模板洗脫。

表1 模板洗脫試劑的優(yōu)化

1.3.3 聚合時間的優(yōu)化

按1.3.1步驟制備AMP-MIP和NIP，聚合時間分別為30 min、45 min和60 min，采用超聲方式進行洗脫。

表2 聚合時間的優(yōu)化

1.4 AMP-MIP的表征

1.4.1 不同洗脫條件下聚合物對AMP的吸附

用去離子水配制8μg·mL-1AMP溶液。稱取不同洗脫條件得到的AMP-MIP、 NIP各20 mg于離心管中。加入1 mL 8μg·mL-1AMP溶液，超聲，使其混合均勻。將離心管放置在恒溫搖床中，溫度設(shè)置為25 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r·min-1，振蕩16 h后，12 000 r·min-1離心15 min。取上清液，0.45μm水相濾膜過濾。紫外可見分光光度計掃描，讀取258 nm處吸光值，做平行實驗3次。根據(jù)吸附前后溶液中AMP溶液濃度的變化，計算聚合物對模板分子AMP的吸附率和結(jié)合量：

式中：c0為模板原始濃度，μg·mL-1；c1為上清液中模板濃度，μg·mL-1；V為溶液體積，mL；m為聚合物微球質(zhì)量，mg。

1.4.2 不同聚合時間下聚合物的懸浮性能

分別用去離子水配制2 mL濃度為2 mg·mL-1AMP-MIP和NIP的懸浮液，超聲，使聚合物充分分散懸浮。以黑板子為背景，按聚合時間順序排列。室溫下靜置，分時間段進行拍照。

1.4.3 不同聚合時間下聚合物的形貌表征

取一定量的聚合物，先用乙醇溶解，超聲混勻，將溶液滴在錫箔紙上，在空氣中干燥后，用掃描電鏡觀察其形貌。

1.4.4 不同聚合時間下聚合物對gapA的吸附性能

稱取1.3.3中所制備的3組AMP-MIP和NIP各10 mg于離心管中，用pH=7.5的50 mmol·L-1Tris-HCl對gapA進行稀釋，向離心管中加入0.5 mL一定濃度的gapA溶液，混合均勻。孵育16 h后，離心收集上清液，進行SDS-PAGE。使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Genetools半定量分析，以0.2 mg·mL-1BSA為標準量，定量上清液濃度。根據(jù)吸附前后溶液中g(shù)apA溶液濃度的變化，計算聚合物對蛋白質(zhì)的結(jié)合量。

2 結(jié)果與討論

2.1 AMP-MIP的洗脫條件優(yōu)化

2.1.1 洗脫方式優(yōu)化(圖2)

圖2 不同洗脫方式下聚合物對AMP的結(jié)合量

從圖2可以看出，超聲洗脫方式所得聚合物對AMP的結(jié)合量最大，即超聲洗脫方式的模板洗脫效果最好；索氏提取的次之，索氏提取比較節(jié)省溶劑，但是洗脫效率較低；攪拌洗脫方式的效果最差。因此，最佳洗脫方式為超聲。

2.1.2 洗脫試劑優(yōu)化(圖3)

圖3 不同洗脫試劑下聚合物對AMP的吸附率

模板分子與功能單體之間以非共價鍵相連，可以采用高極性洗脫溶劑反復萃取，將模板分子從印跡聚合物中除去。由圖3可以看出，在洗脫溶劑為甲醇-乙酸(4∶1)時，AMP-MIP對AMP的吸附率最高；其它3種洗脫溶劑下，AMP-MIP的吸附率都比NIP要低。這可能是因為模板分子沒有洗脫，也就是說在相同洗脫次數(shù)下，洗脫溶劑為甲醇-乙酸(4∶1)的洗脫效率最高，效果最好。

2.2 AMP-MIP的聚合時間優(yōu)化

2.2.1 水中懸浮實驗(圖4)

樣品從左到右依次為CP、M1、N1、M2、N2、M3、N3

從圖4可知，所有的聚合物比CP內(nèi)核沉淀的更快，說明印跡殼層已經(jīng)修飾上去。隨著聚合時間的延長，聚合物在水中的穩(wěn)定性越來越差，親水性越來越低。從沉降到瓶底聚合物的厚度可知，聚合物之間形成了一種支撐骨架。綜上，當聚合時間為30 min時，聚合物在水中有更好的穩(wěn)定性。

2.2.2 SEM分析(圖5)

圖5 不同聚合物的SEM照片

由圖5可知，隨著聚合時間的延長，殼層會越來越厚，聚合物越來越不均一。這主要是由于內(nèi)核表面在進行RAFT反應，內(nèi)核表面的雙硫酯基團使聚合反應活性可控，反應相對較慢，同時游離在溶劑里的化合物也在進行不可控聚合反應，當溶液中的低聚物慢慢增多至形成一定大小交聯(lián)度的顆粒，溶液稠度增大，游離的聚合物會將核殼型聚合物交聯(lián)起來，形成粒徑變大、不均一的顆粒。從聚合物M3、N3的掃描電鏡照片可以看出，核殼型聚合物之間確實交聯(lián)起來了，聚合物粒徑過大，重力變大，也說明了水中聚合物穩(wěn)定性變差的原因。

2.2.3 AMP-MIP對gapA的吸附

不同聚合時間下AMP-MIP、NIP對gapA吸附凝膠成像如圖6所示。

圖6 不同聚合時間下AMP-MIP、NIP對gapA的吸附凝膠成像

從圖6可知，隨著聚合時間的延長，AMP-MIP和NIP對目標蛋白gapA的結(jié)合量越來越少，同時印跡指數(shù)α值也在慢慢變小。不同聚合時間下AMP-MIP、NIP對gapA的結(jié)合量見圖7。

圖7 不同聚合時間下AMP-MIP、NIP對gapA的結(jié)合量

由圖7可知，當聚合時間為30 min時，AMP-MIP對ADP-核糖基化蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合效果最好，結(jié)合量達3.9μg·mL-1，聚合時間越長，結(jié)合效果越差。這主要是因為，聚合時間延長，核殼型微球相互交聯(lián)，導致顆粒變大，影響了聚合物在水中的穩(wěn)定性和親水性能，而且聚合物比表面積減小，對蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合量也會變小。所以，選擇聚合時間為30 min。

3 結(jié)論

以聚苯乙烯微球(CP)為內(nèi)核、單磷酸腺苷(AMP)為模板、丙烯酰胺(AM)為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑，制備了核殼型單磷酸腺苷分子印跡聚合物(AMP-MIP)。通過掃描電鏡、水中懸浮實驗和吸附實驗對AMP-MIP的形貌和性能進行了表征，得到最佳工藝條件：洗脫方式為超聲、洗脫溶劑為甲醇-乙酸(4∶1)、聚合時間為30 min。分子印跡聚合物不僅對小分子模板有吸附作用，而且對大分子ADP-核糖基化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapA)具有識別作用，吸附量可達3.9 μg·mg-1。

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Preparation of Core-Shell Adenosine-5′-Monophosphate Molecularly Imprinted Polymer

GONG Xia1,HU Ying-ying1,YOU Xiang-yu1,GU Jing2,DENG Jiao-yu2,XIE Wei-hong1

(1.InstituteofBioengineeringandFood,HubeiUniversityofTechnology,Wuhan430068，China；2.TheStateKeyLaboratoryofAgriculturalandEnvironmentalMicrobiologyofCAS,WuhanInstituteofVirology,CAS,Wuhan430071,China)

Usingpolystyrenemicrosphere(CP)asacore,adenosine-5′-monophosphate(AMP)asatemplate,acrylamide(AM)asafunctionalmonomerandethyleneglycoldimethacrylate(EGDMA)asacross-linker,whiledimethylsulfoxide(DMSO)waschosenasaporogenandazobisisobutyronitrile(AIBN)asaninitiator,core-shelladenosine-5′-monophosphatemolecularimprintedpolymer(AMP-MIP)wasprepared.Theeffectsofdifferentelutionmethods,solventsandpolymerizationtimeonthepropertiesofAMP-MIPrecognitionwerediscussed.ThemorphologyandpropertyofAMP-MIPwerecharacterizedbySEM,thesuspensioninaqueousmediumandthebindingexperiments.Theoptimalprocessconditionswereobtainedasfollows:theelutionmethodwasultrasound,theelutionsolventwasmethanol-aceticacid(4∶1)andpolymerizationtimewas30min.AMP-MIPshowedgoodselectivitiesnotonlyforAMPbutalsoforglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(gapA)whichwasADP-ribosylatedprotein.TheadsorptioncapacityofgapAcouldreach3.9 μg·mg-1.

polystyrene;adenosine-5′-monophosphate;core-shellpolymerization;molecularlyimprintingtechnology;glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase

中國科學院病毒研究所國家重點實驗室開放研究基金(20875024)

2016-06-06

龔霞(1990-)，女，湖北荊門人，碩士研究生，研究方向：分子印跡材料，E-mail:gongxia824@126.com;通訊作者：謝衛(wèi)紅，博士，教授，E-mail:weihong.xie@mail.hbut.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.11.005

龔霞，胡瑩瑩，尤祥宇，等.核殼型單磷酸腺苷分子印跡聚合物的制備[J].化學與生物工程，2016，33(11)：27-31.

TQ 317

A

1672-5425(2016)11-0027-05