譚效松,朱國中,賀紅武

(華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院 農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，湖北 武漢 430079)

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O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯的合成與生物活性

譚效松,朱國中,賀紅武

(華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院 農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，湖北 武漢 430079)

丙酮酸脫氫酶系(PDHc)屬于焦磷酸硫胺素(TPP)依賴性酶，是一個具有重要農(nóng)學(xué)意義的農(nóng)藥作用靶標。以微生物中的丙酮酸脫羧酶E1(PDHc E1)為靶標,設(shè)計合成TPP類似物有望發(fā)現(xiàn)新型的殺菌活性化合物。以三唑環(huán)代替TPP結(jié)構(gòu)中的噻唑環(huán)，以異硫氰酸酯結(jié)構(gòu)單元替代TPP結(jié)構(gòu)中的焦磷酸結(jié)構(gòu)單元，設(shè)計合成了O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯類系列化合物Ⅰa～Ⅰj，采用IR、1HNMR、MS和元素分析對Ⅰa～Ⅰj進行了結(jié)構(gòu)表征，部分化合物還經(jīng)13CNMR進一步進行了結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明，此類化合物不僅為大腸桿菌丙酮酸脫羧酶E1(PDHc E1)的抑制劑,而且還顯示了殺菌活性。

丙酮酸脫羧酶；焦磷酸硫胺素；氨基硫代甲酸酯；生物活性

根據(jù)生物化學(xué)原理,丙酮酸脫氫酶系(pyruvatedehydrogenasecomplex,PDHc)是一個具有重要農(nóng)學(xué)意義的農(nóng)藥作用靶標[1]。PDHc屬于焦磷酸硫胺素(thiaminepyrophosphate,TPP)依賴性酶，也稱丙酮酸脫氫酶復(fù)合體，主要由3種酶組成：丙酮酸脫羧酶E1(PDHcE1)、二氫硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶E2以及二氫硫辛酸脫氫酶E3，在微生物、哺乳動物以及高等植物中廣泛存在。在PDHc的催化下，丙酮酸發(fā)生不可逆的氧化脫羧反應(yīng)生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A再進入三羧酸循環(huán)被徹底氧化，為生物體供給大量能量[2-3]。因此，該步驟是連接糖的酵解和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在生物體代謝中起著極其關(guān)鍵的作用，一直以來都是醫(yī)藥及農(nóng)藥研究者關(guān)注的熱點[4]。在PDHc催化的5步反應(yīng)中，由PDHcE1催化的第一步反應(yīng)是唯一的不可逆步驟，因此，以微生物中的PDHcE1為靶標設(shè)計新型的殺菌劑具有很高的探索價值。在此催化反應(yīng)中，TPP作為PDHc的輔因子與PDHcE1結(jié)合，促使丙酮酸氧化脫羧產(chǎn)生羥乙基TPP負碳離子。因此，TPP在該不可逆過程中起著至關(guān)重要的作用，如果沒有TPP的參與，該反應(yīng)步驟則不能順利完成，進而整個丙酮酸氧化脫羧反應(yīng)被阻斷，這也就意味著整個生物體不能利用糖的有氧代謝為機體提供必需的能量，從而導(dǎo)致生物體死亡。因此，通過設(shè)計合成以微生物的PDHcE1為靶標的TPP類似物抑制劑,有望發(fā)現(xiàn)新型的殺菌活性化合物[5-9]。鑒于此，作者對TPP結(jié)構(gòu)進行改造和修飾,考慮到TPP結(jié)構(gòu)中焦磷酸部分電荷高，很難穿透細胞膜，而含有異硫氰酸酯亞結(jié)構(gòu)的化合物很多都具有良好的殺菌活性，將其引入替代TPP結(jié)構(gòu)中的焦磷酸結(jié)構(gòu)單元，同時,為了便于合成,以三唑環(huán)代替了TPP結(jié)構(gòu)中的噻唑環(huán),從而設(shè)計合成了新型O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯類系列化合物Ⅰa～Ⅰj，并對目標化合物進行了結(jié)構(gòu)表征,測定了目標化合物對大腸桿菌PDHcE1和6種常見作物病菌的抑制活性。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

三乙胺、氯化亞砜、炔丙醇、VB1、疊氮化鈉、取代苯甲酸、硫氰化鉀、檸檬酸、無水硫酸鈉、亞硫酸鈉、碘化亞銅、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、乙腈、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺。以上試劑均為分析純。

德國Heidilph MR3001型磁力攪拌器；SHZ-D型循環(huán)水真空泵，鞏義英裕予華儀器廠；德國BuchiRotavapor R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；AVATAR 360型傅立葉紅外光譜儀；Varian XL-400M型核磁共振譜儀；Finnigen TRACE MS型質(zhì)譜儀；Vario EL Ⅲ型元素分析儀；WRS-IB型熔點儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 2-甲基-4-氨基-5-疊氮甲基嘧啶(Ⅲ)的合成[10]

向裝有100 mL水的圓底燒瓶中依次加入VB1(Ⅱ，10.3 g,30.6 mmol)、疊氮化鈉(4.9 g,75.4 mmol)和亞硫酸鈉(0.38 g,3.0 mmol)，混合物在65 ℃下反應(yīng)5 h；然后加入檸檬酸(21.0 g,100 mmol )調(diào)節(jié)溶液pH值約為4，用二氯甲烷萃取，棄去有機層；向水層加入碳酸鉀至溶液pH值約為8，析出白色固體，即為2-甲基-4-氨基-5-疊氮甲基嘧啶(Ⅲ)，收率65%，m.p.150～153 ℃。

1.2.2 取代苯甲酰氯(Ⅴ)的合成[11]

向干燥三頸瓶中加入0.03 mol取代苯甲酸(Ⅳ)和4 mL氯化亞砜，同時滴入1～2滴DMF，加熱至65～70 ℃，回流反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸出反應(yīng)剩余的氯化亞砜，得取代苯甲酰氯(Ⅴ)粗產(chǎn)品(淡黃色液體)，收率87%～94%，直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.3 取代苯甲酰基異硫氰酸酯(Ⅵ)的合成[11]

向干燥三頸瓶中加入0.03 mol硫氰化鉀和25 mL無水乙腈,冷卻至10 ℃以下。將0.03 mol取代苯甲酰氯(Ⅴ)溶于10 mL無水乙腈，通過恒壓滴液漏斗緩慢滴入三頸瓶中，滴畢，室溫下攪拌20 min，再加熱至85 ℃，回流反應(yīng)1.5 h，冷卻至室溫，加入三乙胺調(diào)節(jié)溶液的pH值約為7，抽濾，除去反應(yīng)生成的氯化鈉固體，將濾液脫溶即得取代苯甲?；惲蚯杷狨?Ⅵ)粗產(chǎn)品(橙色液體)，收率90%以上，直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.4 取代苯甲酰基氨基硫代甲酸炔丙酯(Ⅷ)的合成[12]

向干燥三頸瓶中加入0.03 mol炔丙醇(Ⅶ)、0.015 mol三乙胺及15 mL無水乙腈，冷卻至10 ℃以下。將0.025 mol取代苯甲?；惲蚯杷狨?Ⅵ)溶于10 mL無水乙腈，通過恒壓滴液漏斗緩慢滴入三頸瓶中，滴畢，室溫下攪拌12～24 h，薄層層析法(TLC)跟蹤反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化鈉溶液各洗滌一次至溶液呈中性，再用15 mL的二氯甲烷萃取水相3次，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，抽濾，脫溶即得粗產(chǎn)品。經(jīng)硅膠G柱層析純化，洗脫劑為乙酸乙酯-石油醚(1∶3，體積比)。純品為無色或淡黃色液體，收率62%～75%。

1.2.5 目標化合物Ⅰa～Ⅰj的合成[10]

向干燥圓底燒瓶中加入0.01 mol 2-甲基-4-氨基-5-疊氮甲基嘧啶(Ⅲ)、0.01 mol取代苯甲?；被虼姿崛脖?Ⅷ)、0.01 mol三乙胺及10 mL無水四氫呋喃，室溫攪拌20 min，待圓底燒瓶中所有固體全部溶解后，向其中加入1.6 mg碘化亞銅，室溫攪拌反應(yīng)12～24 h。反應(yīng)完畢，緩慢加入50 mL水，繼續(xù)攪拌，待溶液中出現(xiàn)大量黃色固體。抽濾，水沖洗，所得固體即為粗產(chǎn)品。將所得粗產(chǎn)品用DMF和水重結(jié)晶，得到Ⅰa～Ⅰj淡黃色固體，收率70%～88%。

Ⅰa～Ⅰj,R:H、2-Cl、3-Cl、4-Cl、2-CH3、4-CH3、2-F、4-F、2-Br、2，6-F2

1.2.6 PDHc E1抑制活性測試

在100 μL測活體系中加入0.2 mmol·L-1TPP、0.4 mmol·L-1DCIP、50 mmol·L-1K3PO4(pH=6.4)、5μg PDHc E1(Cx-ace)和100μmol·L-1的待測化合物(對照組加入等量的溶劑DMSO)。先不加底物，在恒溫箱中37 ℃下溫育3 min，讓酶與其它反應(yīng)試劑充分結(jié)合，然后加入2 mmol·L-1底物開啟反應(yīng)，用酶標儀測600 nm處吸光度，0 min時測一次OD0min，在酶標儀中37 ℃反應(yīng)5 min后，再測OD5min，最后求吸光度的差值△OD=OD0min-OD5min，每組實驗做平行3～5個。按下式計算酶抑制率：

1.2.7 殺菌活性測試

以菌絲的生長速率為依據(jù)來測定殺菌活性。選取水稻紋枯病、黃瓜灰霉病、小麥赤霉病、番茄早疫病、煙草赤星病和黃瓜炭疽病作為供試靶標。目標化合物用少許丙酮溶解，吐溫-80乳化，加入蒸餾水配成一定濃度溶液待用。取馬鈴薯20g、葡萄糖15g、瓊脂15g和水1 000mL配成培養(yǎng)基后，與直徑9cm的培養(yǎng)皿高溫減壓滅菌25min；趁熱將13.5mL培養(yǎng)基和1.5mL藥液混合均勻等分到兩個培養(yǎng)皿中，水平放置，冷卻；用滅過菌的取菌器分別從培養(yǎng)液中取5mm帶菌瓊脂，放入各培養(yǎng)皿中(菌絲面向下)，每皿放2～3種菌。設(shè)兩組空白對照，然后置于無菌恒溫干燥箱內(nèi)48h，測定菌斑的直徑。以不加目標化合物為空白對照，按下式計算抑菌率：

2 結(jié)果與討論

2.1 目標化合物的結(jié)構(gòu)表征

采用IR、1HNMR、MS等手段對目標化合物進行結(jié)構(gòu)表征，部分化合物還采用13CNMR進行結(jié)構(gòu)表征，同時采用元素分析進一步確定目標化合物的結(jié)構(gòu)。目標化合物的理化常數(shù)及結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)如下：

Ⅰa：淺黃色固體，收率88%，m.p.120～122 ℃。 IR(KBr)，ν，cm-1:3 512,3 150,1 702,1 606,1 440,1 277;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),5.35(s,2H,-CH2-),5.44(s,2H,-CH2-),5.66(s,2H,-NH2),7.41～8.03(m,5H,phenyl-H),7.72(s,1H,-C=CH-),8.19(s,1H,-CH=N-);13CNMR(400 MHz,DMSO-d6)，δ：25.2,46.9,57.9,108.2,125.0,128.8, 129.2,133.5,142.0,156.4,156.4,161.6,165.5,167.2,179.3;MS(ESI)，m/z:384[M+H]+;Anal.Calcd for C17H17N7O2S (383.03):C53.25,H 4.47,N 25.57,S 8.36,Found:C 53.09,H 4.74,N 25.33,S 8.04。

Ⅰb：黃色固體，收率87%，m.p.115～116 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 544,3 145,1 717,1 606,1 441,1 265;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.50(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.45(s,2H,-CH2-),5.58(s,2H,-NH2),7.28～7.85(m,4H,phenyl-H),7.46(s,1H,-C=CH-),8.19(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:418[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16ClN7O2S(417.39):C 48.86，H 3.86，Cl 8.48，N 23.46，S 7.67，F(xiàn)ound:C 48.83，H 4.20，N 23.57，S 7.82。

Ⅰc：黃色固體，收率84%，m.p.139～141 ℃。 IR(KBr)，ν，cm-1:3 454,3 147,1 722,1 599，1 441,1 270;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),5.38(s,2H,-CH2-),5.44(s,2H,-CH2-),5.66(s,2H,-NH2),7.35～7.99(m,4H,phenyl-H),7.72(s,1H,-C=CH-),8.05(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:418[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16ClN7O2S(417.39):C 48.86，H 3.86，Cl 8.48，N 23.46，S 7.67，F(xiàn)ound:C 49.24，H 3.96，N 23.53，S 7.74。

Ⅰd：黃色固體，收率78%，m.p.124～125 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 452,3 110,1 708,1 601,1 441,1 277);1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.43(s,2H,-CH2-),5.63(s,2H,-NH2),7.39～7.97(m,4H,phenyl-H),7.71(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);13CNMR(400 MHz,DMSO-d6)，δ：25.2,46.8,58.1,108.2,125.0,128.1,131.0,138.4,141.7,156.3,161.5,164.6,167.6,180.3;MS(ESI)，m/z:418[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16ClN7O2S (417.39):C 48.86，H 3.86，Cl 8.48，N 23.46，S 7.67，F(xiàn)ound:C 49.02，H 4.05，N 23.33，S 7.75。

Ⅰe：淺黃色固體，收率73%，m.p.156～157 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 512,3 150,1 702,1 616,1 441,1 270;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),2.62(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.41(s,2H,-CH2-),5.67(s,2H,-NH2),7.22～7.96(m,4H,phenyl-H),7.71(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:398[M+H]+;Anal.Calcd for C18H19N7O2S(397.21):C 54.39，H 4.82，N 24.67，S 8.07，F(xiàn)ound:C 54.69，H 4.99，N 24.65，S 7.62.

Ⅰf：黃色固體，收率83%，m.p.123～125 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 452,3 118,1 709,1 600,1 441,1 253;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.51(s,3H,-CH3),2.65(s,3H,-CH3),5.38(s,2H,-CH2-),5.43(s,2H,-CH2-),5.54(s,2H,-NH2),7.32～7.93(m,4H,phenyl-H),7.71(s,1H,-C=CH-),8.08(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:398[M+H]+;Anal.Calcd for C18H19N7O2S(397.21):C 54.39，H 4.82，N 24.67，S 8.07，F(xiàn)ound:C 54.17，H 4.73，N 23.55，S 8.01。

Ⅰg：淺黃色固體，收率71%,m.p.146～148 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 453,3 148,1 729,1 606,1 441,1 253;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.46(s,2H,-CH2-),5.60(s,2H,-NH2),7.11～7.93(m,4H,phenyl-H),7.52(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:402[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16FN7O2S(401.35):C 50.87，H 4.02，N 24.43，S 7.99，F(xiàn)ound:C 51.04，H 4.29，N 24.32，S 7.66。

Ⅰh：黃色固體，收率76%，m.p.132～133 ℃。 IR(KBr)，ν，cm-1:3 454,3 111,1 721,1 606,1 441，1 253;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.50(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.43(s,2H,-CH2-),5.62(s,2H,-NH2),7.07～8.06(m,4H,phenyl-H),7.71(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);MS(ESI) ，m/z:398[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16FN7O2S(401.35):C 50.87，H 4.02，N 24.43，S 7.99，F(xiàn)ound:C 50.92，H 4.34，N 24.40，S 7.80。

Ⅰi：黃色固體，收率70%，m.p.134～136 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 453,3 145,1 721,1 606,1 441,1 270;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.50(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.45(s,2H,-CH2-),5.61(s,2H,-NH2),7.33～7.80(m,4H,phenyl-H),7.66(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:463[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16BrN7O2S(462.47):C 44.16，H 3.49，N 21.21，S 6.94，F(xiàn)ound:C 44.44，H 3.77，N 21.38，S 6.84。

Ⅰj：黃色固體，收率77%，m.p.141～142 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 440,3 139,1 725,1 566,1 441,1 265;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.42(s,2H,-CH2-),5.59(s,2H,-NH2),6.92～7.71(m,3H,phenyl-H),7.71(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:420[M+H]+;Anal.Calcd for C17H15F2N7O2S(462.36):C 48.68，H 3.60，F(xiàn) 9.06，N 23.38，S 7.65，F(xiàn)ound:C 48.32，H 3.86，N 23.62，S 7.54。

2.2 合成反應(yīng)條件的探討

在制備取代苯甲酰氯時SOCl2既作原料又作溶劑，反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)減壓蒸餾除盡過量的SOCl2，若SOCl2殘余量過多，會導(dǎo)致后續(xù)制備取代苯甲酰基異硫氰酸酯的反應(yīng)失敗。

在三乙胺的催化下，炔丙醇與取代苯甲?；惲蚯杷狨グl(fā)生親核加成反應(yīng)，整個反應(yīng)相對溫和，為保證反應(yīng)的順利進行，原料炔丙醇、取代苯甲?；惲蚯杷狨ズ头磻?yīng)溶劑乙腈必須干燥無水，否則將降低產(chǎn)物的收率和純度；采用炔丙醇稍過量的配比(炔丙醇∶苯甲?；惲蚯杷狨?1.2∶1，物質(zhì)的量比)更有利于反應(yīng)完全和產(chǎn)物的分離；取代苯甲?；惲蚯杷狨ピ趶妷A及高溫條件下易分解，因此需選用弱堿三乙胺(或吡啶)作為反應(yīng)的催化劑，在滴加取代苯甲?；惲蚯杷狨r，需控制反應(yīng)體系的溫度在10 ℃以下。

目標化合物Ⅰa～Ⅰj的合成利用了點擊化學(xué)的原理。關(guān)于利用點擊化學(xué)原理構(gòu)建三唑環(huán)的合成方法，文獻報道主要包括以下兩類：(1)以無水硫酸銅、抗壞血酸鈉為催化劑，以水和叔丁醇為反應(yīng)溶劑；(2)以碘化亞銅和三乙胺為催化劑，以四氫呋喃為反應(yīng)溶劑。對兩種方法均進行了嘗試，其中方法(1)中，抗壞血酸鈉具有很強的還原性，且不是很穩(wěn)定，保存不便；方法(2)具有操作簡單、無副產(chǎn)物及收率高的特點。因此，采用方法(2)合成，利用點擊化學(xué)的原理在分子骨架中引入三唑環(huán)結(jié)構(gòu)單元，成功合成了目標化合物Ⅰa～Ⅰj。

2.3 生物活性

2.3.1 目標化合物對大腸肝菌PDHc E1的抑制活性

作者所在實驗室通過長期、系統(tǒng)的研究，采用基因克隆的方法從大腸桿菌中表達并純化獲得了純的PDHc E1，建立了化合物對PDHc E1抑制活性的篩選體系。為了考察所設(shè)計合成的目標化合物是否為PDHc E1靶酶的抑制劑,首先在100μmol·L-1濃度下測試目標化合物Ⅰa～Ⅰj對大腸桿菌PDHc E1的抑制活性，并計算IC50值，結(jié)果見表1。

表1 目標化合物Ⅰa～Ⅰj對大腸桿菌PDHc E1的抑制活性

由表1可知，目標化合物Ⅰa～Ⅰj對大腸桿菌PDHc E1具有顯著的抑制活性，有7個目標化合物在100μmol·L-1濃度下對大腸桿菌PDHc E1的抑制率達到98%～100%。特別是目標化合物Ⅰf和Ⅰj的抑制活性最高，其IC50值小于10μmol·L-1，分別為8μmol·L-1和7μmol·L-1。

總結(jié)目標化合物Ⅰa～Ⅰj的構(gòu)效關(guān)系,發(fā)現(xiàn)Ⅰa～Ⅰj分子中苯環(huán)上取代基R的種類和位置對大腸桿菌PDHc E1的抑制活性具有下列影響：

(1)當苯環(huán)上2-位和6-位同時被強吸電子基F取代時，化合物具有最高的酶抑制活性?；衔铫駄(R=2,6-F2)對大腸桿菌PDHc E1的IC50值為7μmol·L-1。

(2)當苯環(huán)上為單取代時，取代基的位置對化合物酶抑制活性的影響為：4-位取代的化合物的酶抑制活性優(yōu)于2-位和3-位取代的化合物，如化合物Ⅰd(R=4-Cl)、Ⅰc(R=3-Cl)和Ⅰb(R=2-Cl)對大腸桿菌PDHc E1的IC50值分別為10μmol·L-1、11μmol·L-1和12μmol·L-1。其它化合物也有同樣的構(gòu)效關(guān)系。

(3)當苯環(huán)上4-位被單取代時，取代基為推電子基時優(yōu)于吸電子基化合物的酶抑制活性。如化合物Ⅰf(4-CH3)、Ⅰd(R=4-Cl)和Ⅰh(R=4-F)對大腸桿菌PDHc E1的IC50值分別為8μmol·L-1、10μmol·L-1和14μmol·L-1。

2.3.2 目標化合物對常見農(nóng)作物病菌的殺菌活性

為了考察目標化合物Ⅰa～Ⅰj的殺菌活性，選取6種農(nóng)作物的常見病菌：水稻紋枯病(Rhizoctoniasolani)、黃瓜灰霉病(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病(Fusariumgraminearum)、番茄早疫病(Alternariasolani)、煙草赤星病(Alternariaalternata)和黃瓜炭疽病(Colletotrichumorbiculare) 作為測試靶標，在100 mg·L-1的濃度下，對目標化合物Ⅰa～Ⅰj的殺菌活性進行測試，結(jié)果如表2所示。

表2 目標化合物Ⅰa～Ⅰj的殺菌活性

由表2可知，在100 mg·L-1的濃度下，目標化合物對黃瓜灰霉病、煙草赤星病和黃瓜炭疽病的殺菌活性較為突出，而對小麥赤霉病、水稻紋枯病和番茄早疫病的殺菌活性較差。目標化合物的殺菌活性總體上低于對照藥劑苯醚甲環(huán)唑。

目標化合物Ⅰa～Ⅰj分子中苯環(huán)上取代基R的種類和位置對殺菌活性具有下列影響：

(1)當苯環(huán)上2-位和6-位同時被強吸電子基F取代時，化合物具有最高的殺菌活性，如化合物Ⅰj(R=2,6-F2)對水稻紋枯病的抑菌率達到91%，與苯醚甲環(huán)唑相當。

(2)當苯環(huán)上為單取代時，取代基的位置對化合物殺菌活性的影響為：4-位取代化合物的殺菌活性優(yōu)于2-位和3-位取代的化合物，如化合物Ⅰh(R=4-F)、Ⅰc(R=3-Cl)和Ⅰg(R=2-F)對黃瓜灰霉病的抑菌率分別為73%、54%和32%。

(3)當苯環(huán)上R為4-位單取代時，取代基種類對化合物殺菌活性的影響為：當4-位取代基為推電子基時，相應(yīng)化合物的殺菌活性優(yōu)于4-位為吸電子基時對應(yīng)的化合物，如化合物Ⅰf(4-CH3)、Ⅰa(R=H)和Ⅰd(4-Cl)對黃瓜炭疽病的抑制率分別為74%、72%和30%。

比較目標化合物對大腸桿菌PDHc E1的抑制活性和殺菌活性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)二者之間的構(gòu)效關(guān)系基本一致,化合物對大腸桿菌PDHc E1的抑制活性順序與化合物的殺菌活性順序具有很好的對應(yīng)關(guān)系。如Ⅰf和Ⅰj的IC50值分別為8μmol·L-1和7μmol·L-1,是該系列中酶抑制活性最高的化合物，并且它們也是該系列中殺菌活性最高的化合物。

3 結(jié)論

根據(jù)生物化學(xué)原理,以PDHc E1為靶標，通過設(shè)計輔酶TPP類似物來獲得PDHc E1抑制劑，以期發(fā)現(xiàn)具有殺菌活性的化合物。對輔酶TPP的結(jié)構(gòu)進行合理改造，以三氮唑替代TPP結(jié)構(gòu)中的噻唑環(huán)，同時以具有良好殺菌活性的苯甲酰基異硫氰酸酯結(jié)構(gòu)單元替代TPP結(jié)構(gòu)中的焦磷酸部分，設(shè)計合成了10個新型的TPP類似物,即O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯類化合物，所有目標化合物經(jīng)1HNMR、IR、MS和元素分析進行結(jié)構(gòu)表征和確認，部分化合物還經(jīng)13CNMR進行結(jié)構(gòu)表征。測試了目標化合物對大腸桿菌PDHc E1的抑制活性和對常見農(nóng)作物病菌水稻紋枯病、黃瓜灰霉病、小麥赤霉病、番茄早疫病、煙草赤星病和黃瓜炭疽病的殺菌活性，結(jié)果表明此類化合物不僅對大腸桿菌PDHc E1具有顯著的抑制活性,部分化合物還顯示了明顯的殺菌活性。目標化合物的酶抑制活性和殺菌活性之間存在相關(guān)性，表明作者的設(shè)計思想是合理可行的。

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Synthesis and Biological Activity ofO-[1-(2-methyl-4-aminopyrimidine-5-methyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl] methyl benzoylcarbamothioates

TAN Xiao-song,ZHU Guo-zhong，HE Hong-wu

(KeyLaboratoryofPesticide&ChemicalBiology,MinistryofEducation，CollegeofChemistry,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079,China)

Pyruvatedehydrogenasecomplex(PDHc)whichbelongstothiaminepyrophosphate(TPP)-dependentenzymeisanimportanttargetforthedevelopmentofnewpesticide.ThedesignandsynthesisofTPPanalogsareexpectedtofindnewantifungalactivecompoundswhichtargetpyruvatedecarboxylaseE1(PDHcE1)inmicroorganism.AseriesofnewO-[1-(2-methyl-4-aminopyrimidine-5-methyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)]methylbenzoylcarbamothioatesⅠa～Ⅰjweredesignedandsynthesizedbyintroducingtriazoleringinsteadofthiazolering,andisothiocyanatestructuralunitreplacingpyrophosphateinthestructureofTPP.TargetcompoundswerecharacterizedbyIR,1HNMR,MSandconfirmedbyelementalanalysis.Somecompoundswerealsocharacterizedby13CNMRspectra.TheresultsshowedthatcompoundsⅠa～ⅠjweredemonstratedtobeEscherichia coliPDHcE1inhibitorsandsomecompoundsexhibitedantifungalactivitybythebioassay.

pyruvatedecarboxylaseE1(PDHcE1);thiaminepyrophosphate(TPP);carbamothioate;biologicalactivity

國家973計劃資助項目(2010CB126100)，國家自然科學(xué)基金資助項目(20772042)

2016-09-18

譚效松(1962-)，男，副教授，主要從事農(nóng)藥分子設(shè)計與性質(zhì)研究；通訊作者：賀紅武，教授，E-mail:he1208@mail.ccnu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.11.001

譚效松,朱國中,賀紅武.O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯的合成與生物活性[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(11)：1-7.

O 627.42

A

1672-5425(2016)11-0001-07