邵翔 陳后煌 陳達(dá) 馬玉環(huán) 鄭文偉 葉蕻芝 李西海

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·實(shí)驗(yàn)研究·

透骨消痛膠囊抑制脂多糖誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究

邵翔 陳后煌 陳達(dá) 馬玉環(huán) 鄭文偉 葉蕻芝 李西海

目的 探討透骨消痛膠囊抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)作用機(jī)制。方法 對(duì)4周齡雄性SD大鼠采用機(jī)械-Ⅱ型膠原酶消化法獲取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，將軟骨細(xì)胞分為空白組、模型組以及透骨消痛膠囊組，空白組加入含10%胎牛血清(FBS)的低糖型Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM/LOW)2 mL，模型組加入含10 ng/mL LPS、10%FBS的DMEM/LOW培養(yǎng)基 2 mL，透骨消痛膠囊組加入含10 ng/mL LPS、透骨消痛膠囊(300 μg/mL)、10%FBS的DMEM/LOW培養(yǎng)基 2 mL。干預(yù)8 h后，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)各組微小RNA(miRNA)-140表達(dá)變化，免疫熒光觀察各組帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶(ADAMTS)4、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3表達(dá)變化，Image J分析各組平均光密度。結(jié)果 與空白組相比，模型組MMP-3表達(dá)升高(P<0.05)、ADAMTS4表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，透骨消痛膠囊組MMP-3表達(dá)下降(P<0.05)、ADAMTS4表達(dá)明顯下降(P<0.01)。與空白組相比，模型組軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，透骨消痛膠囊組軟骨細(xì)胞miRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 透骨消痛膠囊能促進(jìn)miRNA-140表達(dá)，降低ADAMTS4、MMP-3分泌，抑制炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的軟骨基質(zhì)降解，從而延緩骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變。

軟骨細(xì)胞；微小RNA-140；骨關(guān)節(jié)炎；基質(zhì)金屬蛋白酶-3；炎癥反應(yīng)

Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine1, Fuzhou 350122, China; College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine2, Fuzhou 350122, China; Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, Fujian University of Traditional Chinese Medicine3, Fuzhou 350122, China

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以軟骨退變、軟骨下骨重建異常、骨質(zhì)增生為主要特征的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾病[1]，好發(fā)于老年且發(fā)病年齡呈低齡化趨勢(shì)[2]，隨著病程的進(jìn)展，患者可出現(xiàn)功能障礙。炎癥反應(yīng)在OA病程進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，炎性因子高表達(dá)可直接導(dǎo)致軟骨代謝穩(wěn)態(tài)失衡，發(fā)生軟骨基質(zhì)降解、關(guān)節(jié)軟骨退變。微小RNA(miRNA)-140特異性表達(dá)于軟骨組織中，在OA軟骨中表達(dá)明顯降低[3]。OA屬中醫(yī)“痹癥”、“痿證”范疇，其核心病機(jī)為本痿標(biāo)痹，肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)則筋脈拘攣、關(guān)節(jié)不利，治療時(shí)應(yīng)以補(bǔ)腎柔肝為主，輔以活血祛風(fēng)。研究[4-6]顯示，福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑透骨消痛膠囊(批準(zhǔn)文號(hào)：閩制字Z20100006)可通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞凋亡以增強(qiáng)其自噬作用，促進(jìn)軟骨基質(zhì)成分表達(dá)，從而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，具有補(bǔ)腎柔肝、活血祛風(fēng)的功效，臨床效果良好。本研究以大鼠軟骨細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察經(jīng)透骨消痛膠囊干預(yù)后軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3、帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶(ADAMTS)4、miRNA-140等表達(dá)變化，探討透骨消痛膠囊抑制OA炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為4周齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠，體重200～250 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置按照2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》執(zhí)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：透骨消痛膠囊(原方由巴戟天12 g、白芍12 g、川芎6 g和腫節(jié)風(fēng)6 g組成)；脂多糖(LPS)、Ⅱ型膠原酶(美國(guó)sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、低糖型Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM/LOW)、0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(FBS，美國(guó)Gibco公司)；激光共聚焦培養(yǎng)皿(中國(guó)NEST公司)； MMP-3抗體、ADAMTS4抗體(美國(guó)Santa cruz公司)；Ⅱ型膠原抗體(美國(guó)abcam公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、免疫組化試劑盒(中國(guó)博士德公司)；六孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)Corning公司)；熒光染料GOXRB ALEXA FLUOR 488、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，美國(guó)Thermo fisher公司)；miRNA提取試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA-140引物、U6引物(美國(guó)Taqman公司)；白細(xì)胞介素(IL)-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(美國(guó)R&D公司)；牛血清白蛋白(BSA)(中國(guó)碧云天公司)；封閉山羊血清(中國(guó)索萊寶公司)。

儀器：激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo fisher公司)；LX-800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-tek公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.3 軟骨細(xì)胞提取

取4周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，無(wú)菌條件下取關(guān)節(jié)表面軟骨，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中PBS充分漂洗3次，使用手術(shù)刀片切成1 mm3方塊，再用PBS清洗1次，吸干殘液，加入0.2%Ⅱ型膠原酶4 mL，放入37℃的培養(yǎng)箱中消化，每隔2 h收集上清液并重新加入0.2%Ⅱ型膠原酶4 mL，上清液以1 000 rpm離心5 min，棄上清液，收集軟骨細(xì)胞沉淀，重復(fù)3次。用含10%FBS的DMEM/LOW培養(yǎng)基重懸軟骨細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，48 h后倒置顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞貼壁情況，隔天換液，待軟骨細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用Ⅱ型膠原免疫組化染色法對(duì)第2代軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定，軟骨細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒提示軟骨細(xì)胞提取成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

將軟骨細(xì)胞分為空白組、模型組、透骨消痛膠囊組?？瞻捉M中加入含10%FBS的DMEM/LOW培養(yǎng)基 2 mL，模型組中加入含10 ng/mL LPS、10%FBS的DMEM/LOW 培養(yǎng)基2 mL，透骨消痛膠囊組中加入含10 ng/mL LPS、透骨消痛膠囊(分別為100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL)、10%FBS的DMEM/LOW 培養(yǎng)基2 mL。干預(yù)8 h后取軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫下以3 000 rpm離心10 min，取細(xì)胞培養(yǎng)液。IL-1β是OA病程中最主要的炎性因子之一，其高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致MMP、ADAMTS等表達(dá)升高，因此本實(shí)驗(yàn)采用IL-1β作為檢測(cè)模型建立以及藥物干預(yù)濃度確立的指標(biāo)。ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β水平可見(jiàn)，模型組IL-1β分泌量明顯高于空白組(P<0.01)，透骨消痛膠囊(300 μg/mL)組IL-1β分泌量明顯低于模型組(P<0.01)(圖1)。故本實(shí)驗(yàn)透骨消痛膠囊組選取透骨消痛膠囊300 μg/mL聯(lián)合LPS 10 ng/mL進(jìn)行干預(yù)。

圖1 各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β水平

注：★表示與空白組相比，P<0.01；☆表示與模型組相比，P<0.01

1.5 免疫熒光檢測(cè)軟骨細(xì)胞MMP-3、ADAMTS4表達(dá)

將軟骨細(xì)胞4 × 104/mL接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，分組干預(yù)8 h后，無(wú)菌PBS沖洗3次，-20℃預(yù)冷，加無(wú)水甲醇4℃固定30 min，之后無(wú)菌PBS沖洗3次，加入0.25%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX)-100破膜10 min，PBS沖洗3次。加入含10%羊血清的5%BSA 2 mL作為封閉液室溫封閉1 h，移除培養(yǎng)皿內(nèi)封閉液后分別加入MMP-3抗體(與封閉液體積比1∶100)或ADAMTS4抗體(與封閉液體積比1∶150)0.8 mL作為第一抗體，4℃過(guò)夜孵育， PBS漂洗4次后加入5 μg/mL山羊抗兔IgG(H+L)1.5 mL配合熒光染料作為第二抗體，37℃避光孵育1 h，PBS漂洗4次，加入1 mg/mL的DAPI 1 mL，室溫避光孵育5 min，PBS漂洗5次后加入PBS 500 μL，分別于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.6 qPCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)

將軟骨細(xì)胞4 × 104/mL接種于六孔板，分組干預(yù)8 h后PBS漂洗3次，加600 μL裂解/結(jié)合緩沖液(lysis/binding buffer)，反復(fù)吹打后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心(EP)管，加入60 μL miRNA勻漿液添加劑(microRNA homogenate additive)，混勻。加入苯酚-氯仿(體積比5∶1)溶液600 μL，混勻。室溫下以1 000 rpm離心5 min，將上層水相移入新EP管，加入上層水相體積1/3的100%乙醇，混勻。轉(zhuǎn)移至帶有濾筒的1.5 mL EP管，以10 000 rpm離心15 s，濾液中加入500 μL洗滌液(wash solution)，混勻。轉(zhuǎn)移至帶有濾筒的1.5 mL EP管，室溫下以10 000 rpm離心15 s。棄濾液，濾膜中央加50 μL洗滌液洗脫，檢測(cè)miRNA濃度。將提取的miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按熒光定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 各組軟骨細(xì)胞MMP-3和ADAMTS4表達(dá)

在激光掃描共聚焦顯微鏡下，MMP-3、ADAMTS4陽(yáng)性可見(jiàn)綠色熒光。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察干預(yù)后各組軟骨細(xì)胞MMP-3可見(jiàn)，空白組微量綠色熒光，模型組綠色熒光亮度明顯較強(qiáng)，透骨消痛膠囊組綠色熒光亮度稍低(圖2a～c)。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察干預(yù)后各組軟骨細(xì)胞ADAMTS4，各組軟骨細(xì)胞均可見(jiàn)綠色熒光，其中模型組綠色熒光亮度最強(qiáng)，空白組、透骨消痛膠囊組綠色熒光亮度稍低(圖2d～f)。Image J分析各組平均光密度，結(jié)果顯示模型組MMP-3表達(dá)高于空白組(P<0.05)且ADAMTS4表達(dá)明顯高于空白組(P<0.01)；透骨消痛膠囊組MMP-3表達(dá)低于模型組(P<0.05)且ADAMTS4表達(dá)明顯低于模型組(P<0.01)(圖2g、h)。

2.2 各組軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)

模型組軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)量低于空白組(P<0.05)；透骨消痛膠囊組軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)量高于模型組(P<0.05)；空白組與透骨消痛膠囊組軟骨細(xì)胞miRNA表達(dá)量之間未見(jiàn)明顯差異(圖3)。

3 討論

炎癥介導(dǎo)的軟骨穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致的軟骨退變是OA主要病理改變[7-8]。OA時(shí)，IL-1β可促進(jìn)一氧化氮(NO)、MMP、ADAMTS等炎性因子產(chǎn)生，加速軟骨基質(zhì)降解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞[9]。因此，本研究采用LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分泌IL-1β建立體外炎癥軟骨細(xì)胞模型，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用10 ng/mL LPS誘導(dǎo)8 h后軟骨細(xì)胞可大量分泌IL-1β。

圖2 各組軟骨細(xì)胞MMP-3、ADAMTS4表達(dá)情況(×200) a.空白組軟骨細(xì)胞MMP-3表達(dá)情況 b. 模型組軟骨細(xì)胞MMP-3表達(dá)情況 c. 透骨消痛膠囊組軟骨細(xì)胞MMP-3表達(dá)情況 d. 空白組軟骨細(xì)胞ADAMTS4表達(dá)情況 e. 模型組軟骨細(xì)胞ADAMTS4表達(dá)情況 f. 透骨消痛膠囊組軟骨細(xì)胞ADAMTS4表達(dá)情況 g. 各組軟骨細(xì)胞MMP-3平均光密度統(tǒng)計(jì)分析 h. 各組軟骨細(xì)胞ADAMTS4平均光密度統(tǒng)計(jì)分析

注：★表示與空白組相比，P<0.05；☆表示與模型組相比，P<0.05；★★表示與空白組相比，P<0.01；☆☆表示與模型組相比，P<0.01

圖3 各組軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)情況

注：★表示與空白組相比，P<0.05；☆表示與模型組相比，P<0.05

MMP-3屬于MMP家族一員，具有降解多種膠原(包括Ⅱ型、Ⅹ型膠原等)及蛋白多糖的作用，同時(shí)還能促使其他MMP產(chǎn)生。關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3表達(dá)明顯升高，可加快軟骨退變病理進(jìn)程[10]。ADAMTS4具有降解聚蛋白多糖的作用[11]，在OA患者中表達(dá)量明顯升高[12]。本研究結(jié)果顯示，透骨消痛膠囊能降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞MMP-3、ADAMTS4表達(dá)，提示其具有降低炎性因子表達(dá)、抑制軟骨基質(zhì)降解、保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。

miRNA-140特異性表達(dá)于軟骨組織中，在維持軟骨穩(wěn)態(tài)、調(diào)控軟骨分化及維持軟骨細(xì)胞功能等方面具有重要作用[13]，OA患者miRNA-140表達(dá)明顯降低。miRNA-140高表達(dá)可顯著抑制IL-1β產(chǎn)生，同時(shí)IL-1β可抑制miRNA-140的表達(dá)[14]，這與本研究結(jié)果一致。研究[15]發(fā)現(xiàn)，miRNA-140對(duì)于ADAMTS5、MMP-13有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，可通過(guò)該作用維持關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)。炎性因子與miRNA-140之間存在互相調(diào)節(jié)的作用，但其機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，透骨消痛膠囊可升高LPS干預(yù)建立的炎癥軟骨細(xì)胞模型miRNA-140表達(dá)量。

綜上，透骨消痛膠囊能促進(jìn)miRNA-140表達(dá)，減少ADAMTS4、MMP-3分泌，抑制炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的軟骨基質(zhì)降解，從而延緩OA軟骨退變。

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(收稿：2016-07-30；修回：2016-09-05)

(本文編輯：李圓圓)

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Mechanism of Tougu Xiaotong capsule inhibits lipopolysaccharide-induced inflammation in chondrocytes

SHAO Xiang1, CHEN Hou-huang1, CHEN Da1, MA Yu-huan2, ZHENG Wen-wei2, YE Hong-zhi3, LI Xi-hai1.

LIXi-haiE-mail:lixihai79dahai@163.com

Objective To explore the mechanism of Tougu Xiaotong capsule (TXC) inhibiting lipopolysaccharide (LPS)-stimulated inflammation in chondrocytes. Methods The chondrocytes harvested from the knee joints of 4-week-old SD rats were cultured in vitro and divided into 3 groups: the sham group, model group and TXC group. The sham group was cultured in 2 mL low-glucose Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM/LOW) containing 10% fetal bovine serum (FBS); the model group was cultured in 2 mL DMEM/LOW containing 10% FBS and 10 ng/mL LPS; the TXC group was cultured in 2 mL DMEM/LOW containing 10% FBS, 10 ng/mL LPS and 300 μg/mL TXC. After chondrocytes being treated for 8 h, the microRNA (miRNA)-140 expression was detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR), and the expressions of a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS)4 and matrix metalloproteinase (MMP)-3 were observed by immunofluorescence staining, the average optical density of each group was analyzed by Image J. Results Compared with the sham group, the expression of MMP-3 (P<0.05) and ADAMTS4 (P<0.01) in the model group were significantly increased. Compared with the model group, the expression of MMP-3 (P<0.05)and ADAMTS4 (P<0.01) in the TXC group were significantly decreased. The expression of miRNA-140 in the model group was lower than that in the control group (P<0.01) and the TXC group (P<0.01). Conclusion TXC may delay the cartilage degeneration in osteoarthritis (OA) by promoting the expression of miRNA-140 to reduce the secretion of inflammatory cytokines such as ADAMTS4 and MMP-3 and thus inhibit the inflammation-mediated cartilage matrix degradation.

Chondrocyte; microRNA-140; Osteoarthritis; Matrix metalloproteinase-3; Inflammation

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81573998)、福建省自然科學(xué)基金(2016J01395) 、福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目(科技A類)優(yōu)秀人才(JA14150)

350122， 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院(邵翔、陳后煌、陳達(dá)、李西海)； 350122， 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(馬玉環(huán)、鄭文偉)； 350122， 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(葉蕻芝)

李西海 E-mail: lixihai79dahai@163.com

10.3969/j.issn.1673-7083.2016.06.014