李彥芹，崔海灝，李春青，宋瑞雪，陳亞軍

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北十里香酒業(yè)股份有限公司 工程技術(shù)研究中心，河北 泊頭 062150)

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耐酸酵母的分離鑒定及在丟糟發(fā)酵中的應(yīng)用

李彥芹1，崔海灝2，李春青1，宋瑞雪2，陳亞軍1

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北十里香酒業(yè)股份有限公司 工程技術(shù)研究中心，河北 泊頭 062150)

從白酒丟糟及酒醅中分離得到2株酵母菌YP2、YZ13，兩株菌均能在pH 3.0條件下正常生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定YP2為Candida屬，與Candidapseudolambica(KM384061.1)相似度98%；YZ13為Pichia屬，與Pichiakudriavzevii(LC014798.1)相似度100%.2株酵母(種子液體積比1∶1)應(yīng)用于丟糟發(fā)酵中，接種量100 mL/kg，在鮮丟糟870 g/kg、麩皮100 g/kg、硫酸銨15 g/kg、生石灰15 g/kg，28 ℃混合固態(tài)發(fā)酵60 h，丟糟(干樣)的真蛋白含量達(dá)172.30 g/kg，比發(fā)酵前丟糟(干樣)提高了28.29%，豐富了丟糟飼料蛋白，為丟糟發(fā)酵和高效飼料提供了依據(jù).

酵母菌；耐酸性；真蛋白

丟糟是白酒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物及主要污染物，丟糟中含有豐富的蛋白、淀粉、氨基酸及各種微量元素等，但因其生產(chǎn)工藝丟糟的酸度高、含水量高、易腐敗變質(zhì)，若不及時(shí)處理，必然會(huì)造成環(huán)境嚴(yán)重污染.許多企業(yè)將固態(tài)白酒丟糟直接用作飼料，但丟糟鮮飼料存在營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)缺陷及低消化利用率的缺點(diǎn)，同時(shí)儲(chǔ)存和運(yùn)輸難[1-2].酵母細(xì)胞含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素和脂肪等，白酒丟糟經(jīng)酵母發(fā)酵后具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且多數(shù)酵母具有特殊香味，通過酵母菌發(fā)酵代謝，可彌補(bǔ)改善丟糟鮮飼料缺陷，增強(qiáng)口感，提高白酒丟糟利用率，并且一定程度上利于牲畜消化吸收[3-4].

以白酒企業(yè)酒醅及丟糟為材料，分離得到2株耐酸酵母，應(yīng)用于白酒丟糟的發(fā)酵，為制備白酒丟糟蛋白飼料提供依據(jù)，為白酒產(chǎn)業(yè)循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展模式提供借鑒.

1 材料

1.1 酒醅和丟糟

白酒企業(yè)提供酒醅和丟糟.

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基[5]；YPD培養(yǎng)基[6]；丟糟固態(tài)培養(yǎng)基：以鮮丟糟為主要成分，適當(dāng)添加輔料.

2 方法

2.1 酵母菌的分離與純化

分別取10 g新鮮酒醅或丟糟于90 mL無菌生理鹽水中，搖床振蕩 30 min充分混勻，進(jìn)行系列稀釋，取一定量稀釋液均勻涂布于PDA固體培養(yǎng)基(pH 4.0)、YPD固體培養(yǎng)基(pH 4.0)、丟糟平板(pH 4.0，20 g/L干糟粉+15 g/L瓊脂粉配制)，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，出現(xiàn)單菌落，進(jìn)一步平板劃線純化得到純菌，PDA斜面保存?zhèn)溆?

2.2 酵母菌的鑒定

形態(tài)及生理生化鑒定方法參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行；酵母菌分子鑒定委托保定邁禾斯生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)試.

2.3 耐受性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 pH耐受實(shí)驗(yàn)

用乳酸調(diào)節(jié)YPD 液體培養(yǎng)基 pH 值分別為 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 、5.5、6.0，培養(yǎng) 2～3 d，觀察生長(zhǎng)差異.

2.3.2 耐高溫實(shí)驗(yàn)

YPD固體培養(yǎng)基，采用平板點(diǎn)種法，培養(yǎng)溫度設(shè)為25、30、35、40、45、50、55、60 ℃，培養(yǎng) 2～3 d，觀察生長(zhǎng)差異.

2.3.3 乙醇耐受實(shí)驗(yàn)

將滅菌后的 YPD 液體培養(yǎng)基，每L加入40、50、60、70、80、90、120、140、160、180 mL的無水乙醇接種培養(yǎng)，連續(xù)觀察1周.

2.3.4 耐鹽性

YPD 液體培養(yǎng)基，加入NaCl,使NaCl的質(zhì)量濃度分別為10、30、50、70、100、150、200 g/L，進(jìn)行接種培養(yǎng)，連續(xù)觀察1周.

2.3.5 耐糖性

用葡萄糖的質(zhì)量濃度為200、300、400、500、600 g/L的 YPD 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)觀察2周.

2.4 酵母菌在丟糟中的應(yīng)用

2.4.1 種子液的制備

酵母接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，再接種到50 mL三角瓶 20 mL PDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫?fù)u床(200 r/min)培養(yǎng)48 h用做種子液.

2.4.2 生石灰添加量對(duì)真蛋白含量的影響

純鮮酒糟作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，用生石灰調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH值，生石灰的添加量分別為0、5、10、15、20 g/kg，酵母菌(種子液體積比1∶1)按100 mL/kg的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵2 d后，測(cè)定其真蛋白的含量.

2.4.3 麩皮添加量對(duì)真蛋白含量的影響

在鮮酒糟加生石灰調(diào)節(jié)pH為最適作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，麩皮(麩皮的含水量與酒糟一致)添加量分別為40、60、80、100、120 g/kg，酵母菌(種子液體積比1∶1)按100 mL/kg的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵2 d后，測(cè)定其真蛋白的含量.

2.4.4 硫酸銨添加量對(duì)真蛋白含量的影響

在鮮酒糟添加適量麩皮、生石灰調(diào)節(jié)pH為最適條件下，硫酸銨添加量分別為5、10、15、20、25 g/kg，酵母菌(種子液體積比1∶1)按100 mL/kg的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵2 d后，測(cè)定其真蛋白的含量.

2.4.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)真蛋白含量的影響

在鮮酒糟添加適量麩皮、硫酸銨和生石灰調(diào)節(jié)pH為最適條件下，酵母菌(種子液體積比1∶1)按100 mL/kg的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵時(shí)間分別為24、36、48、60、72 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定其真蛋白的含量.

2.4.6 真蛋白的測(cè)定方法

取樣品1 g(濕重)加30 mL 體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡1 h，于4 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，將沉淀于60 ℃恒溫烘箱中烘至恒重，消化處理，利用微量凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算真蛋白含量[7-9].

3 結(jié)果與討論

3.1 酵母菌分離與鑒定

3.1.1 酵母菌的形態(tài)特征

經(jīng)稀釋涂布平板和平板劃線法得到2株酵母菌編號(hào)為YZ13、YP2.YZ13液體培養(yǎng)表面形成白色菌膜，個(gè)體呈橢圓、柱狀、管狀，多邊芽殖，大小(1.5～4.0) μm×(4.0～20) μm，YZ13菌落濕潤(rùn)，無光澤，中間有突起，形成假菌絲(圖1、2、3).YP2液體培養(yǎng)渾濁并有沉淀，個(gè)體圓形、橢圓，多邊芽殖，大小(2.0～3.5) μm×(2.0～7.0) μm，YP2菌落濕潤(rùn)，有光澤，中間突起，形成假菌絲(圖4、5、6).

圖1 YZ13 菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of YZ13(×12)

圖2 YZ13菌體形態(tài)Fig.2 Morphology of YZ13 cell(×1000)

圖3 YZ13 假菌絲Fig.3 Pseudomyceliaof YZ13(×100)

3.1.2 生理生化鑒定

氮源同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，碳源同化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果見表3.其他生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，YZ13 、YP2均不液化明膠，不形成類淀粉化合物.

圖4 YP2 菌落形態(tài)(5 d)Fig.4 Colony morphology of YP2(×12)

圖5 YP2 菌體形態(tài)Fig.5 Morphology of YP2 cell(×1000)

圖6 YP2 假菌絲Fig.6 Pseudomycelia of YP2(×100)

氮源YZ13YP2硫酸銨++尿素++硝酸鉀--

+陽性；-陰性.

表2 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

+發(fā)酵；-不發(fā)酵.

表3 碳源同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

+陽性;-陰性.

3.1.3 酵母菌的分子鑒定

酵母ITS DNA采用ITS1/ITS4引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，利用NCBI-Blast 軟件對(duì)酵母 ITS DNA序列進(jìn)行分析，YZ13與Pichiakudriavzevii(LC014798.1)相似度100%，YP2與Candidapseudolambica(KM384061.1)相似度98%(圖7).

圖7 2株酵母基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of two yeast strains YP2 and YZ13 based on rDNA-ITS sequences

3.2 酵母菌耐受性實(shí)驗(yàn)

酵母菌耐變性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4～8.YZ13與YP2菌株在pH 3.0以上均能正常生長(zhǎng)，YZ13對(duì)高溫、高糖、高鹽、高體積分?jǐn)?shù)乙醇有很好的耐受性，但因不同菌株之間營(yíng)養(yǎng)要求不同，代謝上互補(bǔ)，將2株菌混合應(yīng)用于丟糟發(fā)酵.

表4 耐酸性測(cè)定結(jié)果

表5 耐溫測(cè)定結(jié)果

+生長(zhǎng)一般；++生長(zhǎng)好；+++生長(zhǎng)較好； -不生長(zhǎng).

+生長(zhǎng)；-不生長(zhǎng).

表7 耐鹽測(cè)定結(jié)果

+生長(zhǎng)；-不生長(zhǎng).

表8 耐糖測(cè)定結(jié)果

+生長(zhǎng)；-不生長(zhǎng).

3.3 酵母菌在丟糟發(fā)酵中的應(yīng)用

3.3.1 生石灰添加量的影響

在鮮丟糟中生石灰添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、5、10、15、20 g/kg，28 ℃發(fā)酵2 d后測(cè)定其真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其結(jié)果見圖8.丟糟初始pH為2.5，隨生石灰添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高，生石灰添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)15 g/kg時(shí)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)168.10 g/kg，隨后又有所下降.生石灰添加15 g/kg時(shí)丟糟pH在6.0～6.5，有利于酵母菌的生長(zhǎng).

圖8 生石灰添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.8 Quicklime’s effect on mass fraction of true protein

3.3.2 麩皮添加量的影響

在鮮丟糟中添加麩皮分別為40、60、80、100、120 g/kg，生石灰調(diào)節(jié)pH為6.0，28 ℃發(fā)酵2 d后，測(cè)定其真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其結(jié)果見圖9.在麩皮添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 g/kg時(shí)，真蛋白達(dá)160.10 g/kg.

3.3.3 硫酸銨添加量的影響

在鮮丟糟中添加麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 g/kg，生石灰調(diào)節(jié)pH為6.0，硫酸銨添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5、10、15、20、25 g/kg，28 ℃發(fā)酵2 d，測(cè)定其真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其結(jié)果見圖10.

圖9 麩皮添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.9 Wheat bran’s effect on mass fraction of true protein

圖10 硫酸銨添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.10 Ammonia sulfate’s effect on mass fraction of true protein

硫酸銨添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15 g/kg時(shí)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,達(dá)166.10 g/kg.由于氮是組成蛋白質(zhì)的重要元素，所以氮源對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝有著重要的作用，微生物可以利用外來氮源自行合成所需的氨基酸，形成自身的菌體蛋白，從而提高真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù).

3.3.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

在鮮丟糟中麩皮添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 g/kg，生石灰調(diào)節(jié)pH為6.0，硫酸銨添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15 g/kg，發(fā)酵時(shí)間分別為24、36、48、60、72 h，測(cè)定其真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖11.

在發(fā)酵時(shí)間達(dá)60 h時(shí)真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)172.30 g/kg，60 h之后趨于穩(wěn)定并有衰減趨勢(shì).隨著發(fā)酵的進(jìn)行，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，菌體增值能力下降，有些菌體衰敗菌體自溶，所以后期出現(xiàn)微量的真蛋白衰減.

圖11 發(fā)酵時(shí)間對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.11 Fermentation time’s effect on mass fraction of true protein

4 結(jié)論

采用稀釋涂布和平板劃線法從白酒丟糟及酒醅中分離得到2株酵母菌YZ13、YP2，均能在pH 3.0條件下正常生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定YZ13為Pichia屬，與Pichiakudriavzevii(LC014798.1)相似度100%，YP2為Candida屬，與Candidapseudolambica(KM384061.1)相似度98%.YZ13耐酸、耐鹽、耐乙醇、耐糖、耐高溫均高于YP2.2株酵母混合應(yīng)用于丟糟發(fā)酵中，使丟糟(干樣)的真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)172.30 g/kg，比發(fā)酵前丟糟(干樣)提高了28.29%，豐富了丟糟飼料蛋白.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Separation and identification of acid proof yeast and its application in fermentation of waste fermenting grains

LI Yanqin1，CUI Haihao2，LI Chunqing1，SONG Ruixue2，CHEN Yajun1

(1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Research Center of Engineering Technology,Wine Company Limited Hebei Shilixiang，Botou 062150，China)

The two yeaststrainsYP2 and YZ13 were isolated from Chinese-spirit fermenting grains and they could all grow well under the condition of pH 3.0.Strain YP2 was identified as belonging toCandidaand the similarity degree of strain YP2 andCandidapseudolambica(KM384061.1) reached 98%，while strain YZ13 toPichiaand the similarity degree withPichiakudriavzevii(LC014798.1)reached 100%.The two strains were mixed at the ratio of 1∶1 in weight and applied to the fermentation of waste fermenting grains.The process of solid state fermentation lasted for 60 hours under the condition of inoculation quantity 100 mL/kg，fresh fermenting grains 870 g/kg，wheat bran 100 g/kg，ammonia sulfate 15 g/kg，quicklime 15 g/kg，temperature 28 ℃.The results showed that the protein content of the dry sample of waste fermenting grains reached 172.30 g/kg and increased by 28.29% and it enriched feed protein of waste fermenting grains and provided foundation for waste fermenting grains and high efficiency feed.

yeast；acid proof；true protein

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.05.011

2015-07-05

河北大學(xué)橫向課題(2016-01)

李彥芹(1965—)，女，河北滿城人，河北大學(xué)副教授，主要從事微生物和免疫學(xué)研究.E-mail:li13102929@126.com

X172;X797

A

1000-1565(2016)05-0517-07