李征途，李 莉，王玉濤，黎旭釗，李潤峰，李小波，楊子峰

(1. 呼吸疾病國家重點實驗室(廣州醫(yī)科大學(xué))/廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2. 陜西省榆林市第一醫(yī)院，陜西 榆林 719000；3. 廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東 廣州 510623)

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論 著

板藍根水提物體外抑制人H7N9禽流感病毒藥效研究

李征途1，李 莉2，王玉濤1，黎旭釗1，李潤峰1，李小波3，楊子峰1

(1. 呼吸疾病國家重點實驗室(廣州醫(yī)科大學(xué))/廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2. 陜西省榆林市第一醫(yī)院，陜西 榆林 719000；3. 廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東 廣州 510623)

目的 評價板藍根水提物體外抑制人H7N9禽流感病毒的藥效。方法 利用改良的方法提取純化板藍根水提物。在雞胚尿囊腔中擴增人H7N9禽流感病毒，以藥物毒性試驗(MTT法)檢測藥物的毒性，在狗腎細胞上種植人流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)和人H7N9禽流感病毒(A/Anhui/01/2013和A/Shanghai/01/2013)，采用細胞病變抑制法(CPE法)在治療作用策略下研究板藍根水提物在體外抑制人H7N9禽流感病毒的藥效。結(jié)果 板藍根水提物體外的半數(shù)有毒濃度(TC50)為>5 000 μg/mL。板藍根水提物在體外對于人流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)的IC50為2 500 μg/mL，選擇指數(shù)(SI)>2；對于人禽流感病毒H7N9(A/Anhui/01/2013)的IC50為5 000 μg/mL，SI>1；對于H7N9(A/Shanghai/01/2013)IC50為2 500 μg/mL，SI>2。板藍根水提物在體外能抑制人H7N9禽流感病毒，且對于H7N9(A/Shanghai/01/2013)毒株的抑制效果更佳。結(jié)論 板藍根水提物在體外能有效抑制人H7N9禽流感病毒，藥效和作用于人流感病毒藥效相當(dāng)。

板藍根水提物；人H7N9禽流感病毒；體外藥效

2013年3月在中國出現(xiàn)了新型的流感病毒感染人，這種新型的流感病毒被命名為A型人H7N9禽流感病毒[1]。人H7N9禽流感病毒感染人后可以引起嚴(yán)重的肺部疾病，甚至導(dǎo)致患者死亡[2]。面對突如其來的新型H7N9禽流感病毒感染人的事件，由于使用流感疫苗的時機有誤，所以主要的武器就是抗流感病毒藥物。目前臨床用于治療與預(yù)防流感的藥物主要有M2離子通道抑制劑(金剛脘胺、金剛乙胺)、神經(jīng)氨酸酶抑制劑(奧司他韋及扎那米韋等)[3]。但是隨著這些藥物的廣泛使用，不良反應(yīng)和藥物的耐藥性問題日益嚴(yán)重[4-9]，甚至出現(xiàn)了人H7N9禽流感病毒對神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥的報道[10]?？共《局委熑源嬖谝恍叶礇Q的問題，如高耐藥性、高不良反應(yīng)等，因此需要尋求新型的抗人H7N9禽流感病毒的藥物。面對新出現(xiàn)的禽流感病毒，中藥具有重要的研究價值和應(yīng)用潛力。而在眾多傳統(tǒng)中藥中，板藍根治療流感歷史悠久，長期以來已被廣泛用于防治呼吸道病毒性疾病。板藍根作為抗病毒、防流感的經(jīng)典品種，在1979—2010年的《中華人民共和國藥典》(以下簡稱藥典)中均有收錄，同時也是《國家基本藥物目錄》《醫(yī)保目錄》品種。2003年上半年“非典”時期，被全國防治非典型肺炎指揮部列入8大抗SARS病毒中成藥。本研究組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)板藍根的有效成分如水提物、多糖成分、木脂素化合物M4等均具有抗人流感病毒的作用[11-13]，日本也曾有報道糖蛋白和多糖為板藍根抗病毒成分之一。但是對于板藍根水提物能否抑制H7N9禽流感病毒仍是未知的，為了全面評價板藍根水提物對H7N9禽流感病毒的作用，本研究首次選擇了人流感病毒、H7N9禽流感病毒安徽株和上海株，觀察板藍根水提物體外抗H7N9禽流感病毒的藥效，旨在為進一步研究其抗H7N9禽流感病毒機制提供更多依據(jù)。

1 實驗資料

1.1 藥物 陽性對照藥：羧酸奧司他韋和帕拉米韋，購自上海羅氏制藥有限公司；實驗藥物：板藍根生藥材由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供，采自黑龍江大慶及安徽阜陽板藍根GAP基地，由中國科學(xué)院華南植物院葉華國研究員鑒定為菘藍Isatis infigotica Fort.的根，即板藍根。南板藍根提取成分由澳門科技大學(xué)提供。

1.2 細胞株 狗腎細胞(MDCK)引自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.3 病毒株 ①人流感病毒：流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)購自美國ATCC；②禽流感病毒H7N9(A/Anhui/01/2013， A/Shanghai/01/2013)由國家流感中心提供，保存于廣東省出入境檢驗檢疫局BSL-3實驗室(呼吸疾病國家重點實驗室高致病病原微生物研究室)。上述毒株流感病毒通過接種于9日齡的雞胚尿囊腔中擴增，35 ℃孵育2 d，收獲尿囊液。 用MDCK細胞滴定病毒，以細胞病變抑制法(CPE)判定這些毒株的半數(shù)感染量(TCID50/100 μL)作為病毒原始滴度。

1.4 主要試劑 二甲基亞砜(DMSO),美國SIGMA公司；MEM,美國GIBCO公司，批號：20140217；胎牛血清,美國GIBCO公司，批號：10099；10 mmol/L PBS，美國GIBCO公司,批號：20140122；1 mg/mL TPCK，廣州捷倍斯生物科技有限公司，批號：20140220 ；MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2],購自Genebase；Agar(低熔點瓊脂)，購自O(shè)XOID；DEAE(二乙氨乙基纖維素)，MP Biomedicals；結(jié)晶紫，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.5 板藍根水提物的制備和化學(xué)分析 參照文獻[13]方法進行板藍根水提物提取和化學(xué)分析，分離程序見圖1。

圖1 北板藍根水提取物的制備及初步分離流程圖

1.6 藥物毒性試驗(MTT法) 參照文獻[14]方法。按每孔約2.5×104MDCK細胞接種到96孔板，24 h后待細胞長成單層后，棄去培養(yǎng)液，加入不同稀釋度的相應(yīng)藥物100 μL/孔，空白對照和正常細胞對照孔加入100 μL/孔MEM，37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)36～48 h，每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，置37 ℃、5%CO2溫箱中繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加100 μL DMSO，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。按照下列公式計算抑制率，并用Reed-Muench法計算50%毒性濃度為藥物半數(shù)有毒濃度(TC50)。抑制率=[(正常組平均OD值-空白組平均OD值)-(給藥組平均OD值-空白組平均OD值)]/(正常組平均OD值-空白組平均OD值)×100%。

1.7 板藍根水提取物體外抗流感病毒活性試驗 以細胞病變抑制法 (Cytopathic Effect Reduction Method)在治療作用模式[11，15-16]下研究板藍根水提物對流感病毒的抑制作用。長滿單層的96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)的MDCK細胞吸附病毒2 h，同時設(shè)定陽性藥物和細胞對照，然后加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，置34 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h。細胞出現(xiàn)病變程度按以下6級標(biāo)準(zhǔn)記錄：(- )為細胞生長正常，無病變出現(xiàn)；(±)為細胞病變少于整個單層細胞的10%；(+)為細胞病變約占整個單層細胞的25%；()為細胞病變約占整個單層細胞的50%；()為細胞病變約占整個單層細胞的75%：()為細胞病變占整個單層細胞的75%以上。用Reed-Muench法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)，并以選擇指數(shù)SI表示(SI=TC50/IC50),SI>2表示低毒高效,SI 1～2表示高毒低效,SI<1表示無效。

2 結(jié) 果

2.1 板藍根水提物藥物毒性的檢測 MTT法體外檢測北板藍根水提物的半數(shù)有毒濃度(TC50)為>5 000 μg/mL。

2.2 板藍根水提物藥效 板藍根水提物對人流感H1N1(A/PR/8/34)有較好的體外抑制作用，IC50為2 500 μg/mL，SI>2，但和化學(xué)藥物羧酸奧司他韋和帕拉米韋有一定差距。板藍根水提物對人H7N9禽流感病毒也表現(xiàn)出較好的體外抗病毒藥效，相對于抗安徽H7N9毒株的藥效，其抗上海H7N9毒株的藥效更佳，和抗人流感H1N1的效果相當(dāng)，但和化學(xué)藥物藥效有一定差距。見表1。

表1 板藍根水提物抑制人H7N9禽流感病毒的藥效

3 討 論

2013年在中國爆發(fā)的人感染H7N9禽流感病毒疫情已成為全球關(guān)注的健康問題，H7N9病毒感染人后除了引起死亡外，也可以導(dǎo)致輕癥的流感癥狀[17]。目前臨床上用于治療人感染H7N9禽流感病毒的藥物為神經(jīng)氨酸酶抑制劑，但是對于抗H7N9病毒的化學(xué)藥物存在可選擇性少、易產(chǎn)生耐藥性及不良反應(yīng)明顯等問題，因此抗禽流感病毒藥物的新藥研發(fā)已成為臨床急需解決的重要問題。傳統(tǒng)中草藥在我國長期應(yīng)用于呼吸道感染性疾病的防治，且取得了較好效果，也為抗流感藥物研發(fā)提供了寶貴的線索和資源。傳統(tǒng)治療感冒的中藥作用機制和靶點與現(xiàn)有化學(xué)藥物不同，因此從中草藥中挖掘新型抗病毒藥物對于解決化學(xué)藥物長期應(yīng)用引起的耐藥性和不良反應(yīng)問題提供了一個新選擇。眾多傳統(tǒng)中藥中，板藍根對流感病毒等病毒性疾病均有一定療效。鄧甘霖[18]報道較大劑量復(fù)方板藍根治療急性咽炎安全有效。本研究組早期已經(jīng)證明板藍根水提物在體外具有抑制多種流感亞型病毒株以及禽流感病毒株(如H6N2，H7N3，H9N2)的作用[13]，而H9N2亞型曾有感染人類的報道[19]；板藍根水提物進一步純化的產(chǎn)物G2(多糖)在體外對多種亞型的甲型流感及乙型流感病毒均有抑制作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)板藍根水提物對H7N9禽流感病毒具有體外抑制作用，其對于上海H7N9禽流感病毒株的抑制作用和其抑制人流感病毒H1N1(A/PR/8/34)的效果相當(dāng)，對于安徽H7N9禽流感病毒株的抑制作用略差，這可能與不同病毒間存在差異以及與板藍根水提物抑制H7N9禽流感病毒的機制有關(guān)，具體機制有待進一步研究證實。板藍根水提物在體外抑制人流感病毒和禽流感病毒藥效間的差異，可能與人流感病毒和禽流感病毒結(jié)合的受體(唾液酸受體；人流感病毒結(jié)合α2-6受體，禽流感病毒結(jié)合α2-3受體)以及人流感病毒和禽流感病毒的血凝素(HA)結(jié)構(gòu)存在差異有關(guān)。

本實驗存在的不足之處是缺乏板藍根水提物抑制H7N9禽流感病毒機制的研究，但是筆者之前的研究已經(jīng)表明板藍根水提物以及板藍根水提物的純化物G2在體外抑制多種亞型流感病毒是通過抑制流感病毒HA，阻斷病毒吸附，從而抑制病毒的進一步復(fù)制而起作用[12-13]，推測這可能也是板藍根水提物體外抑制H7N9禽流感病毒的作用機制，但是有待進一步實驗研究證實。這也可以解釋因為板藍根水提物作用于HA，而H7N9禽流感病毒間以及H7N9 禽流感病毒和人流感病毒間存在HA的差異，造成S-03在不同的H7N9禽流感病毒以及人流感病毒和H7N9禽流感病毒間存在抑制效果的差異。HA是H7N9禽流感病毒與宿主細胞間結(jié)合的橋梁，而板藍根水提物對HA存在抑制作用，可以阻斷H7N9禽流感病毒和人細胞間的吸附，有利于治療H7N9禽流感病毒導(dǎo)致的疾病。

綜上所述，板藍根水提物在體外具有抑制不同H7N9禽流感病毒的作用，可能的機制是通過抑制H7N9禽流感病毒的HA，阻斷H7N9禽流感病毒與宿主細胞的吸附，從而抑制病毒侵入宿主細胞而起作用，但是需要進一步研究確認(rèn)。中藥板藍根的成分復(fù)雜，在治療時不同的組分可以發(fā)揮不同的作用。板藍根水提物為板藍根的粗提取物，其成分為總多糖，但是也不排除板藍根中存在其他組分具有抗H7N9禽流感病毒作用，因此進一步研究板藍根物質(zhì)構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)更多的抑制H7N9禽流感病毒成分是必要的。筆者下一階段將開展板藍根水提物在小鼠體內(nèi)抗H7N9禽流感病毒藥效研究以及不同成分聯(lián)合用藥抗H7N9禽流感病毒的深入研究。

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Study on pharmacology of water extraction of radix isatidis in the inhibition of H7N9 avian influnza virus in vitro

LI Zhengtu1, LI Li2, WANG Yutao1, LI Xuzhao1, LI Runfeng1, LI Xiaobo3, YANG Zifeng1

(1.Guangzhou Medical University/The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, Guangdong, China; 2.The First Hospital of Yulin, Yulin 719000, Shaanxi, China; 3.Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510623, Guangdong, China)

Objective It is to observe the inhibition effect of water extraction of radix isatidis on H7N9 avian influnza virus in vitro.Methods Purification water extraction of radix isatidis were extracted by modified method. Human H7N9 avian influnza viruses were amplificated in chick embryo allantoic cavity,and their toxicity was detected by MMT method. Human influenza virus PR8(A/PR/8/34, H1N1) and human H7N9 avian influnza virus(A/Anhui/01/2013, H7N9) and (A/Shanghai/01/2013, H7N9) were planted in dog renal cells. Then the pharmacology of water extraction of radix isatidis in the inhibition of H7N9 avian influnza virus in vitro was studied by CPE method under strategy of the treatment. Results Half toxic concentration (TC50) of water extraction of radix isatidis in vitro was 5 000 μg/mL, IC50of human influenza virus PR8(A/PR/8/34, H1N1) was 2 500 μg/mL, selective index (SI)>2；IC50of human H7N9 avian influnza virus(A/Anhui/01/2013, H7N9) was 5 000 μg/mL, SI>1; IC50of human H7N9 avian influnza virus(A/Shanghai/01/2013, H7N9) was 5 000 μg/mL, SI>1. Chemical analysis showed that the main component of water extraction of radix isatidis was polysaccharide, nucleoside compounds and many kinds of amino acid also could be found. Water extraction of radix isatidis could inhibit H7N9 avian influnza virus in vitro, and the inhibition for H7N9 avian influnza virus(A/Shanghai/01/2013, H7N9) was the best. Conclusion Water extraction of radix isatidis could effectively inhibit H7N9 avian influnza virus in vitro, and the effect was similar to that for human influenza virus.

Water extraction of radix isatidis; human H7N9 avian influnza virus; pharmacology in vitro

李征途，男，博士，住院醫(yī)師，從事臨床病毒學(xué)相關(guān)研究工作。

楊子峰，E-mail：jeffyah@163.com

廣東省科技廳社會發(fā)展領(lǐng)域項目(2013B020224006)；廣州市科技計劃項目-科技惠民專項(2014Y2-00031)；廣東省對外合作專項課題(2013B051000085)；國家自然科學(xué)基金廣東聯(lián)合基金資助項目(U1201227)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.35.001

R-33

A

1008-8849(2016)35-3877-04

2016-03-20