楊陽(yáng)，楊晴，賈友超，李小芳，楊華，張倩，彭鑫宇，臧愛(ài)民△

miR-486、miR-499在肺癌患者血漿中的表達(dá)及臨床價(jià)值

楊陽(yáng)1，2，楊晴3，賈友超2，李小芳2，楊華2，張倩2，彭鑫宇4，臧愛(ài)民2△

目的探討miR-486和miR-499在肺癌患者血漿中的表達(dá)及臨床意義，分析其在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC）中表達(dá)的差異。方法收集35例肺癌患者（其中NSCLC組21例，SCLC組14例）及30例健康者（對(duì)照組）血樣標(biāo)本，運(yùn)用qPCR的方法測(cè)定各組血漿miR-486、miR-499的表達(dá)量，分析NSCLC和SCLC患者血漿中miR-486和miR-499的表達(dá)量與各臨床特征的關(guān)系。對(duì)所有入組者血漿miRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行ROC曲線分析，計(jì)算曲線下面積（AUC）、最佳臨界值及其敏感度和特異度。結(jié)果NSCLC和SCLC組中血漿miR-486、miR-499的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組（P＜0.05）。NSCLC組血漿miR-486在不同臨床特征患者間表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而TNM分期越晚、分化程度越低，miR-499表達(dá)越低（P＜0.05）。SCLC組分期越晚，miR-486表達(dá)越低；而miR-499在不同臨床特征患者間表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-486診斷肺癌的AUC為0.83（95%CI為0.73～0.93），敏感度和特異度分別為90.0%和68.6%，最佳診斷界值為1.02；miR-499診斷肺癌的AUC為0.75（95%CI為0.62～0.88），敏感度和特異度分別為60.0%和94.3%，對(duì)肺癌的最佳診斷界值為0.32。結(jié)論血漿miR-486、miR-499在肺癌患者中表達(dá)下調(diào)，可能預(yù)示預(yù)后不良，有望作為肺癌潛在篩查及預(yù)后的指標(biāo)。

癌，非小細(xì)胞肺；微RNAs；血漿；敏感性與特異性；診斷，鑒別；miR-486；miR-499

近些年來(lái)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率不斷攀升，2015年我國(guó)新患惡性腫瘤人數(shù)有42 924 292例，因惡性腫瘤死亡人數(shù)達(dá)2 814 000例，其中肺癌的發(fā)病率和死亡率高居首位［1］。研究顯示，2/3的肺癌患者確診時(shí)往往已經(jīng)是晚期，由于缺少有效的治療方法，5年生存率只有15%左右［2］。因此，迫切需要找到早期診斷肺癌的有效方法。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小分子RNA，能調(diào)節(jié)特定的信使RNA，在肺癌組織及外周循環(huán)中miRNA的表達(dá)不但參與肺癌發(fā)生、發(fā)展，而且還與疾病的診斷、分期、進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)［3］。血漿中的miRNA無(wú)論在體內(nèi)和體外都以一種穩(wěn)定狀態(tài)存在，不容易受到體內(nèi)內(nèi)源性核糖核酸酶及體外強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫環(huán)境的影響，具備了作為潛在腫瘤標(biāo)志物的基本條件［4-5］。有研究證實(shí)血漿中miR-486-5-p可能發(fā)揮腫瘤抑制作用，可能作為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）診斷、治療、預(yù)后評(píng)判的潛在指標(biāo)［6］。NSCLC血漿中miR-499的表達(dá)可能參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。在應(yīng)用抗腫瘤化療藥物的過(guò)程中，血漿中miR-499還可能參與調(diào)節(jié)某些腫瘤相關(guān)基因，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸、入侵及轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致預(yù)后不良［7］。既往大多數(shù)研究關(guān)注的熱點(diǎn)集中在NSCLC的血漿中miRNA的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析NSCLC、小細(xì)胞肺癌（SCLC）患者血漿中miR-486、miR-499的表達(dá)情況，探討其作為抑癌基因的作用，為肺癌診斷及預(yù)后判斷提供新的思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2014年1月—2015年1月河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治的肺癌患者35例，以2004年版WHO肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，經(jīng)支氣管鏡或者肺腫物穿刺病理結(jié)果證實(shí)為肺惡性腫瘤。35例中NSCLC 21例（NSCLC組），其中腺癌14例、鱗癌7例；SCLC 14例（SCLC組）。NSCLC組男12例，女9例，年齡≤60歲者12例，吸煙者10例。SCLC組男11例，女3例，年齡≤60歲者5例，吸煙者10例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）姓名、年齡、性別、吸煙史、家族史等個(gè)人資料完整。（2）入院前從未接受放療、化療或其他針對(duì)腫瘤的治療。另取常規(guī)體檢人群30例為對(duì)照組，既往均無(wú)任何腫瘤病史，其中男16例，女14例，年齡≤60歲者14例，吸煙者14例。3組性別（χ2=2.693）、年齡≤60歲（χ2=1.570）、吸煙（χ2=2.619）構(gòu)成差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有入組者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑實(shí)時(shí)熒光PCR儀（美國(guó)Bio-Rad，CFX96）；高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo CENTRIFUGE PK 121R）、移液器（Eppendorf）；漩渦振蕩器、干浴恒溫器（江蘇其林貝爾）；通風(fēng)櫥、凍存盒（Invitrogen）；-80℃冰箱（Thermo）；miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control 10 pmol（德國(guó)QIAgen，貨號(hào)：219610）；RNase-free水（碧云天）、無(wú)水乙醇（廣州化學(xué)試劑廠）；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection kit（美國(guó)GeneCopoeia公司）。

1.3 血液標(biāo)本的收集與儲(chǔ)存用EDTA抗凝管收集各組患者外周血5 mL，于4℃、2 000 r/min離心10 min，將分離得到的上層血漿2 h內(nèi)分裝至EP管中置于-80℃長(zhǎng)期保存。

1.4 熒光定量PCR法檢測(cè)miR-499和miR-486的表達(dá)水平解凍血漿樣本，于離心管中按照200 μL血漿加入1 000 μL QIAzol Lysis Reagent裂解液（1∶5）裂解樣品。按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。檢測(cè)RNA濃度、純度，由于血漿樣本中的RNA為游離的RNA，RNA含量較低，無(wú)法通過(guò)電泳法得到證實(shí)，本研究?jī)H通過(guò)qPCR結(jié)果來(lái)判定。按試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄引物序列見(jiàn)表1。miRNA熒光定量檢測(cè)：采用熒光定量PCR法檢測(cè)miR-499和miR-486在各組血漿樣本中的表達(dá)水平。miR-499、miR-486及cel-39mimic（內(nèi)參）的上下游引物均購(gòu)自廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心。qPCR檢測(cè)反應(yīng)液的配制：10 μL 2×All-in-One qPCR Mix；2 μL qPCR Forward Primer（2 μmol/L）；1 μL Universal PCR primer（2 μmol/L）；2 μL First strand cDNA；5 μL ddH2O。qPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min，循環(huán)1次；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行熔解曲線分析。每個(gè)組織樣本做3次平行試驗(yàn)，采用2-ΔΔCt來(lái)分析miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1Primer sequences of reverse transcrption表1 逆轉(zhuǎn)錄引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，不符合正態(tài)分布的用M（P25，P75）描述。非正態(tài)分布的計(jì)量資料2組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。利用ROC曲線分析miR-486和miR-499表達(dá)量診斷肺癌最佳臨界值、敏感度與特異度。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-486、miR-499表達(dá)水平比較NSCLC組和SCLC組中miR-486、miR-499表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P＜0.05），SCLC組與NSCLC組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

Tab.2Comparison of relative expression levels of miR-486 and miR-499 between three groups表2 各組miR-486、miR-499的相對(duì)表達(dá)水平比較M（P25，P75）

2.2 NSCLC組miR-486和miR-499的相對(duì)表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系NSCLC組血漿miR-486在不同臨床特征間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而TNM分期越晚、分化程度越低，miR-499表達(dá)越低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

Tab.3Relationship between plasma expression levels of miR-486 and miR-499 with clinical features in NSCLC group表3 NSCLC組血漿中miR-486、miR-499的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系M（P25，P75）

2.3 SCLC組miR-486和miR-499的相對(duì)表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系SCLC組血漿miR-486在腫瘤局限期和廣泛期間表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即分期越廣泛miR-486表達(dá)越低；而miR-499在不同臨床特征間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

Tab.4Relationship between plasma expression levels of miR-486 and miR-499 with clinical features in the SCLC group表4 SCLC組血漿中miR-486、miR-499的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系M（P25，P75）

2.4 miR-486和miR-499的相對(duì)表達(dá)量對(duì)肺癌的診斷價(jià)值ROC曲線顯示，miR-486診斷肺癌的曲線下面積（AUC）為0.83（95%CI：0.73～0.93），敏感度和特異度分別為90.0%和68.6%，最佳診斷界值為1.02；miR-499診斷肺癌的AUC為0.75（95%CI：0.62～0.88），敏感度和特異度分別為60.0%和94.3%，對(duì)肺癌的最佳診斷界值為0.32，見(jiàn)圖1。。

Fig.1ROC curves of relative plasma expressions of miR-486 and miR-499 in the diagnostic value of lung cancer圖1 血漿中miR-486和miR-499相對(duì)表達(dá)量對(duì)肺癌診斷價(jià)值的ROC曲線

3 討論

miRNAs是一類高度保守、長(zhǎng)度很短的非編碼調(diào)控單鏈RNA，長(zhǎng)度約19～25 nt，其廣泛存在于真核生物體內(nèi)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、外侵轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)歸預(yù)后等多個(gè)環(huán)節(jié)［8］。Croce實(shí)驗(yàn)室研究顯示，超過(guò)半數(shù)的miRNA基因存在于腫瘤相關(guān)基因中，miR-15a、miR-16a在慢性淋巴細(xì)胞白血病標(biāo)本中表達(dá)缺失或下調(diào)［9］。有研究認(rèn)為，miR-21、miR-210、miR-126、miR-486可以作為診斷NSCLC的參考指標(biāo)［10］。Hu等［11］研究證實(shí)，NSCLC患者共有11種miRNA的表達(dá)量較正常情況下上調(diào)5倍之多，其中miR-1、miR-499、miR-486、miR-30d與NSCLC總生存率相關(guān)，有望作為NSCLC患者的預(yù)后指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC組和SCLC組血漿中miR-486表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，與既往研究結(jié)果基本一致［10-11］，且ROC曲線示miR-486診斷肺癌的AUC為0.83，接近0.90，具有中等診斷效率，提示血漿中miRNA-486表達(dá)水平的高低可能成為肺癌的非侵入性生物標(biāo)志物，可用于肺癌早期檢測(cè)。NSCLC組血漿miR-486在不同臨床特征間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在SCLC組中分期越晚，miR-486表達(dá)越低，提示miR-486可能是SCLC預(yù)后的影響因素。

目前，有關(guān)血漿miR-499的研究通常集中在心肌損傷和心肌梗死之間的關(guān)聯(lián)［12］。急性心肌梗死患者血漿中miR-499低表達(dá)，預(yù)示其可能成為早期檢測(cè)心肌損傷的生物標(biāo)志物［12］。Donaldson等［13］研究發(fā)現(xiàn)，血漿miR-499在慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者中明顯升高。Vinci等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-499在NSCLC組和對(duì)照組中表達(dá)差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；本研究結(jié)果顯示，血漿miR-499在NSCLC和SCLC患者中表達(dá)水平均低于對(duì)照組，與Vinci等［14］學(xué)者的研究結(jié)論不完全相同，考慮可能與血漿中miR-499含量偏低，樣本量小及操作者的技術(shù)水平有關(guān)，需要大規(guī)模前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。NSCLC患者的TNM分期越晚、分化程度越低，miR-499表達(dá)越低，與既往研究結(jié)果類似［7,14］，提示血漿miR-499有可能作為NSCLC預(yù)后的生物標(biāo)志物。

綜上所述，血漿miR-486、miR-489在肺癌患者中表達(dá)下調(diào)，均有可能與肺癌的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)，有望作為肺癌潛在篩查及預(yù)后指標(biāo)。但是本研究樣本量較小、血漿中的miRNA的量較少，定量PCR的準(zhǔn)確性可能降低，這2個(gè)miRNA是否為肺癌特異來(lái)源尚有待確定。

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（2016-06-12收稿2016-09-19修回）

（本文編輯陸榮展）

The expression and clinical significance of plasma miR-486 and miR-499 in patients with lung cancer

YANG Yang1,2,YANG Qing3,JIA Youchao2,LI Xiaofang2,YANG Hua2,ZHANG Qian2,PENG Xinyu4,ZANG Aimin2△
1 Hebei University,Baoding 071002,China;2 Hebei Key Laboratory of Cancer Radiotherapy and Chemotherapy,Department of Medical Oncology,the Affiliated Hospital of Hebei University;3 Department of Blood Transfusion, 4 Department of Hepatobiliary Surgery,the Affiliated Hospital of Hebei University△

ObjectiveTo explore the expression levels of miR-486 and miR-499 in the plasma of lung cancer patients,and analyze their expression differences in non-small cell lung cancer(NSCLC)and small cell lung cancer(SCLC). MethodsBlood samples were collected in 35 patients with lung cancer(21 NSCLC and 14 SCLC)and 30 healthy persons (control group).The real-time quantitative PCR was used to detect the expression levels of plasma miR-486 and miR-499 in two groups.The plasma levels of miRNA-486 and miRNA-499 and their correlation with various clinical features in NSCLC and SCLC patients were analyzed.The receiver operating characteristic curves（ROC）of miRNA expressions were analyzed.The area under a curve（AUC）,threshold and the sensitivity and specificity were calculated.ResultsThe expression levels of miR-486 and miR-499 were significantly lower in NSCLC and SCLC groups than those of the control group（P＜0.05).There were no significant differences in the expression of miR-486 between different clinical features in NSCLC group.For the late cancer TNM staging,the tumor differentiation was lower,and the miR-499 expression level was lower(P＜0.05).In SCLC group,for the late cancer staging,there was a lower expression level of miR-486.There were no significant differences in the expressions of miR-499 between different clinical features.The miRNA-486 AUC in the diagnosis of lung cancer was 0.83(95%CI:0.73-0.93),the sensitivity and specialty rates were 90.0%and 68.6% respectively,and the best diagnostic value was 1.02.The miRNA-499 AUC in the diagnosis of lung cancer was 0.75(95% CI:0.62-0.88),the sensitivity and specialty rates were 60.0%and 94.3%respectively,and the best diagnostic boundary value was 0.18 for lung cancer.ConclusionThe plasma expression levels of miR-499 and miR-486 are down-regulated in lung cancer patients,which suggest a poor prognosis and can be used as potential screening and prognostic indicators forlung cancer.

carcinoma,non-small-cell lung；microRNAs；plasma；sensitivity and specificity；diagnosis,differential；miR-486；miR-499

R734.2

A

10.11958/20160528

2015年河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才項(xiàng)目（361007）

1河北大學(xué)（郵編071002）；2河北省放化療機(jī)制與規(guī)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；3輸血科，4肝膽外科

楊陽(yáng)（1985），男，碩士在讀，主要從事肺癌分子生物學(xué)研究

△通訊作者E-mail:booszam@sina.com