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        miR-486、miR-499在肺癌患者血漿中的表達(dá)及臨床價(jià)值

        2016-12-15 03:36:14楊陽(yáng)楊晴賈友超李小芳楊華張倩彭鑫宇臧愛(ài)民
        天津醫(yī)藥 2016年11期
        關(guān)鍵詞:血漿肺癌差異

        楊陽(yáng),楊晴,賈友超,李小芳,楊華,張倩,彭鑫宇,臧愛(ài)民△

        miR-486、miR-499在肺癌患者血漿中的表達(dá)及臨床價(jià)值

        楊陽(yáng)1,2,楊晴3,賈友超2,李小芳2,楊華2,張倩2,彭鑫宇4,臧愛(ài)民2△

        目的探討miR-486和miR-499在肺癌患者血漿中的表達(dá)及臨床意義,分析其在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)中表達(dá)的差異。方法收集35例肺癌患者(其中NSCLC組21例,SCLC組14例)及30例健康者(對(duì)照組)血樣標(biāo)本,運(yùn)用qPCR的方法測(cè)定各組血漿miR-486、miR-499的表達(dá)量,分析NSCLC和SCLC患者血漿中miR-486和miR-499的表達(dá)量與各臨床特征的關(guān)系。對(duì)所有入組者血漿miRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行ROC曲線分析,計(jì)算曲線下面積(AUC)、最佳臨界值及其敏感度和特異度。結(jié)果NSCLC和SCLC組中血漿miR-486、miR-499的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P<0.05)。NSCLC組血漿miR-486在不同臨床特征患者間表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而TNM分期越晚、分化程度越低,miR-499表達(dá)越低(P<0.05)。SCLC組分期越晚,miR-486表達(dá)越低;而miR-499在不同臨床特征患者間表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-486診斷肺癌的AUC為0.83(95%CI為0.73~0.93),敏感度和特異度分別為90.0%和68.6%,最佳診斷界值為1.02;miR-499診斷肺癌的AUC為0.75(95%CI為0.62~0.88),敏感度和特異度分別為60.0%和94.3%,對(duì)肺癌的最佳診斷界值為0.32。結(jié)論血漿miR-486、miR-499在肺癌患者中表達(dá)下調(diào),可能預(yù)示預(yù)后不良,有望作為肺癌潛在篩查及預(yù)后的指標(biāo)。

        癌,非小細(xì)胞肺;微RNAs;血漿;敏感性與特異性;診斷,鑒別;miR-486;miR-499

        近些年來(lái)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率不斷攀升,2015年我國(guó)新患惡性腫瘤人數(shù)有42 924 292例,因惡性腫瘤死亡人數(shù)達(dá)2 814 000例,其中肺癌的發(fā)病率和死亡率高居首位[1]。研究顯示,2/3的肺癌患者確診時(shí)往往已經(jīng)是晚期,由于缺少有效的治療方法,5年生存率只有15%左右[2]。因此,迫切需要找到早期診斷肺癌的有效方法。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種小分子RNA,能調(diào)節(jié)特定的信使RNA,在肺癌組織及外周循環(huán)中miRNA的表達(dá)不但參與肺癌發(fā)生、發(fā)展,而且還與疾病的診斷、分期、進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[3]。血漿中的miRNA無(wú)論在體內(nèi)和體外都以一種穩(wěn)定狀態(tài)存在,不容易受到體內(nèi)內(nèi)源性核糖核酸酶及體外強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫環(huán)境的影響,具備了作為潛在腫瘤標(biāo)志物的基本條件[4-5]。有研究證實(shí)血漿中miR-486-5-p可能發(fā)揮腫瘤抑制作用,可能作為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)診斷、治療、預(yù)后評(píng)判的潛在指標(biāo)[6]。NSCLC血漿中miR-499的表達(dá)可能參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。在應(yīng)用抗腫瘤化療藥物的過(guò)程中,血漿中miR-499還可能參與調(diào)節(jié)某些腫瘤相關(guān)基因,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸、入侵及轉(zhuǎn)移,最終導(dǎo)致預(yù)后不良[7]。既往大多數(shù)研究關(guān)注的熱點(diǎn)集中在NSCLC的血漿中miRNA的表達(dá)情況,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析NSCLC、小細(xì)胞肺癌(SCLC)患者血漿中miR-486、miR-499的表達(dá)情況,探討其作為抑癌基因的作用,為肺癌診斷及預(yù)后判斷提供新的思路。

        1 對(duì)象與方法

        1.1 研究對(duì)象選取2014年1月—2015年1月河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治的肺癌患者35例,以2004年版WHO肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù),經(jīng)支氣管鏡或者肺腫物穿刺病理結(jié)果證實(shí)為肺惡性腫瘤。35例中NSCLC 21例(NSCLC組),其中腺癌14例、鱗癌7例;SCLC 14例(SCLC組)。NSCLC組男12例,女9例,年齡≤60歲者12例,吸煙者10例。SCLC組男11例,女3例,年齡≤60歲者5例,吸煙者10例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)姓名、年齡、性別、吸煙史、家族史等個(gè)人資料完整。(2)入院前從未接受放療、化療或其他針對(duì)腫瘤的治療。另取常規(guī)體檢人群30例為對(duì)照組,既往均無(wú)任何腫瘤病史,其中男16例,女14例,年齡≤60歲者14例,吸煙者14例。3組性別(χ2=2.693)、年齡≤60歲(χ2=1.570)、吸煙(χ2=2.619)構(gòu)成差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有入組者均簽署知情同意書(shū),并經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

        1.2 主要儀器與試劑實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國(guó)Bio-Rad,CFX96);高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo CENTRIFUGE PK 121R)、移液器(Eppendorf);漩渦振蕩器、干浴恒溫器(江蘇其林貝爾);通風(fēng)櫥、凍存盒(Invitrogen);-80℃冰箱(Thermo);miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control 10 pmol(德國(guó)QIAgen,貨號(hào):219610);RNase-free水(碧云天)、無(wú)水乙醇(廣州化學(xué)試劑廠);All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection kit(美國(guó)GeneCopoeia公司)。

        1.3 血液標(biāo)本的收集與儲(chǔ)存用EDTA抗凝管收集各組患者外周血5 mL,于4℃、2 000 r/min離心10 min,將分離得到的上層血漿2 h內(nèi)分裝至EP管中置于-80℃長(zhǎng)期保存。

        1.4 熒光定量PCR法檢測(cè)miR-499和miR-486的表達(dá)水平解凍血漿樣本,于離心管中按照200 μL血漿加入1 000 μL QIAzol Lysis Reagent裂解液(1∶5)裂解樣品。按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。檢測(cè)RNA濃度、純度,由于血漿樣本中的RNA為游離的RNA,RNA含量較低,無(wú)法通過(guò)電泳法得到證實(shí),本研究?jī)H通過(guò)qPCR結(jié)果來(lái)判定。按試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄引物序列見(jiàn)表1。miRNA熒光定量檢測(cè):采用熒光定量PCR法檢測(cè)miR-499和miR-486在各組血漿樣本中的表達(dá)水平。miR-499、miR-486及cel-39mimic(內(nèi)參)的上下游引物均購(gòu)自廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心。qPCR檢測(cè)反應(yīng)液的配制:10 μL 2×All-in-One qPCR Mix;2 μL qPCR Forward Primer(2 μmol/L);1 μL Universal PCR primer(2 μmol/L);2 μL First strand cDNA;5 μL ddH2O。qPCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10 min,循環(huán)1次;95℃變性10 s,60℃退火20 s,72℃延伸10 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán),然后進(jìn)行熔解曲線分析。每個(gè)組織樣本做3次平行試驗(yàn),采用2-ΔΔCt來(lái)分析miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

        Tab.1Primer sequences of reverse transcrption表1 逆轉(zhuǎn)錄引物序列

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述,不符合正態(tài)分布的用M(P25,P75)描述。非正態(tài)分布的計(jì)量資料2組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn),多組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。利用ROC曲線分析miR-486和miR-499表達(dá)量診斷肺癌最佳臨界值、敏感度與特異度。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組miR-486、miR-499表達(dá)水平比較NSCLC組和SCLC組中miR-486、miR-499表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.05),SCLC組與NSCLC組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2。

        Tab.2Comparison of relative expression levels of miR-486 and miR-499 between three groups表2 各組miR-486、miR-499的相對(duì)表達(dá)水平比較M(P25,P75)

        2.2 NSCLC組miR-486和miR-499的相對(duì)表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系NSCLC組血漿miR-486在不同臨床特征間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而TNM分期越晚、分化程度越低,miR-499表達(dá)越低(P<0.05),見(jiàn)表3。

        Tab.3Relationship between plasma expression levels of miR-486 and miR-499 with clinical features in NSCLC group表3 NSCLC組血漿中miR-486、miR-499的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系M(P25,P75)

        2.3 SCLC組miR-486和miR-499的相對(duì)表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系SCLC組血漿miR-486在腫瘤局限期和廣泛期間表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),即分期越廣泛miR-486表達(dá)越低;而miR-499在不同臨床特征間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表4。

        Tab.4Relationship between plasma expression levels of miR-486 and miR-499 with clinical features in the SCLC group表4 SCLC組血漿中miR-486、miR-499的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系M(P25,P75)

        2.4 miR-486和miR-499的相對(duì)表達(dá)量對(duì)肺癌的診斷價(jià)值ROC曲線顯示,miR-486診斷肺癌的曲線下面積(AUC)為0.83(95%CI:0.73~0.93),敏感度和特異度分別為90.0%和68.6%,最佳診斷界值為1.02;miR-499診斷肺癌的AUC為0.75(95%CI:0.62~0.88),敏感度和特異度分別為60.0%和94.3%,對(duì)肺癌的最佳診斷界值為0.32,見(jiàn)圖1。。

        Fig.1ROC curves of relative plasma expressions of miR-486 and miR-499 in the diagnostic value of lung cancer圖1 血漿中miR-486和miR-499相對(duì)表達(dá)量對(duì)肺癌診斷價(jià)值的ROC曲線

        3 討論

        miRNAs是一類高度保守、長(zhǎng)度很短的非編碼調(diào)控單鏈RNA,長(zhǎng)度約19~25 nt,其廣泛存在于真核生物體內(nèi),參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、外侵轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)歸預(yù)后等多個(gè)環(huán)節(jié)[8]。Croce實(shí)驗(yàn)室研究顯示,超過(guò)半數(shù)的miRNA基因存在于腫瘤相關(guān)基因中,miR-15a、miR-16a在慢性淋巴細(xì)胞白血病標(biāo)本中表達(dá)缺失或下調(diào)[9]。有研究認(rèn)為,miR-21、miR-210、miR-126、miR-486可以作為診斷NSCLC的參考指標(biāo)[10]。Hu等[11]研究證實(shí),NSCLC患者共有11種miRNA的表達(dá)量較正常情況下上調(diào)5倍之多,其中miR-1、miR-499、miR-486、miR-30d與NSCLC總生存率相關(guān),有望作為NSCLC患者的預(yù)后指標(biāo)。

        本研究結(jié)果顯示,NSCLC組和SCLC組血漿中miR-486表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組,與既往研究結(jié)果基本一致[10-11],且ROC曲線示miR-486診斷肺癌的AUC為0.83,接近0.90,具有中等診斷效率,提示血漿中miRNA-486表達(dá)水平的高低可能成為肺癌的非侵入性生物標(biāo)志物,可用于肺癌早期檢測(cè)。NSCLC組血漿miR-486在不同臨床特征間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在SCLC組中分期越晚,miR-486表達(dá)越低,提示miR-486可能是SCLC預(yù)后的影響因素。

        目前,有關(guān)血漿miR-499的研究通常集中在心肌損傷和心肌梗死之間的關(guān)聯(lián)[12]。急性心肌梗死患者血漿中miR-499低表達(dá),預(yù)示其可能成為早期檢測(cè)心肌損傷的生物標(biāo)志物[12]。Donaldson等[13]研究發(fā)現(xiàn),血漿miR-499在慢性阻塞性肺疾?。–OPD)患者中明顯升高。Vinci等[14]研究發(fā)現(xiàn),miR-499在NSCLC組和對(duì)照組中表達(dá)差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;本研究結(jié)果顯示,血漿miR-499在NSCLC和SCLC患者中表達(dá)水平均低于對(duì)照組,與Vinci等[14]學(xué)者的研究結(jié)論不完全相同,考慮可能與血漿中miR-499含量偏低,樣本量小及操作者的技術(shù)水平有關(guān),需要大規(guī)模前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。NSCLC患者的TNM分期越晚、分化程度越低,miR-499表達(dá)越低,與既往研究結(jié)果類似[7,14],提示血漿miR-499有可能作為NSCLC預(yù)后的生物標(biāo)志物。

        綜上所述,血漿miR-486、miR-489在肺癌患者中表達(dá)下調(diào),均有可能與肺癌的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān),有望作為肺癌潛在篩查及預(yù)后指標(biāo)。但是本研究樣本量較小、血漿中的miRNA的量較少,定量PCR的準(zhǔn)確性可能降低,這2個(gè)miRNA是否為肺癌特異來(lái)源尚有待確定。

        [1]Chen WQ,Zheng RS,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.doi:10.3322/ caac.21338.

        [2]Siegel R,DeSantis C,Virgo K,et al.Cancer treatment and survivorship statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2012,62(4):220-241.doi:10.3322/caac.21149.

        [3]Stefani G,Slack FJ.Small non-coding RNAs in animal development[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9(3):219-230.doi:10.1038/ nrm2347.

        [4]Chen X,Ba Y,Ma L,et al.Characterization of miRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res,2008,18(10):997-1006.doi:10.1038/cr.2008.282.

        [5]Ho AS,Huang X,Cao H,et al.Circulating miR-210 as a novel hypoxia marker in pancreatic cancer[J].Transl Oncol,2010,3(2):109-113.

        [6]Wang J,Tian X,Han R,et al.Down-regulation of miR-486-5p contributes to tumor progression and metastasis by targeting protumorigenic ARHGAP5 in lung cancer[J].Oncogene,2014,33(9):1181-1189.doi:10.1038/onc.2013.42.

        [7]Qiu F,Yang L,Ling X,et al.Sequence variation in mature miRNA-499 confers unfavorable prognosis of lung cancer patients treated with platinum-based chemotherapy[J].Clin Cancer Res,2015,21(7):1602-1613.doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-1174.

        [8]Chen X,Hu ZB,Wang WJ,et al.Identification of ten serum miRNAs from a genome-wide serum miRNA expression profile as novel non—invasive biomarkers for non-small cell lung cancer diagnosis[J].Int J Cancer,2012,130(7):1620-1628.doi:10.1002/ijc.26177.

        [9]Calin GA,Sevignani C,Dumitru CD,et al.Human miRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(9):2999-3004.doi:10.1073/pnas.0307323101.

        [10]Shen J,Todd NW,Zhang H,et al.Plasma miRNAs as potential biomarkers for non-small-cell lung cancer[J].Lab Invest,2011,91(4):579-587.doi:10.1038/labinvest.2010.194.

        [11]Hu Z,Chen X,Zhao Y,et al.Serum miRNA signatures identified in a genome-wide serum miRNA expression profiling predict survival of non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2010,28(10):1721-1726.doi:10.1200/JCO.2009.24.9342.

        [12]Wang GK,Zhu JQ,Zhang JT,et al.Circulating miRNA:a novel potentialbiomarkerforearlydiagnosisofacutemyocardial infarction in humans[J].Eur Heart,2010,31(6):659-666.doi:10.1093/eurheartj/ehq013.

        [13]Donaldson A,Natanek SA,Lewis A,et al.Increased skeletal muscle-specific miRNA in the blood of patients with COPD[J]. Thorax,2013,68(12):1140-1149.doi:10.1136/thoraxjnl-2012-203129.

        [14]Vinci S,Gelmini S,Pratesi N,et al.Genetic variants in miR-146a,miR-149,miR-196a2,miR-499 and their influence on relative expression in lung cancers[J].Clin Chem Lab Med,2011,49(12):2073-2080.doi:10.1515/CCLM.2011.708.

        (2016-06-12收稿2016-09-19修回)

        (本文編輯陸榮展)

        The expression and clinical significance of plasma miR-486 and miR-499 in patients with lung cancer

        YANG Yang1,2,YANG Qing3,JIA Youchao2,LI Xiaofang2,YANG Hua2,ZHANG Qian2,PENG Xinyu4,ZANG Aimin2△
        1 Hebei University,Baoding 071002,China;2 Hebei Key Laboratory of Cancer Radiotherapy and Chemotherapy,Department of Medical Oncology,the Affiliated Hospital of Hebei University;3 Department of Blood Transfusion, 4 Department of Hepatobiliary Surgery,the Affiliated Hospital of Hebei University△

        ObjectiveTo explore the expression levels of miR-486 and miR-499 in the plasma of lung cancer patients,and analyze their expression differences in non-small cell lung cancer(NSCLC)and small cell lung cancer(SCLC). MethodsBlood samples were collected in 35 patients with lung cancer(21 NSCLC and 14 SCLC)and 30 healthy persons (control group).The real-time quantitative PCR was used to detect the expression levels of plasma miR-486 and miR-499 in two groups.The plasma levels of miRNA-486 and miRNA-499 and their correlation with various clinical features in NSCLC and SCLC patients were analyzed.The receiver operating characteristic curves(ROC)of miRNA expressions were analyzed.The area under a curve(AUC),threshold and the sensitivity and specificity were calculated.ResultsThe expression levels of miR-486 and miR-499 were significantly lower in NSCLC and SCLC groups than those of the control group(P<0.05).There were no significant differences in the expression of miR-486 between different clinical features in NSCLC group.For the late cancer TNM staging,the tumor differentiation was lower,and the miR-499 expression level was lower(P<0.05).In SCLC group,for the late cancer staging,there was a lower expression level of miR-486.There were no significant differences in the expressions of miR-499 between different clinical features.The miRNA-486 AUC in the diagnosis of lung cancer was 0.83(95%CI:0.73-0.93),the sensitivity and specialty rates were 90.0%and 68.6% respectively,and the best diagnostic value was 1.02.The miRNA-499 AUC in the diagnosis of lung cancer was 0.75(95% CI:0.62-0.88),the sensitivity and specialty rates were 60.0%and 94.3%respectively,and the best diagnostic boundary value was 0.18 for lung cancer.ConclusionThe plasma expression levels of miR-499 and miR-486 are down-regulated in lung cancer patients,which suggest a poor prognosis and can be used as potential screening and prognostic indicators forlung cancer.

        carcinoma,non-small-cell lung;microRNAs;plasma;sensitivity and specificity;diagnosis,differential;miR-486;miR-499

        R734.2

        A

        10.11958/20160528

        2015年河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才項(xiàng)目(361007)

        1河北大學(xué)(郵編071002);2河北省放化療機(jī)制與規(guī)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科;3輸血科,4肝膽外科

        楊陽(yáng)(1985),男,碩士在讀,主要從事肺癌分子生物學(xué)研究

        △通訊作者E-mail:booszam@sina.com

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