桂錚，汪子文，張鵬飛，趙文可，于耀宇

甘草酸二銨干預(yù)兔基底動(dòng)脈瘤形成的實(shí)驗(yàn)研究

桂錚，汪子文，張鵬飛，趙文可，于耀宇△

目的探討甘草酸二銨（DG）干預(yù)兔基底動(dòng)脈瘤發(fā)生的作用機(jī)制。方法新西蘭白兔40只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、動(dòng)脈瘤（IA）組、生理鹽水（NS）組、DG組，每組10只。其中對(duì)照組不做任何處理，其余各組結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立基底動(dòng)脈瘤形成模型。在造模后的第1～7天，IA組不做處理，DG組給予DG［20 mg/（kg·d）］靜脈注射，NS組注入等劑量生理鹽水。使用免疫組化染色方法檢測(cè)基底動(dòng)脈尖核轉(zhuǎn)錄因子核因子kappa B（NF-κB）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）表達(dá)情況，使用免疫熒光染色方法檢測(cè)基底動(dòng)脈尖α-平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)情況。結(jié)果IA組和NS組NF-κB和MMP-9表達(dá)均高于對(duì)照組，α-SMA表達(dá)量低于對(duì)照組（P＜0.05）；IA組和NS組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。DG組NF-κB和MMP-9表達(dá)低于IA組和NS組（P＜0.05），而α-SMA表達(dá)量高于IA組和NS組（P＜0.05）。結(jié)論DG可抑制NF-κB和MMP-9的表達(dá)，減輕血管壁內(nèi)炎癥反應(yīng)，抑制顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成。

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤；炎癥；NF-κB；基質(zhì)金屬蛋白酶9；肌動(dòng)蛋白類；血管壁破壞性重構(gòu)

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤（intracranial aneurysm,IA）是顱內(nèi)血管管壁的異常膨出，是一種嚴(yán)重的致死性疾病。其形成的機(jī)制尚未完全闡明，目前研究表明，血流動(dòng)力學(xué)引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞破壞性重塑并誘發(fā)炎癥反應(yīng)可能是引起該病的重要途徑［1］。結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈制作兔基底動(dòng)脈瘤起始模型排除了血流動(dòng)力學(xué)因素以外其他因素的干擾，適用于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生過程分子機(jī)制的研究。本研究即采用該模型，并經(jīng)耳緣靜脈注射甘草酸二銨（DG），觀察DG對(duì)兔基底動(dòng)脈尖動(dòng)脈瘤發(fā)生過程的干預(yù)效果并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料清潔級(jí)新西蘭白兔40只，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不分，體質(zhì)量2.0～2.5 kg。DG注射液（連云港正大天晴）。一抗：兔抗兔轉(zhuǎn)錄因子核因子kappa B（NF-κB）p65抗體（Abcam，ab90532），小鼠抗兔基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）抗體（Abcam，ab58803），小鼠抗兔α-平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（Abcam，ab7817）。熒光二抗：羅丹明標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋，ZF0313），SP-9000免疫組化試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對(duì)照組、動(dòng)脈瘤（IA）組、生理鹽水（NS）組、DG組，每組10只。對(duì)照組不做任何處理，其余各組結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立基底動(dòng)脈瘤形成模型。造模時(shí)肌內(nèi)注射速眠新Ⅱ0.2 mL，后耳緣靜脈注射2.5%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉。麻醉后將動(dòng)物固定，頸部備皮，行頸部正中切口，分別分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈后用4-0絲線結(jié)扎。縫合皮膚及軟組織。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模后第1～7天，IA組不做處理，DG組給予DG 20 mg/（kg·d）靜脈注射，NS組注入等量生理鹽水。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材造模后第7天時(shí)過量麻醉處死動(dòng)物，斷頭取腦，固定，修剪組織，制作基底動(dòng)脈尖部組織蠟塊，脫水包埋制備基底動(dòng)脈尖部血管縱切面玻片。

1.2.3 基底動(dòng)脈尖NF-κB和MMP-9免疫組化染色組織玻片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2溶液孵育后高壓熱修復(fù)，用山羊血清孵育，加兔抗兔NF-κB p65（1∶200）或小鼠抗兔MMP-9（1∶500），4℃過夜。按照試劑盒說明書進(jìn)行二抗孵育及DAB顯色。常規(guī)蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化液分化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片后在200倍鏡下觀察并計(jì)算NF-κB和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞百分比。

1.2.4 基底動(dòng)脈尖α-SMA免疫熒光染色組織玻片常規(guī)脫蠟至水，0.1%Triton-100TM破膜后高壓熱修復(fù)，用山羊血清孵育，加入小鼠抗兔α-SMA（1∶200），4℃過夜。避光加入山羊抗小鼠IgG（1∶100），室溫孵育后避光加入DAPI（1∶100），孵育后用50%碳酸甘油緩沖液封片，在Leica DMI 3000B熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算α-SMA陽(yáng)性表達(dá)面積百分比（陽(yáng)性表達(dá)面積/管壁區(qū)域面積）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基底動(dòng)脈尖NF-κB、MMP-9的免疫組化結(jié)果與對(duì)照組相比，IA組和NS組NF-κB和MMP-9表達(dá)均增高（P＜0.05）；IA組和NS組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與NS組和IA組相比，DG組兩指標(biāo)表達(dá)均下降（P＜0.05）。見表1，圖1、2。

Tab.1Comparison of NF-κB,MMP-9 and α-SMA expressions between four groups表1 各組NF-κB和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞百分比和α-SMA陽(yáng)性表達(dá)面積百分比比較（n=10，%，）

Tab.1Comparison of NF-κB,MMP-9 and α-SMA expressions between four groups表1 各組NF-κB和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞百分比和α-SMA陽(yáng)性表達(dá)面積百分比比較（n=10，%，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與IA組比較，c與NS組比較，P＜0.05

NF-κB 10.47±1.92 20.20±3.16a 21.71±6.52a 14.66±3.65bc 15.427＊＊組別對(duì)照組IA組NS組DG組F MMP-9 18.20±3.29 29.42±6.56a 31.95±7.26a 22.62±4.19bc 12.743＊＊α-SMA 80.03±3.44 60.42±12.00a 57.25±9.01a 70.67±4.97bc 16.328＊＊

2.2 基底動(dòng)脈尖α-SMA免疫熒光染色結(jié)果與對(duì)照組相比，IA組和NS組α-SMA表達(dá)均下降（P＜0.05）；IA組和NS組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與NS組和IA組相比，DG組α-SMA表達(dá)增高（P＜0.05）。見表1、圖3。

3 討論

3.1 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤起始模型可行性分析結(jié)扎兔雙側(cè)頸總動(dòng)脈法是制作顱內(nèi)動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型的經(jīng)典方法之一，該方法最早由Hassler報(bào)道［2］。Meng等［3］采用相同方法對(duì)20只新西蘭白兔進(jìn)行處理，27周后存活的17只全部出現(xiàn)基底動(dòng)脈尖部以內(nèi)彈力層損傷、動(dòng)脈中層變薄以及管壁向外膨出為特點(diǎn)的破壞性重塑，這些特點(diǎn)也是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤血管管壁的特征性改變。Mandelbaum等［4］和Metaxa等［5］研究也得出同樣的特征性改變，可見使用該方法制作兔基底動(dòng)脈瘤形成模型切實(shí)有效，且該模型適用于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生階段病理機(jī)制的研究。本研究中，使用該方法同樣在7 d后出現(xiàn)兔基底動(dòng)脈尖部血管壁的損傷，證明該模型可行且有效。

3.2 NF-κB、MMP-9等在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成過程中的作用炎癥反應(yīng)是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成的重要環(huán)節(jié)，NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路尤為重要［6］。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成過程中血流動(dòng)力學(xué)的變化可引起內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB激活［7］。單核細(xì)胞趨化因子（MCP）-1、MMPs、白細(xì)胞介素（IL）-1β等表達(dá)增多也與NF-κB的激活有關(guān)［8］。本研究中，結(jié)扎兔雙側(cè)頸總動(dòng)脈改變了基底動(dòng)脈尖部的血流動(dòng)力學(xué)狀況，結(jié)扎7 d后，IA組和NS組NF-κB表達(dá)量明顯增高，該結(jié)果與Aoki等［9］研究結(jié)果一致。血流動(dòng)力學(xué)變化引起NF-κB激活的途徑很多，如環(huán)氧化酶2（COX-2）-NF-κB正反饋機(jī)制［10］等。本研究中，IA組和NS組MMP-9表達(dá)也增高，MMP-9升高可能與PI3K/Akt/NF-κB通路激活有關(guān)［11］。動(dòng)脈瘤組織中大量表達(dá)的MMP-9可降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。ECM是維持管壁細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要成分，大量ECM降解可引起管壁結(jié)構(gòu)損傷，造成管壁薄弱。維持顱內(nèi)動(dòng)脈管壁的強(qiáng)度和形態(tài)的另一種成分是收縮表型平滑肌細(xì)胞，而α-SMA是收縮表型平滑肌細(xì)胞的重要標(biāo)志。本研究中，IA組和NS組α-SMA表達(dá)低于對(duì)照組，說明收縮表型平滑肌細(xì)胞含量降低，即平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或表型轉(zhuǎn)化。平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化主要由腫瘤壞死因子（TNF）-α和Kruppel樣因子-4（KLF-4）進(jìn)行調(diào)控［12］，而NF-κB則可以影響這兩種分子的表達(dá)。

3.3 DG對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成的干預(yù)作用DG是中藥單體，分子式C42H68N2O16，相對(duì)分子質(zhì)量為857.01。DG具有廣泛的抗炎作用，目前主要用于肝病的治療。DG可通過多種途徑抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以及激活［13-14］。本研究中，DG組NF-κB和MMP-9的表達(dá)低于IA組和NS組，說明DG可抑制基底動(dòng)脈尖部NF-κB的表達(dá)或激活。NF-κB表達(dá)受抑制后，受NF-κB調(diào)控的MMP-9表達(dá)也出現(xiàn)降低。NF-κB和MMP-9表達(dá)的降低可以減輕基底動(dòng)脈尖部炎癥反應(yīng)的發(fā)生以及ECM的降解，從而減輕管壁結(jié)構(gòu)受損的程度。此外，DG組α-SMA的表達(dá)高于IA組和NS組，說明DG組平滑肌細(xì)胞的凋亡或表型轉(zhuǎn)化比例較少，大量存在的收縮表型平滑肌細(xì)胞使血管壁強(qiáng)度和形態(tài)得以維持。總之，DG可以通過抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路，降低MMP-9的表達(dá)以及平滑肌細(xì)胞凋亡或表型轉(zhuǎn)化的數(shù)量，減輕顱內(nèi)動(dòng)脈管壁的炎癥反應(yīng)和損傷程度，達(dá)到干預(yù)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成的目的。

（圖1～3見插頁(yè)）

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（2016-03-07收稿2016-08-26修回）

（本文編輯李鵬）

The intervention effect of diammonium glycyrrhizinate on the formation of basilar artery aneurysm in rabbits

GUI Zheng,WANG Ziwen,ZHANG Pengfei,ZHAO Wenke,YU Yaoyu△
Department of Neurosurgery,the Affiliated Hospital,Logistics College,Armed Police Command,Tianjin 300162,China△

ObjectiveTo explore the mechanism and intervention effects of diammonium glycyrrhizinate(DG)on the formation of intracranial aneurysm(IA)in rabbits.MethodsForty New Zealand rabbits were randomly divided into four groups:control group,IA group,normal saline(NS)groupandDG group,10rabbits for eachgroup. Except for the control group,rabbits in other three groups were operated with bilateral common carotid artery ligation to produce basilar artery aneurysm formation model.DG group was injected intravenously with DG［20 mg/(kg·d)］from the first day to the seventh day after operation,NS group was given same volume of normal saline,while IA group was injected nothing.The expressions of NF-κB and MMP-9 were detected by immunohistochemical staining,while α-SMA was stained with immunofluorescence.ResultsThe expressions of NF-κB and MMP-9 were significantly higher in IA group and NS group than those of control group,while α-SMA expression was significantly lower than that of control group (P＜0.01).There were no significant differences in expressions of NF-κB and MMP-9 between IA group and NS group(P＞0.05).The expressions of NF-κB and MMP-9 were significantly lower in DG group than those of IA group and NS group(P＜0.05).The expression of α-SMA was significantly higher in DG group than that of IA group and NS group(P＜0.05). ConclusionDG can downregulate the expression levels of NF-κB and MMP-9 in intracranial aneurysm,suppress inflammatory in artery wall and reduce the pathological changes and have intervention effect on intracranial aneurysm formation.

intracranial aneurysm;inflammation;NF-kappa B;matrix metalloproteinase 9;actins;destructive remodeling of vascular wall

R743.9

A

10.11958/20160102

武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院基金重點(diǎn)項(xiàng)目（FYZ201507）

武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（郵編300162）

桂錚（1989），男，碩士，初級(jí)職稱，主要從事神經(jīng)介入臨床及基礎(chǔ)研究

△通訊作者E-mail：yuyaoyu666@aliyun.com