梁寶璐，楊曼，吳鵬，李艷博，荊黎，孫志偉

納米二氧化硅致心肌線粒體損傷作用的研究

梁寶璐，楊曼，吳鵬，李艷博，荊黎△，孫志偉

目的研究納米二氧化硅對心肌細胞線粒體的毒性作用及機制。方法采用非暴露式氣管內(nèi)滴注的染毒方式對Balb/c小鼠進行3種濃度（7、21和35 mg/kg）粒徑為40 nm左右的納米二氧化硅暴露，另設對照組滴注等體積生理鹽水。通過透射電子顯微鏡對小鼠心肌線粒體超微結(jié)構進行觀察。通過對三磷酸腺苷（ATP）濃度的檢測，評價納米二氧化硅對心肌線粒體功能的影響。通過對心肌組織抗O2-·能力的檢測，評價心肌細胞線粒體抗氧化能力。采用Western blot法對心肌組織中細胞色素c氧化酶1（COX1）和琥珀酸脫氫酶A（SDHA）蛋白表達水平進行檢測，從而闡明納米二氧化硅對心肌細胞線粒體生物合成的影響。結(jié)果與對照組相比，高劑量的納米二氧化硅可導致線粒體結(jié)構的損傷，主要表現(xiàn)為線粒體腫脹、線粒體嵴排列紊亂甚至消失及線粒體融合。中、高劑量的納米二氧化硅可導致心肌細胞線粒體功能下降。低、中劑量的納米二氧化硅可引起心臟組織抗O2-·能力應激性升高，而高劑量的納米二氧化硅則可導致心臟組織抗O2-·能力下降。中劑量的納米二氧化硅可應激性誘導線粒體的生物合成，而高劑量的納米二氧化硅則抑制線粒體的生物合成。結(jié)論高劑量的納米二氧化硅可通過誘導線粒體內(nèi)O2-·的產(chǎn)生、降低線粒體抗氧化能力，從而導致線粒體結(jié)構和功能的損傷，并抑制線粒體的生物合成。

納米結(jié)構；環(huán)境暴露；毒性試驗；納米二氧化硅；心肌線粒體；線粒體生物合成

納米二氧化硅具有比表面積大、分散性好、化學純度高等性質(zhì)，被廣泛應用于化工生產(chǎn)、生物技術及生物醫(yī)學等各個領域。納米二氧化硅暴露所導致的呼吸系統(tǒng)疾病一直是人們關注的熱點，但是對于其所引起的心血管系統(tǒng)毒性，尤其是心臟損傷作用，尚少見相關研究。流行病學調(diào)查研究顯示，空氣動力學直徑＜2.5 μm的顆粒物可增加心血管疾病的發(fā)病率和死亡率［1-2］。實驗室研究也發(fā)現(xiàn)，直徑＜2.5 μm顆粒物可通過氣血交換進入血液循環(huán)，直接作用于心臟和血管系統(tǒng)，引起心臟功能紊亂、心率變異性降低、心肌細胞變性、間質(zhì)細胞增生以及心肌重構，甚至可以導致細胞線粒體及細胞核損傷，從而引起更為嚴重的有害生物學效應［3-5］。大量研究表明，包括顆粒物在內(nèi)的一些環(huán)境污染物可導致線粒體毒性的發(fā)生或者通過線粒體毒性來發(fā)揮其主要的生物學效應［6-7］。但是關于納米二氧化硅對心肌組織及線粒體的損傷作用及機制并不清楚。本實驗采用非暴露式氣管內(nèi)注入法對Balb/c小鼠進行納米二氧化硅（粒徑為40 nm左右）暴露，檢測心肌線粒體損傷相關指標，闡明納米二氧化硅對心肌線粒體的損傷作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器細胞色素c氧化酶1（Cytochrome c oxidase subunit1，COX1）、琥珀酸脫氫酶A（succinate dehydrogenase A，SDHA）抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；GAPDH抗體購自Abcam公司；驢抗羊和羊抗兔熒光二抗購自LI-COR公司；BCA蛋白定量試劑盒購自杭州碧云天生物技術公司；抗超氧陰離子自由基測試盒以及三磷酸腺苷（ATP）含量測試盒均購自南京建成生物工程研究所。96孔培養(yǎng)板（COSTAR，美國）；移液器（GILSON，法國）；離心管（江蘇海門塑料廠）；恒溫水浴箱（北京醫(yī)用設備廠）；TGL-16B型普通離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；JA1203電子天平（上海精科）；酶標儀（Themo，美國）；超低溫冰箱（SANYO，日本）；101A-2型干燥箱（上海市實驗儀器總廠）；低溫高速離心機（Kontront-42k，德國），透射電子顯微鏡（TEM，JEOL JEM2100，日本）。

1.2 實驗分組SPF級Balb/c小鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。采用隨機抽樣法將實驗動物分為對照組和7、21、35 mg/kg納米二氧化硅暴露組（低、中、高劑量組），每組10只。小鼠在5%水合氯醛（7 μL/kg）麻醉下，采用非暴露式氣管內(nèi)滴注法，滴注50 μL的納米二氧化硅懸液，質(zhì)量濃度分別為2.816、8.448、14.080 g/L，對照組滴注等體積生理鹽水，每3 d染毒1次，共5次。染毒前小鼠禁食12 h。

1.3 納米二氧化硅制備及表征觀察采用St?ber法制備納米二氧化硅：三頸瓶中依次加入無水乙醇50 mL、氨水2 mL、高純水1 mL，在攪拌速度為150 r/min下迅速加入1.5 mL正硅酸乙酯（tetraethoxysilane，TEOS），反應12 h后停止；15 000 r/min離心30 min后，用無水乙醇和去離子水分別清洗3次，超聲分散在無菌水中，即納米二氧化硅母液；取分散好的母液，放入1 mL已稱質(zhì)量的離心管中，烘干40 h，稱質(zhì)量，計算母液的濃度。取少量納米二氧化硅滴在銅網(wǎng)上，自然晾干，于透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)。母液用于動物實驗前再超聲5 min，用生理鹽水稀釋調(diào)節(jié)濃度。

1.4 電鏡觀察心肌細胞線粒體超微結(jié)構改變納米二氧化硅染毒結(jié)束24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，迅速摘取對照組和高劑量組小鼠心臟組織，生理鹽水漂洗后，4℃2.5%戊二醛溶液中進行前固定，并在固定液中將心臟組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小。送至電鏡中心制備組織電鏡標本。隨后在透射電子顯微鏡下觀察心肌細胞線粒體的超微結(jié)構。

1.5 心肌細胞線粒體功能的檢測稱取50 mg心肌組織，加入9倍體積的沸雙蒸水，制成10%的勻漿液，再置于沸水浴中煮10 min，取出混勻抽提1 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液BCA法檢測蛋白濃度，并根據(jù)試劑盒操作步驟檢測ATP濃度，結(jié)果用單位質(zhì)量蛋白中ATP的含量表示。

1.6 心肌組織抗超氧陰離子（O2-·）自由基能力的檢測準確稱量心臟組織，按照質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入無菌生理鹽水，于冰水浴中勻漿，3 700×g離心10 min，取上清液BCA法檢測蛋白濃度，并根據(jù)試劑盒操作步驟檢測心肌組織抗O2-·自由基能力，結(jié)果用單位質(zhì)量蛋白的抗O2-·的活力單位表示。

1.7 Western blot法檢測COX1和SDHA蛋白表達水平采用RIPA裂解液提取心肌組織蛋白。BCA試劑盒進行蛋白定量后，調(diào)整各組織蛋白濃度，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣緩沖液后對蛋白樣品進行變性。將變性后的蛋白加入12%SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離，蛋白上樣量為60 μg。電泳開始電壓為80 V，染料進入分離膠后，增加到180 V。在轉(zhuǎn)移緩沖液中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，電流為100 mA，轉(zhuǎn)膜時間為2 h。將取出的膜放入10 mL封閉液中，室溫輕搖2 h加入一抗，過夜。取出后用TBST室溫洗膜3次。再加入二抗，室溫搖床上孵育1 h。再用TBST室溫洗膜3次后采用Li-Cor Odyssey system進行曝光。用Quantity One 4.6.2圖像分析軟件進行灰度分析，對目標蛋白進行定量。以GAPDH作為內(nèi)參來確定目標蛋白的表達。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 納米二氧化硅顆粒的表征高壓滅菌后納米二氧化硅顆粒在0.9%生理鹽水中的電鏡照片見圖1。二氧化硅顆粒呈橢球形，大小基本無差別，分布均勻一致，單分散性較好。

Fig.1Transmission electron microscopy image of amorphous silica particles圖1 納米二氧化硅的形貌（TEM）

2.2 納米二氧化硅對心肌線粒體超微結(jié)構的影響對照組小鼠心肌細胞線粒體膜完整，無水腫，內(nèi)膜嵴密度正常，并且排列整齊；高劑量組線粒體呈現(xiàn)腫脹、嵴排列紊亂、斷裂，甚至消失，見圖2。

Fig.2The effect of silica nanoparticles on the ultrastructure of myocardial mitochondria圖2 納米二氧化硅對心肌細胞線粒體超微結(jié)構的影響

2.3 納米二氧化硅對心肌細胞線粒體功能的影響與對照組相比，低劑量組ATP濃度無明顯變化（P＞0.05），中、高劑量組ATP濃度明顯降低（均P＜0.05），見圖3。

Fig.3The effect of silica nanoparticles on ATP generation in myocardial mitochondria圖3 納米二氧化硅對心肌細胞線粒體ATP生成的影響

Fig.4The effect of silica nanoparticles on anti-superoxide anion activity in myocardial cells圖4 納米二氧化硅對心肌細胞抗?能力的影響

2.5 納米二氧化硅對心肌細胞線粒體新生的影響各組心肌組織中COX1蛋白表達水平以及COX1與SDHA蛋白表達水平的比值差異均有統(tǒng)計學意義（F分別為132.665、137.069，均P＜0.05）。（1）COX1蛋白表達水平。低、中劑量組與對照組差異均無統(tǒng)計學意義，高劑量組低于對照組（P＜0.05）。（2）COX1與SDHA蛋白表達水平的比值。低劑量組與對照組差異無統(tǒng)計學意義，中劑量組高于對照組，高劑量組低于對照組（P＜0.05），見圖5。

Fig.5The effect of silica nanoparticles on myocardial mitochondrial biogenesis圖5 納米二氧化硅對心肌細胞線粒體新生的影響

3 討論

納米二氧化硅可以通過多種途徑（吸入、攝入及注射等）進入體內(nèi)［8-9］。大多數(shù)研究認為吸入途徑是人群暴露納米顆粒的主要途徑［10］，因此本實驗采用氣管注入的暴露方式給予小鼠高、中、低3種劑量的納米二氧化硅染毒。WHO空氣質(zhì)量準則2005年版中規(guī)定，空氣中細顆粒物24 h平均濃度限值的準則值為25 μg/m3［11］。成年小鼠體質(zhì)量以20 g計，每次呼吸空氣吸入量為0.15 mL，呼吸頻率為163次/ min，計算得日吸入空氣量為35 L。毒理學中由動物實驗外推到人時，安全系數(shù)為100。按照WHO標準，成年小鼠日吸入細顆粒物為0.88 μg，即44 μg/ kg，因此本次實驗染毒劑量選為7、21、35 mg/kg，約為空氣質(zhì)量準則中細顆粒物24 h平均濃度的100、300和500倍。大量研究表明，吸入的空氣超細顆粒物可以通過“血肺屏障”進入循環(huán)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)移到心臟、肝臟、腎臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而引起一系列的生物學效應［12-14］。Du等［15］研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化硅可引起大鼠心肌組織氧化損傷以及炎癥反應，并且可導致心肌細胞凋亡的發(fā)生。且有研究表明，低劑量的納米二氧化硅暴露可導致斑馬魚胚胎心臟氧化損傷以及炎癥的發(fā)生，并可以引起心臟收縮功能障礙［16］。因此，筆者推測納米二氧化硅顆粒的暴露可能是心血管系統(tǒng)疾病的一個潛在危險，但其具體作用及機制并不清楚。

線粒體占心肌細胞體積的40%～60%左右，是心肌細胞內(nèi)最重要的細胞器之一，只要其發(fā)生輕微的變化就能引起心肌細胞甚至整個心臟功能的巨大變化［17］。線粒體是細胞能量的主要來源，同時線粒體呼吸鏈也是活性氧（ROS）的主要來源。有研究表明線粒體是空氣顆粒物作用的敏感靶標［18-20］，且細顆粒物可導致心肌細胞線粒體結(jié)構和功能損傷，破壞線粒體融合和分裂的動態(tài)平衡［6,21］。本研究結(jié)果顯示，高劑量的納米二氧化硅可以導致線粒體結(jié)構的損傷，主要表現(xiàn)為線粒體腫脹、線粒體嵴排列紊亂甚至消失及線粒體融合，并且中劑量和高劑量的納米二氧化硅可導致心肌細胞線粒體功能的下降，與以往研究結(jié)果基本一致。

目前多項研究表明，細顆粒物的心肌細胞毒作用機制主要涉及ROS、活性氮、氧化應激、鈣離子穩(wěn)態(tài)以及炎癥反應等方面［22］。線粒體既是細胞生成ROS的主要場所，同時也是ROS攻擊的首要靶標。本研究結(jié)果顯示，低、中劑量的納米二氧化硅可引起心臟組織抗O2-·能力應激性升高，而高劑量的納米二氧化硅則可導致心臟組織抗O2-·能力的下降，提示高劑量的納米二氧化硅可導致心肌細胞線粒體O2-·的產(chǎn)生增加，降低心肌細胞線粒體抗氧化損傷的能力，說明納米二氧化硅對心臟的損傷作用主要與ROS和氧化應激反應相關。

心肌細胞線粒體的生物合成非常活躍，當細胞線粒體發(fā)生損傷時，線粒體生物合成就是細胞的一種保護機制。SDHA為線粒體復合物Ⅱ的亞單位，是核DNA編碼的蛋白；COX1為線粒體復合物Ⅳ的亞單位，是線粒體DNA編碼的蛋白，兩者的比值可反映線粒體的生物合成情況。因此本實驗通過對心臟組織內(nèi)COX1和SDHA的蛋白表達水平進行檢測，并通過二者的比值來評價納米二氧化硅對心肌細胞線粒體生物合成的影響。結(jié)果顯示，中劑量的納米二氧化硅可應激性誘導線粒體的生物合成，而高劑量的納米二氧化硅則抑制線粒體的合成，提示隨著納米二氧化硅暴露劑量的增加，線粒體生物合成受到抑制。結(jié)合心臟組織抗O2-·能力、ATP濃度以及線粒體結(jié)構的檢測結(jié)果，筆者推測低、中劑量的納米二氧化硅可引起心肌細胞抗氧化能力應激性地升高，從而發(fā)揮抵抗納米二氧化硅的心肌毒性作用，而高劑量的納米二氧化硅可引起心肌細胞氧化和抗氧化狀態(tài)的失衡，從而導致線粒體的損傷以及抑制線粒體的生物合成。

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（2016-05-27收稿2016-09-19修回）

（本文編輯陳麗潔）

Toxic effects of silica nanoparticles on myocardial mitochondria

LIANG Baolu,YANG Man,WU Peng,LI Yanbo,JING Li△,SUN Zhiwei
School of Public Health,Capital Medical University,Beijing 100069,China△

ObjectiveTo investigate the toxic effects and mechanisms of silica nanoparticles on myocardial mitochondrial.MethodsThe Balb/c mice were intratracheally instilled with silica nanoparticles(40 nm)at three doses of 7,21 and 35 mg/kg every three days for a total of 5 times.Control group was given the same volume of normal saline.The transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure of myocardial mitochondria.By measuring the concentration of ATP，the effect of silica nanoparticles on the function of myocardial mitochondria was evaluated.Through the detection of the ability of anti O2-·in the myocardial tissue,the antioxidant capacity of mitochondria in cardiac muscle was evaluated.The expression levels of cytochrome coxidase subunit 1(COX1)and succinate dehydrogenase subunit a(SDHA) were detected by Western blot assay.ResultsThe results showed that silica nanoparticles at high dose can damage the structure of myocardial mitochondrial,which induced swelling of mitochondria，mitochondrial cristae disorder disappeared and even mitochondrial fusion.Silica nanoparticles(21 and 35 mg/kg)can induced the decrease in functions of mitochondria.Silica nanoparticles(7 and 21 mg/kg)can enhance the myocardial antioxidant capacity.But high dose of silica nanoparticles can induce the decrease in the myocardial antioxidant capacity.Silica nanoparticles(21 mg/kg)induced mitochondrial biosynthesis,but high dose of silica nanoparticles(35 mg/kg)inhibited mitochondrial biosynthesis. ConclusionSilica nanoparticles(35 mg/kg)can induce the production of O2-·and decrease the antioxidant capacity of mitochondria,which leads to the damage of the function and structure of the mitochondria and inhibits the mitochondria biosynthesis.

nanostructures;environmental exposure;toxicity tests;silica nanoparticles;myocardial mitochondrial; mitochondria biosynthesis

R122.2

A

10.11958/20160476

國家自然科學基金資助項目（81402709，81573176）；北京市自然科學基金項目（7162021）

首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院（郵編100069）

梁寶璐（1988），女，主管技師，碩士在讀，主要從事衛(wèi)生毒理、實驗技術與管理工作

△通訊作者E-mail:jingli@ccmu.edu.cn