李莉，趙艷麗，劉傳亮，于汪營

肥胖癥患者脂肪組織中的SIRT1 mRNA和蛋白表達水平及臨床意義

李莉1，趙艷麗2，劉傳亮3，于汪營4

目的探討肥胖癥患者脂肪組織中的沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）mRNA和蛋白表達水平及其在肥胖癥治療中的臨床意義。方法選取接受肥胖治療的患者105例，以體質(zhì)量指數(shù)（BMI）分為肥胖癥組（BMI≥23 kg/m2）和對照組（18.5 kg/m2≤BMI＜23 kg/m2）；取2組患者腹膜脂肪組織。采用實時熒光定量PCR法檢測2組患者脂肪組織SIRT1 mRNA表達水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測脂肪組織SIRT1的蛋白表達水平。并分析2組SIRT1蛋白表達水平與BMI、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）以及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的相關(guān)性。結(jié)果肥胖癥組SIRT1 mRNA和蛋白表達水平均低于對照組（P＜0.05）。肥胖癥組脂肪組織中TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR均高于對照組（P＜0.05）。SIRT1的蛋白表達水平與總TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR呈負相關(guān)（r分別為-0.391、-0.941、-0.184、-0.215及-0.990，均P＜0.05）。結(jié)論肥胖癥患者腹膜脂肪組織中SIRT1 mRNA和蛋白表達水平較非肥胖患者均明顯下降，且SIRT1蛋白表達水平與肥胖相關(guān)指標呈相關(guān)性，對臨床治療肥胖癥具有一定的指導作用。

肥胖癥；皮下脂肪，腹部；人體質(zhì)量指數(shù)；RNA,信使；血脂異常；血糖；沉默信息調(diào)節(jié)因子1

肥胖是高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病等疾病的重要發(fā)病基礎(chǔ)，肥胖癥及其相關(guān)疾病嚴重損害了患者的身體和心理健康，使患者生活質(zhì)量明顯下降，已經(jīng)成為嚴重的公共衛(wèi)生問題［1-2］?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，肥胖癥的發(fā)生是一個復雜的慢性過程，通常是攝入熱量過多而消耗太少，低能量代謝導致脂肪在體內(nèi)堆積所致。目前，針對肥胖的分子水平研究主要集中在葡萄糖利用、脂肪儲存和代謝、胰島素信號通路等環(huán)節(jié)［3-4］。其中，沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）在肥胖、胰島素抵抗中的作用日益受到關(guān)注［5-6］。哺乳動物脂肪細胞中，SIRT1可能是通過胰島素（INS）/胰島素樣生長因子（IGF）-1通路發(fā)揮作用，SIRT1影響INS/IGF-1信號通路下游的FOXO1（Forkhead box O1），通過調(diào)節(jié)FOXO1或FOXO1的靶基因來調(diào)控脂肪細胞分化［7］。目前，有關(guān)SIRT1在肥胖者脂肪組織中的表達情況尚少見報道。本研究旨在分析肥胖癥患者脂肪組織中的SIRT1 mRNA和蛋白表達水平，探討其在肥胖癥治療中的指導意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2012年4月—2014年4月來我院接受肥胖治療的患者105例。納入標準：（1）年齡＞18歲，沒有遺傳性疾病家族史。（2）無惡性腫瘤。（3）無糖尿?。鄹鶕?jù)病史及空腹血糖（FPG）］及甲狀腺功能異常。（4）無肝腎功能不全。（5）無嚴重消化系統(tǒng)疾病影響進食或慢性腹瀉。（6）無厭食癥或近期未進行節(jié)食減肥。參照文獻［8］，以體質(zhì)量指數(shù)（BMI）作為分組的標準：BMI≥23 kg/m2者48例為肥胖癥組，男19例，女29例，年齡36～69歲，平均（47.25±5.36）歲；18.5 kg/m2≤BMI＜23 kg/m2者57例為對照組，男23例，女34例，年齡35～69歲，平均（48.65±5.71）歲。2組性別（χ2=0.014）、年齡（t=0.198）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要材料與試劑逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量2× SYBR Green Mix購自南京唯贊生物有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成；SIRT1試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自美國R&D公司；SIRT1小鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；DAB顯色劑購自上海生工生物有限公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；酶標儀MK3購自上海賽默飛世爾公司。

1.3 標本采集肥胖癥組通過抽吸方法獲取腹部皮下脂肪組織標本。對照組在腹部手術(shù)時，摘取切除組織的脂肪組織作為研究標本。所有試驗者標本的收集均通過本院倫理委員會的批準及患者的知情同意。

1.4 檢測方法

1.4.1 實時熒光定量PCR檢測脂肪組織SIRT1 mRNA表達水平取2組患者脂肪組織0.1 g，根據(jù)RNA提取液試劑盒說明書進行總RNA提取，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank提供的SIRT1的序列，設計引物如下：上游5′-GGGGTTTCTGTCTCCTGT-3′，下游5′-GAATGGTCTTGGGTCTTT-3′；GAPDH：上游5′-CCTTCCGTGTTCCTACCC-3′，下游5′-CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3′。引物稀釋為10 μmol/L。對引物特異性和退火溫度進行條件優(yōu)化后制備PCR反應體系，總反應體積20 μL。1 500 r/min離心1 min后將反應混合物離心至管底，反應條件：預變性94℃2 min；變性94℃30 s；退火60℃30 s；72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。為確定產(chǎn)物的特異性，構(gòu)建熔解曲線，實時熒光定量PCR儀上直接讀取數(shù)據(jù)。

1.4.2ELISA檢測脂肪組織SIRT1的蛋白表達水平取2組患者脂肪組織0.5 g，置于小燒杯中，用眼科剪盡快剪碎組織塊，加入200 μL組織裂解液，組織勻漿儀勻漿5 min，冰上放置20 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測SIRT1的蛋白表達水平，每個樣本和標準品均設3個復孔，于酶標儀492 nm處測光密度（OD）值。

1.4.3 血清血脂、FPG以及空腹INS（FINS）水平檢測分別抽取2組患者清晨空腹靜脈血，4 000 r/min離心10 min后取上清，根據(jù)相關(guān)試劑盒說明書于Roche Modular PPI全自動生化分析儀上，CHOD-PAP法檢測總膽固醇（TC）、GPO-PAP法檢測三酰甘油（TG）、葡萄糖氧化酶法測定FPG、放射免疫法測定FINS。計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=（FPG× FINS）/22.5。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料用表示，2組間比較用t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較用卡方檢驗。對照組和肥胖癥組患者SIRT1蛋白表達水平與TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組脂肪組織中SIRT1實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，擴增曲線良好，重復性高。引物特異性好，擴增時未見雜峰出現(xiàn)，見圖1。肥胖癥組脂肪組織中SIRT1 mRNA表達水平（0.87±0.25）低于對照組（2.91±0.47），差異有統(tǒng)計學意義（t=2.196，P＜0.05）。

2.2 2組脂肪組織SIRT1的蛋白表達水平比較建立的ELISA標準曲線具有很好的線性，R2=0.992。肥胖癥組脂肪組織中SIRT1蛋白表達水平低于對照組［（875.78±128.70）μg/L vs.（5 179.46±465.14）μg/L，t=4.505，P＜0.05］。

2.3 2組血清TC、TG及FPG等比較肥胖癥組血清中TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR均高于對照組（P＜0.05），見表1。

2.4 對照組和肥胖癥組患者SIRT1的蛋白表達水平與相關(guān)指標的相關(guān)分析結(jié)果SIRT1的蛋白表達水平與TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR呈負相關(guān)（r分別為-0.391、-0.941、-0.184、-0.215及-0.990，均P＜0.05）。

Fig.1Comparison of SIRT1 mRNA levels in adipose tissue between two groups圖1 2組脂肪組織中SIRT1 mRNA表達水平比較

Tab.1Comparison of serum levels of lipids,fasting glucose and FINS between two groups表1 2組血清血脂、血糖以及FINS水平比較

Tab.1Comparison of serum levels of lipids,fasting glucose and FINS between two groups表1 2組血清血脂、血糖以及FINS水平比較

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別肥胖癥組對照組t n 48 57 TC（mmol/L）5.26±0.97 4.37±0.81 2.219＊TG（mmol/L）2.11±0.53 1.45±0.35 2.671＊FPG（mmol/L）10.83±2.81 5.13±1.47 3.058＊＊組別肥胖癥組對照組t n 48 57 FINS（mU/L）16.37±3.37 9.61±2.85 2.971＊＊HOMA-IR 6.42±1.67 2.19±0.52 2.189＊

3 討論

肥胖是一種與遺傳、代謝密切相關(guān)的多因素疾病。目前，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肥胖患者存在不同程度的胰島素抵抗［8-9］。胰島素抵抗可促使正常人群糖耐受惡化，是導致2型糖尿病的主要原因［10］。

目前，有關(guān)SIRT1蛋白在肥胖患者脂肪組織中表達水平的研究較少。SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性Sirtuin去乙?；易逯械囊粏T，SIRT1在動物脂肪細胞分化與脂肪代謝過程中起著重要的調(diào)控作用。SIRT1的脫乙酰酶活性影響細胞的存活、分化、衰老和凋亡［11-12］。研究顯示，在INS/IGF-1通路中，SIRT1可以作用于其上游胰島素受體底物（IRS）-1，導致IRS-1磷酸化水平升高，此外，SIRT1還能夠作用于通路下游FOXO1，上調(diào)FOXO1活性，增強其與CCAAT增強子結(jié)合蛋白α的相互作用，增加脂聯(lián)素基因的轉(zhuǎn)錄水平，減輕胰島素抵抗［13-15］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，肥胖癥組脂肪組織SIRT1 mRNA和蛋白表達水平均明顯下降，提示SIRT1的下調(diào)可能導致胰島素依賴的信號通路轉(zhuǎn)導受阻，同時可能下調(diào)FOXO1活性，增加了胰島素抵抗，這一表型與肥胖患者的臨床表型是一致的。

肥胖患者多數(shù)伴有糖尿病、高脂血癥和動脈粥樣硬化等疾病。本研究結(jié)果顯示，肥胖癥組脂肪組織中TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR均高于對照組，證實了肥胖患者的確存在血脂和血糖顯著增高的情況。另外，SIRT1的蛋白表達水平與TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR呈負相關(guān)，提示SIRT1蛋白表達水平降低時，可能導致了患者糖代謝、脂代謝通路受阻，引起血糖、血脂以及HOMA-IR升高，導致病情加劇。這一結(jié)果在部分其他研究中也得到了初步證實［16］。

綜上所述，SIRT1蛋白表達水平在肥胖患者中明顯下調(diào)，其與肥胖患者血糖、血脂以及HOMA-IR呈負相關(guān)，可通過改善SIRT1蛋白表達水平達到調(diào)節(jié)代謝平衡、治療肥胖的目的。

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（2016-05-24收稿2016-06-21修回）

（本文編輯陸榮展）

The expression levels and clinical significance of SIRT1 mRNA and protein in adipose tissue of obese patients

LI Li1,ZHAO Yanli2,LIU Chuanliang3,YU Wangying4
1 Department of Endocrinology,the Second People’s Hospital of Pingdingshan City,Pingdingshan 467000,China; 2 Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou Universiti,Henan;3 General Surgery, 4 Department of Pathology,the Second People’s Hospital of Pingdingshan City

ObjectiveTo explore expression levels of SIRT1 mRNA and protein in adipose tissue of obese patients, and its clinical significance in the treatment of obesity.MethodsA total of 105 patients in our hospital were selected and divided into obesity group(BMI≥23 kg/m2)and control group(18.5 kg/m2≤BMI＜23 kg/m2)according to body mass index (BMI).SIRT1 mRNA expression levels in adipose tissue(collected from peritoneum)were detected by quantitative PCR method in two group.SIRT1 protein expression levels of adipose tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent (ELISA)in two groups.The relationships of SIRT1 expression,BMI,total cholesterol(TC),triglyceride(TG),fasting plasma glucose(FPG)and insulin resistance(HOMA-IR)were analyzed between two group.ResultsSIRT1 mRNA and protein levels were significantly lower in obesity group than those of normal group(P＜0.05).The values of TC,TG,FPG,FINS and HOMA-IRinadiposetissueweresignificantlyhigherinobesitygroupthanthoseofnormalgroup(P＜0.05).Theproteinexpression level of SIRT1 was positively correlated with values of TC,TG,FPG,FINS and HOMA-IR(r=-0.391,-0.941,-0.184,0.215 and-0.990,P＜0.05).ConclusionSIRT1 mRNA and protein expression levels in adipose tissue are significantly reduced in obesity patients than those of control group.There is a close relationship between SIRT1 protein level and obesity index, which has certain guidance for clinical treatment of obesity.

obesity;subcutaneous fat,abdominal；body mass index；RNA,messenger；dyslipidemias；blood glucose；silent information regulator 1

R589.2

A

10.11958/20160404

1河南省平頂山市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（郵編467000）；2鄭州大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科；3河南省平頂山市第二人民醫(yī)院普外科，4病理科

李莉（1978），女，本科，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌科臨床研究