劉海霞 張 力 葉 武

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 動物科技學(xué)院,江蘇泰州 225300)

白腐真菌降解秸稈條件的研究

劉海霞 張 力 葉 武

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 動物科技學(xué)院,江蘇泰州 225300)

本試驗(yàn)從溫度、pH值、接種量以及秸稈中的水分含量等優(yōu)化指標(biāo)，研究白腐真菌發(fā)酵秸稈前后纖維素和木質(zhì)素的變化。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在秸稈含水量為60%，溫度在30℃，接種量為0.25g/kg，酸度控制在pH為5.0的條件下發(fā)酵7天的效果比較顯著。本試驗(yàn)研究為白腐真菌處理秸稈飼料提供理論依據(jù)。

白腐真菌 秸稈發(fā)酵 飼料 單因素

我國年產(chǎn)各類農(nóng)作物秸稈達(dá)5.7億t，占世界秸稈總產(chǎn)量的20%～30%[1-2]，但是，其中絕大部分并未得到充分利用，隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料資源日趨緊張，開發(fā)利用秸稈飼料發(fā)展食草型、節(jié)糧型畜牧業(yè)不僅可節(jié)約飼料資源，而且可促進(jìn)農(nóng)業(yè)良性循環(huán)，合理有效地利用秸稈是飼料生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)選取對秸稈降解效果較好的紅芝（Ganoderma）和黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）兩種白腐真菌發(fā)酵秸稈，通過改變培養(yǎng)基含水量、初始pH值、培養(yǎng)溫度及菌種接種量，測定發(fā)酵前后秸稈纖維素和木質(zhì)素的變化，研究不同單一因素對發(fā)酵秸稈效果的影響，為白腐真菌處理秸稈飼料提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 菌種

白腐真菌：紅芝購自武漢食用菌栽培研究所，黃孢原毛平革菌由中科院北京植物研究所提供。

1.2 秸稈

稻草和小麥秸稈：將自然風(fēng)干的秸稈粉碎、滅菌處理，過40目篩，備用。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 PDA培養(yǎng)基（用于菌種保藏）

稱取去皮新鮮土豆200 g，切成小塊，加水至1 L，煮沸30 min。用紗布過濾后加20 g葡萄糖、20 g瓊脂粉，在電爐上加熱至瓊脂溶化，加水補(bǔ)足1 L。分裝至已空消過的試管中，置滅菌鍋中121℃滅菌20 min。傾斜靜置，待凝固后備用。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)基（用于白腐真菌增富）

去皮馬鈴薯200 g，煮沸30 min，紗布過濾，加入20 g蔗糖，融化后補(bǔ)水至1000 mL，自然pH值，加入10 g秸稈粉，100 mL分裝250 mL三角瓶，121℃間歇滅菌[3]。

1.3.3 固體培養(yǎng)基

水稻秸稈：麩皮=7∶3，（NH4）2SO41%，KH2PO4 0.2%，料水比=1∶4.5。每500 mL三角瓶含10 g培養(yǎng)基，121 ℃滅菌60 min。用于白腐真菌產(chǎn)酶[3]。

1.4 主要儀器

移液槍（Eppendorf公司）；滅菌鍋（上海博訊，YXQ-LS-100SII）；無菌操作臺（蘇州凈化；VS—1300U）；分析天平（賽多利斯，TE214S）；高溫箱型電爐（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.5 藥品

乙醚、乙醇、鹽酸、硫酸、硼酸、氫氧化鈉等常規(guī)分析藥品。

2 方法

2.1 菌種活化

取4株斜面種子管分別接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d。

2.2 液體培養(yǎng)

選取菌絲長勢旺盛的平板，取菌苔前端接種于液體種子培養(yǎng)基，28℃恒溫?fù)u床（150 r/min）培養(yǎng)3～5 d，至長出可見的白色菌絲球，即可作為種子液使用。

2.3 發(fā)酵

將準(zhǔn)備好的種子培養(yǎng)基和固體發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶按體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量接入菌種，25 ℃下靜置培養(yǎng)。

2.4 不同培養(yǎng)條件對秸稈降解效果的影響

2.4.1 不同培養(yǎng)基含水量對秸稈降解效果的影響

調(diào)整固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的含水量為60%、65%、70%，各10%的接種量接種紅芝和黃孢原毛平革菌，在30℃，自然pH下，發(fā)酵稻草和麥秸20d，發(fā)酵后測定纖維素、木質(zhì)素含量。

2.4.2 不同培養(yǎng)溫度對秸稈降解效果的影響

將秸稈基礎(chǔ)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，以各10%的接種量接種紅芝和黃孢原毛平革菌，在25℃、30℃、35℃不同溫度下，發(fā)酵稻草和麥秸20d，發(fā)酵后測定纖維素、木質(zhì)素含量。

2.4.3 不同菌種接種量對秸稈降解效果的影響

將秸稈基礎(chǔ)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，以總接種量分別為0.125g/kg、0.25g/kg、0.5g/kg接種紅芝和黃孢原毛平革菌，在30℃，自然pH下，發(fā)酵稻草和麥秸20天，發(fā)酵后測定纖維素、木質(zhì)素含量。

2.4.4 培養(yǎng)基不同初始pH值對降解效果的影響

調(diào)節(jié)基礎(chǔ)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始酸堿值，使pH分別為4.0、5.0、6.0，在30℃下，發(fā)酵稻草和麥秸20d，發(fā)酵后測定纖維素、木質(zhì)素含量。

2.5 結(jié)果計(jì)算

將培養(yǎng)好的秸稈培養(yǎng)基置于烘箱中，于 80 ℃烘干48 h，將樣品編號，采用范氏（Van Soest）纖維測定法測定中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）含量[4]，并計(jì)算中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素的降解率。

中性洗滌纖維含量的計(jì)算：NDF（%）=（W1－W2）/ W×100；式中：W1-玻璃坩堝和NDF重（g），W2-玻璃坩堝重（g），W-試樣重（g）

酸性洗滌纖維含量的計(jì)算：ADF（%）=（G1－G2）/ G×100；式中：G1-玻璃坩堝和ADF重（g），G2-玻璃坩堝重（g），W-試樣重（g）

半纖維素含量的計(jì)算：半纖維素（%）=NDF（%）－ADF（%）

纖維素含量的計(jì)算：纖維素=ADF（%）－經(jīng)72%硫酸處理后的殘?jiān)?）

酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）含量的計(jì)算：ADL（%）=殘?jiān)?）－灰分（硅酸鹽，%）

3 結(jié)果與分析

3.1 培養(yǎng)基含水量對秸稈降解效果的影響

在固態(tài)發(fā)酵中，培養(yǎng)物的氣體交換是影響白腐真菌對秸稈降解作用的重要因素之一，而氣體交換量是由固、液相之比決定，

含水量過高或過低都會阻止白腐真菌的生長。

由表1看出，在含水量為60%的情況下，紅芝和黃孢原毛平革菌對于小麥秸和稻草的木質(zhì)素降解率最高，與65%和70%的含水量相比，差異顯著（P＜0.05）。因此確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適含水量為60%。

表1 培養(yǎng)基含水量對秸稈降解效果的影響（%）

3.2 溫度對秸稈降解效果的影響

試驗(yàn)測試了不同溫度條件下對麥秸和稻草降解效果的影響，詳見表2。

表2 溫度對秸稈降解效果的影響（℃）

由表2看出，溫度對于木質(zhì)素降解率差異極顯著（P＜0.01），在30℃下，秸稈的木質(zhì)素降解率最高，與其他溫度相比差異顯著（P＜0.05），試驗(yàn)表明，溫度高低影響固體發(fā)酵的進(jìn)度和秸稈木質(zhì)素的降解率。溫度過高，發(fā)酵基中自腐真菌生長受到抑制，會降低秸稈木質(zhì)素的降解率；溫度過低，則會導(dǎo)致固體發(fā)酵的進(jìn)度減緩。因此確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適發(fā)酵溫度為30℃。

3.3 接種量對秸稈降解效果的影響

試驗(yàn)測試了不同接種量麥秸和稻草降解效果的影響，詳見表3。

表3 接種量對于秸稈降解的影響（g/kg）

由表3得知，菌種接種量在0.25g/kg時，秸稈木質(zhì)素降解率最高，當(dāng)接種量有0.125g/kg增加到0.25g/kg時，降解率顯著升高，當(dāng)接種量從0.25g/kg升高到0.5g/kg時，木質(zhì)素降解率開始下降。在接種量較低時，菌絲在發(fā)酵基質(zhì)上的生長點(diǎn)太少，對培養(yǎng)基中營養(yǎng)利用不夠充分，菌種生長不好；當(dāng)接種量超過一定量時，生長初期菌絲大量生長，需消耗大量營養(yǎng)，發(fā)酵基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)大部分用于菌絲生長，而產(chǎn)酶階段所需的營養(yǎng)物質(zhì)利用受到限制。因此，接種量選擇0.25g/kg較為合適。

3.4 pH對秸稈降解效果的影響

試驗(yàn)測試了不同pH對麥稈和稻草降解效果的影響，詳見表4。

試驗(yàn)結(jié)果表明，pH在4.0的時候，秸稈木質(zhì)素降解率最高。隨著pH的增高，木質(zhì)素的降解率減少。紅芝和黃孢原毛平革菌適宜在微酸性環(huán)境內(nèi)生長，其可在發(fā)酵早期產(chǎn)生有機(jī)酸，自腐真菌有較寬的初始pH范圍。從圖中可知，選擇pH4.0最適合，木質(zhì)素的降解率達(dá)到最高。

4 討論

齊剛報(bào)道培養(yǎng)基初水分達(dá)到60%時，木質(zhì)素降解率最高[5]。水分含量的增加有利于菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，并且提高了酶的活性。水分含量過大時，嚴(yán)重降低了菌體對氧氣的吸收和二氧化碳的排出，而且不利于發(fā)酵散發(fā)熱量，引起蛋白質(zhì)含量的減少。白腐真菌固體發(fā)酵秸稈時，水分含量過低會使菌絲的生長受到抑制，而水分過高又會影響氧氣通入、產(chǎn)生的二氧化碳排出以及熱量的散失，對菌絲的生長不利。本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，固體發(fā)酵秸稈的水分應(yīng)控制在60%左右，以利于菌絲生長。

選擇適宜的溫度和酸度也會對木質(zhì)素有影響，不同pH值會影響生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的排泄，本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，固體發(fā)酵秸稈的溫度應(yīng)控制在30℃左右，有利于菌絲生長。紅芝發(fā)酵稻草的木質(zhì)素降解率達(dá)到26.52%，發(fā)酵麥秸的木質(zhì)素降解率達(dá)到35.45%，黃孢原毛平革菌發(fā)酵稻草的木質(zhì)素降解率達(dá)到28.19%，發(fā)酵麥秸的木質(zhì)素降解率達(dá)到23.60%。大多數(shù)白腐真菌適宜生長在微酸性環(huán)境內(nèi)，pH值在4.0～5.0之間。在pH為5.0時，最有利于白腐真菌漆酶的分泌。本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，固體發(fā)酵秸稈的pH應(yīng)控制在5.0左右，以利于菌絲生長。

菌種接種量過高，會因菌體生長過快而產(chǎn)生過多的代謝廢物，抑制白腐真菌的生長；接種量過低，菌體生長緩慢，培養(yǎng)時間長，使發(fā)酵時間延長[6]。本試驗(yàn)選擇白腐真菌發(fā)酵7天，接種量為0.25 g/kg秸稈，木質(zhì)素降解率最高，紅芝發(fā)酵稻草的木質(zhì)素降解率達(dá)到36.64%；發(fā)酵麥秸的木質(zhì)素降解率達(dá)到34.74%，黃孢原毛平革菌發(fā)酵稻草的木質(zhì)素降解率達(dá)到40.78%，發(fā)酵麥秸的木質(zhì)素降解率達(dá)到37.76%。

通過單因素分析，得到以下結(jié)論：在秸稈降解過程中，秸稈的含水量、溫度、菌種接種量、酸度的不同對白腐真菌的生長和秸稈木質(zhì)素、纖維素的降解均有影響，秸稈的含水量為60%，溫度在30℃，接種量為0.25g/ kg秸稈，酸度控制在pH為4.0的條件下發(fā)酵7天的效果比較顯著。

[1] 饒輝.國內(nèi)外秸稈類微生物發(fā)酵飼料的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：159-161.

[2] 魏志文，趙士豪，李寶庫.多菌株發(fā)酵秸稈飼料研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（32）：14108-14110.

[3] 費(fèi)尚芬，鹿寧，劉坤，等.白腐菌纖維素酶高酶活菌株的篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（1）：22-23.

[4] 張力，楊孝列.動物營養(yǎng)與飼料（第2版）[M].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2012.

[5] 趙華，齊剛，代彥.酒糟和秸稈混合發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究[J].糧食與飼料工業(yè)，2004，（8）：36-37.

[6] 唐媛，謝冰，呂寶一，等.白腐真菌處理難降解有機(jī)物的培養(yǎng)條件及應(yīng)用研究[J].世界科技研究與發(fā)展，2008，30（1）：60-65.

表4 pH對秸稈降解的影響

劉海霞（1974-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)椴菔硠游锷a(chǎn)。

江蘇省泰州市農(nóng)業(yè)支撐項(xiàng)目（TN201518），江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201612806004Y），江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院項(xiàng)目（NSFPT201506）