楊 艷，韋 余，王玉和#，鄢乾燕（.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 563003；.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義 563003）

黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化及化學(xué)成分分析Δ

楊 艷1＊，韋 余1，王玉和1#，鄢乾燕2（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義 563003）

目的：優(yōu)化黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油的提取工藝并分析其化學(xué)成分。方法：采用水蒸氣蒸餾法（HD）提取黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油。以揮發(fā)油提取率為考察指標(biāo)，以浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、料液比（g/ml）、粉碎程度為考察因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)；同時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，并以面積歸一化法測(cè)定各成分的相對(duì)百分含量。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為浸泡時(shí)間3 h、提取時(shí)間5 h、料液比1∶10、粉碎程度12目；驗(yàn)證試驗(yàn)中揮發(fā)油平均提取率為59.83%（RSD＝0.905 3%，n＝3）。共鑒定出78種化合物，相對(duì)百分含量為81.125%；其中γ-欖香烯（11.858%）、4-乙烯基-α，4-三甲基-3蒟（1-甲基乙烯基）-環(huán)己烷甲醇（8.701%）、石竹（8.443%）、α-石竹烯（6.216%）等4種化合物為主要成分。結(jié)論：優(yōu)化的HD法生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低廉、重現(xiàn)性好；揮發(fā)油成分分析方法簡(jiǎn)單、可行，可對(duì)黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分析。

黔產(chǎn)毛蒟；揮發(fā)油；水蒸氣蒸餾法；氣相色譜-質(zhì)譜法；成分

黔產(chǎn)毛蒟（Piper puberulum）系胡椒科胡椒屬植物，胡椒屬植物具有芳香辛辣味，普遍含有揮發(fā)油。黔產(chǎn)毛蒟為多年生攀援藤本，全株有濃烈香氣，常常生長(zhǎng)在密林、疏林中、溝邊陰濕處，主要分布于我國(guó)的四川、貴州、廣西、廣東等地。黔產(chǎn)毛蒟在貴州民間俗稱“侗靈草”，主要用于風(fēng)濕性痹痛、胃脘痛、疝氣、痛經(jīng)、跌打損傷的治療，在貴州民間用于治療肩周炎與急、慢性肝損傷，效果良好[1]。揮發(fā)油的常見(jiàn)提取方法有水蒸氣蒸餾（HD）法、浸取法（油脂吸收法、溶劑提取法、超臨界流體萃取法）、壓榨法等[2]。其中，HD法是提取揮發(fā)油的常見(jiàn)方法。目前，黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油的提取工藝條件優(yōu)化及其化學(xué)成分的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，在本研究中筆者對(duì)黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油的HD提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）對(duì)其主要成分進(jìn)行定量考察[3-6]，旨在為黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

RT-TW控溫電熱套（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司）；PL602-S電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)2桿子箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Agilent 6890-5973N GC-MS/MS儀（美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 藥材與試劑

黔產(chǎn)毛蒟于2009年采割自貴州省黔東南州，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科楊建文副主任藥師鑒定為毛蒟；無(wú)水硫酸鈉（重慶北碚精細(xì)化工廠）、乙醚（成都市科龍化工試劑廠）均為分析純；水為去蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備工藝

稱取經(jīng)粉碎的黔產(chǎn)毛蒟藥材適量，置于圓底燒瓶中，加按一定料液比（藥材質(zhì)量/去離子水體積，g/ml）加入去離子水和沸石若干，搖勻，浸泡一定的時(shí)間。連接好揮發(fā)油提取器及球形冷凝管，從冷凝管的上端加水至揮發(fā)油提取器中，直至充滿蒸餾水并幾乎溢流到圓底燒瓶為止。打開(kāi)控溫電熱套進(jìn)行加熱，加熱至第1滴液滴從冷凝管管口滴下時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，并始終保持微沸。微沸一定時(shí)間后停止加熱，放置片刻，開(kāi)啟揮發(fā)油提取器下端的活塞，將水緩緩加入到油層下端至0刻度線上5 mm處，再放置一段時(shí)間，繼續(xù)放水使油層下降到下端與0刻度線平行，準(zhǔn)確讀取揮發(fā)油的體積。收集該揮發(fā)油，用無(wú)水硫酸鈉脫水，置于－18℃冰箱中保存，備用。計(jì)算揮發(fā)油的提取率[7]，揮發(fā)油提取率（%）＝毛蒟揮發(fā)油體積（ml）/毛蒟質(zhì)量（g）×100%。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 浸泡時(shí)間 精密稱取過(guò)20目篩的黔產(chǎn)毛蒟粉末200.00 g，共5份，分別置于圓底燒瓶中，按料液比1∶7.5加入蒸餾水，分別浸泡0、1、2、3、4 h，提取6 h，讀取并計(jì)算揮發(fā)油提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1A。

圖1 單因素考察結(jié)果Fig 1 Results of single factor test

由圖1A可知，浸泡0～2 h時(shí)，揮發(fā)油提取率與浸泡時(shí)間呈正比，而在2 h后則成反比，浸泡3 h的提取率比未浸泡時(shí)高。因此，選擇浸泡時(shí)間1、2、3 h作為正交試驗(yàn)考察的水平。

2.2.2 提取時(shí)間 精密稱取過(guò)20目篩的黔產(chǎn)毛蒟粉末200.00 g，共5份，分別置于圓底燒瓶中，按料液比1∶7.5加入蒸餾水，搖勻浸泡2 h，分別提取3、4、5、6、7、8 h，讀取并計(jì)算揮發(fā)油提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1B。

由圖1B可知，揮發(fā)油提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，但是在5～7 h之間的增幅最大，而7 h以后增幅逐漸減小?？赡苁请S著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，毛蒟藥材中的揮發(fā)性成分逐漸減少導(dǎo)致的。因此，選擇提取時(shí)間5、6、7 h作為正交試驗(yàn)考察的水平。

2.2.3 料液比 精密稱取過(guò)20目篩的黔產(chǎn)毛蒟粉末200.00 g，共5份，分別置于圓底燒瓶中，按料液比（g/ml）分別為1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12.5、1∶15加入蒸餾水，搖勻浸泡2 h，提取6 h，讀取并計(jì)算揮發(fā)油提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1C。

由圖1C可知，隨著料液比的減小，揮發(fā)油提取率逐漸增加，但料液比在1∶12.5、1∶15之間增長(zhǎng)較緩慢。原因在于蒸餾水的量過(guò)少會(huì)出現(xiàn)焦糊現(xiàn)象；加水量過(guò)多易出現(xiàn)暴沸，蒸汽量大，溢出液會(huì)帶走部分揮發(fā)油。因此，選擇料液比1∶10、1∶12.5、1∶15作為正交試驗(yàn)考察的水平。

2.2.4 粉碎程度 精密稱取過(guò)12、14、16、18、20目篩的黔產(chǎn)毛蒟粉末200.00 g，共5份，分別置于圓底燒瓶中，按料液比1∶12.5加入蒸餾水，搖勻浸泡2 h，提取6 h，讀取并計(jì)算揮發(fā)油提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1D。

由圖1D可知，粉碎程度為12～14目時(shí)，揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨后則逐漸下降。這可能是由于隨著粉碎程度降低，藥材擴(kuò)散速度增加，有利于揮發(fā)油的提??；但是粉末過(guò)細(xì)，不利于蒸餾水的穿流，產(chǎn)生很多泡沫，增強(qiáng)了其對(duì)揮發(fā)油的吸附作用，不利于揮發(fā)油的溢出，最終導(dǎo)致?lián)]發(fā)油提取率下降。因此，選擇過(guò)12、14、16目篩的粉末作為正交試驗(yàn)考察的水平。

2.3 正交試驗(yàn)[8]

通過(guò)單因素試驗(yàn)，以揮發(fā)油提取率為考察指標(biāo)，以浸泡時(shí)間（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、粉碎程度（D）4個(gè)因素作為考察因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。因素與水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

由表2、表3可知，A對(duì)揮發(fā)油提取率影響顯著（P＜0.05），B、C、D影響不顯著（P＞0.05）。而結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)的可行性、最大限度降低生產(chǎn)成本考慮，確定黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油提取的最優(yōu)條件為A3B1C1D1，即浸泡時(shí)間3 h，提取時(shí)間5 h，料液比1∶10，粉碎程度12目。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按最優(yōu)工藝提取3次并計(jì)算揮發(fā)油提取率，結(jié)果，3次試驗(yàn)的揮發(fā)油提取率分別為60.50%、60.00%、59.00%，平均為59.83%（RSD＝0.905 3%，n＝3），表明該方法可用于黔產(chǎn)毛蒟中揮發(fā)油的提取。

2.5 黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油化學(xué)成分分析[9-11]

2.5.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS（30.0 m×250 μm，0.25 μm）；進(jìn)樣量：2.0 μl；以分流模式進(jìn)樣，分流比：50∶1；分流流量：50.0 ml/min；色譜柱流量：1.0 ml/min；升溫程序：初始溫度為50℃、保持2 min，以5℃/min升溫至70℃、保持5 min，以8℃/min升溫至120℃、保持3 min，以0.7℃/min升溫至135℃、保持2 min，以0.8℃/min升溫至145℃后，以8℃/min升溫至250℃、保持1 min。

2.5.2 質(zhì)譜條件 輔助通道-2；溫度：230℃；前進(jìn)樣口溫度：260℃；電噴霧離子源溫度：230℃；四極桿溫度150℃；數(shù)據(jù)傳輸速率：20 Hz；溶劑延遲4 min；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～500。按上述條件對(duì)揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，用峰面積歸一化法得各組成成分相對(duì)百分含量，總離子色譜圖見(jiàn)圖2，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

圖2 總離子流圖Fig 2 Total ion chromatogram

表4 黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油化學(xué)成分測(cè)定結(jié)果Tab 4 Determination results of chemical compositions of volatile oil from Guizhou P.puberulum

續(xù)表4Continued Table 4

由表4可知，采用HD法提取的揮發(fā)油共鑒定出78個(gè)成分（相對(duì)百分含量為81.125%），其中，γ-欖香烯（11.858%）、4-乙烯基-α，4-三甲基-3-（1-甲基乙烯基）-環(huán)己烷甲醇（8.701%）、石竹（8.443%）、α-石竹烯（6.216%）等4種主要化合物是主要成分。吳慶立等[12]報(bào)道的5種胡椒屬海風(fēng)藤中的海南樂(lè)東縣毛蒟揮發(fā)油的主要成分是反式-石竹烯（13.94%）和苯甲酸芐酯（9.13%），與黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油的主要成分相差很大，這可能是因?yàn)椴煌牡乩憝h(huán)境所致。

3 討論

經(jīng)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化了HD法提取黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油工藝，該工藝的生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低廉、重現(xiàn)性好。

在預(yù)試驗(yàn)的過(guò)程中，揮發(fā)油的顏色會(huì)隨著提取溫度的升高而發(fā)生變化，由乳白色變成淡黃綠色油滴，這可能是由于揮發(fā)油中的烯烴類(lèi)化合物會(huì)受外界的光線、溫度等因素的影響而發(fā)生氧化作用所致。這提示在提取過(guò)程中應(yīng)注意避光處理、儲(chǔ)藏過(guò)程中應(yīng)注意低溫保存。

此外，本次試驗(yàn)中的揮發(fā)油提取率不高的原因分析如下：（1）本次試驗(yàn)的提取采用加熱套加熱，最初的溫度高，有大量的蒸汽產(chǎn)生，遇冷凝管冷凝成液滴滴入揮發(fā)油提取器中，但有少部分會(huì)附著在冷凝管管壁上，這樣導(dǎo)致?lián)]發(fā)油的體積測(cè)定結(jié)果有誤差。（2）本試驗(yàn)中的藥材存放時(shí)間較久，藥材中的揮發(fā)性成分會(huì)受外界諸多因素的影響，從而導(dǎo)致主要成分的相對(duì)百分含量較低。當(dāng)然，揮發(fā)油中的成分隨提取工藝、藥材的情況不同會(huì)產(chǎn)生很大差異，因此其他工藝對(duì)揮發(fā)油中的成分研究還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，HD法提取黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油的最佳工藝是浸泡時(shí)間為3 h，提取時(shí)間為5 h，料液比為1∶10，粉碎程度為12目。利用GC-MS鑒定出78種化合物，已鑒定化合物的含量占檢出揮發(fā)油總量的81.125%。優(yōu)化的HD法生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低廉、重現(xiàn)性好；揮發(fā)油成分分析方法簡(jiǎn)單、可行，可對(duì)黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分析，可為進(jìn)一步研究黔產(chǎn)毛蒟提供依據(jù)。

[1] 楊艷，吳芹，龔其海，等.黔產(chǎn)毛蒟提取物的制備及其化學(xué)成分的定性分析[J].中國(guó)生化藥物雜志，2015，35（5）：169.

[2] 唐巖，孫繼澤，張紅巖，等.睡安膠囊揮發(fā)油的提取及包合工藝研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2016，18（5）：630.

[3] 曾瓊瑤，龔瑞瑩，楊海玲，等.GC-MS結(jié)合保留指數(shù)法分析云南產(chǎn)胡蘿卜籽揮發(fā)油成分[J].中成藥，2016，38（6）：1 311.

[4] 李勝南，任崇靜，李峰，等.蒙山蒼術(shù)不同采收時(shí)期揮發(fā)性成分的GC-MS分析和最佳采收期研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊，2016，18（4）：420.

[5] 賈智若，朱小勇，李兵，等.不同產(chǎn)地杜仲葉揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（19）：118.

[6] Xie Z，Liu Q，Liang Z.The GC/MS analysis of volatile components extracted by different methods from exocarpium citri grandis[J].J Anal Methods Chem，2013，doi：10. 1155/2013/918406.

[7] 李白存.柿葉精油的提取工藝研究[J].應(yīng)用化工，2012，41（11）：1 940.

[8] 袁曦，洪清，林功舟，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選鬼針草揮發(fā)油提取工藝[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31（9）：733.

[9] 王朋，李凌軍，宋基正，等.柴胡揮發(fā)油大孔樹(shù)脂富集工藝研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2016，18（1）：114.

[10] 周?chē)?guó)梁，張娜，劉漢珍，等.連翹揮發(fā)油納米膠束對(duì)其水溶性成分連翹苷體外透皮、透黏膜吸收的影響[J].中藥材，2016，39（1）：134.

[11] 吳懷恩，梁臣艷，李耀華，等.不同方法提取大頭陳揮發(fā)油的氣質(zhì)聯(lián)用成分分析[J].藥物分析雜志，2010，30（10）：1 941.

[12] 吳慶立，馮毓秀.五種胡椒屬來(lái)源的海風(fēng)藤揮發(fā)油成分的比較研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，1994，6（3）：9.

Optimization of the Extraction Technology of Volatile Oil from Guizhou Piper puberulum and Analysis of Its Chemical Compositions

YANG Yan1，WEI Yu1，WANG Yuhe1，YAN Qianyan2（1.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China；2.School of Pharmacy，Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of volatile oil from Guizhou Piper puberulum and analyze its chemical compositions.METHODS：The volatile oil was extracted from Guizhou P.puberulum by steam distillation（HD method）. Orthogonal test was designed using the extract rate of volatile oil as index，with soaking time，extraction time，material-liquid ratio（g/ml）and smashed particle size as factors.Validation test was also conducted.GC-MS was adopted to separate and identify the chemical compositions of the volatile oil from Guizhou P.puberulum，and area normalization method was used for the determination of relative percentage of each composition.RESULTS：The optimal extraction technology was as follows as soaking time of 3 h，extraction time of 5 h，material-liquid ratio of 1∶10 and degree of grinding 12 meshes；in validation test，average extract rate of volatile oil was 59.83%（RSD＝0.905 3%，n＝3）.78 compounds were identified，and relative percentage was 81.125%；there were four main compositions such as γ-elemene（11.858%），4-vinyl-α，4-trimethyl-3-（1-methylvinyl）-cyclohexane methanol（8.701%），carnation（8.443%）and α-caryophyllene（6.216%）.CONCLUSIONS：Optimized HD method is simple in production equipment，low in production cost，good in repeatability；determination method of validation oil is simple and feasible，and can analyze chemical compositions of volatile oil from Guizhou P.puberulum.

Guizhou Piper puberulum；Volatile oil；Steam distillation method；GC-MS；Compositions

R238

A

1001-0408（2016）31-4421-04

2016-05-26

2016-09-07）

（編輯：劉明偉）

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（No.黔科合J字LKZ〔2012〕19號(hào)）

＊副教授，碩士。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0851-28608517。E-mail：1012950284@qq.com

#通信作者：教授。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0851-28608497。E-mail：1149076068@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.30